一种抑制剂ly294002的用图
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物领域，具体是一种抑制剂LY294002的用途。
【背景技术】
[0002]布鲁氏菌病是一种严重危害公共卫生安全的人兽共患传染病。布鲁氏菌既是一种革兰氏阴性菌，也是兼性胞内寄生菌。布鲁氏菌病急性期的症状主要为恶寒、发热和关节等；人感染布鲁氏菌后主要表现出神经-精神症状，一般病程较长，容易复发反复感染。动物布鲁氏菌病后导致胎膜及其它多种器官组织发炎、坏死和肉芽肿的形成，导致怀孕母畜流产、公畜患睾丸炎及关节炎等症状。布鲁氏菌病严重危害人类健康和畜牧业的发展。然而，目前无有效的疫苗控制该病的发生，主要原因之一为其致病机制还不清楚。
[0003]PI3K/Akt信号通路细胞生存对细胞的生存至关重要，在细胞生长活动和抑制细胞凋亡方面起核心作用。PI3K/Akt信号通路主要与肿瘤的发展密切相关，还与一些病毒的生存繁殖有关，然而，PI3K/Akt信号通路与布鲁氏菌的生存关系如何，目前还尚无相关报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种抑制剂LY294002的用途，以解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0005]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案:
一种抑制剂LY294002的用途，用于抑制羊种布鲁氏菌16M的存活。
[0006]作为本发明进一步的方案:所述抑制剂LY294002的最佳剂量为20 μ mol/L。
[0007]与现有技术相比，本发明的有益效果是:本发明将PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002与细胞共同孵育，同时将其腹腔注射小鼠，然后羊种布鲁氏菌16M感染巨噬细胞和小鼠，首次发现抑制剂LY294002可调控巨噬细胞和小鼠体内羊种布鲁氏菌16M的存活，抑制剂LY294002显著提高了布鲁氏菌介导的TNF- α，提高宿主抵抗羊种布鲁氏菌16Μ感染的能力。表明PI3K/Akt信号通路在布鲁氏菌致病过程中发挥重要作用，PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002可调控巨噬细胞和小鼠体内羊种布鲁氏菌16M的存活，为抗布鲁氏菌药物研发和其致病机制提供科学依据。
【附图说明】
[0008]图1是抑制剂LY294002对细胞活性的影响结果示意图；
图2是抑制剂LY294002抑制16M在巨噬细胞内的繁殖结果示意图，注:“*”表示胞内细菌数量在16M组与16M+LY组中的差异显著(P〈0.05)；
图3是抑制剂LY294002降低16M在小鼠脾脏和肝脏的存活结果示意图，注:“*”表示脾脏和肝脏中细菌数量在16M组与16M+LY组中的差异显著(P〈0.05)；
图4是抑制剂LY294002提高16M介导的巨噬细胞中TNF-α的含量结果示意图，注: 表示TNF-α含量在16Μ组与16M+LY组中的差异显著(Ρ〈0.05)。
【具体实施方式】
[0009]下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0010]实施例1 I材料与方法 1.1材料
1.1.1菌株、细胞与质粒
羊种布鲁氏菌16M来自石河子大学人畜共患病实验室、大肠杆菌DH5a来自铜仁学院细胞生物学实验室。
[0011]1.1.2主要试剂
胎牛血清购自海克隆公司；酵母提取物、蛋白胨、NaCl购自上海生工公司JritonX-100细胞裂解液、MTT和DMSO购自索莱宝公司；抑制剂LY294002购自碧云天公司；小鼠TNF- a ELISA试剂盒均购自上海依科赛生物制品有限公司。
[0012]1.1.3主要仪器
生物安全柜；C02培养箱；低温高速离心机；酶标检测仪，电子天平。
[0013]1.2 方法
1.2.1 MTT 试验
将抑制剂LY294002 (20 μπιοΙ/L)与巨噬细胞共同孵育，0.1%DMS0处理的细胞作对照。置37°C、5%C02培养箱使细胞贴壁，培养6-24h。加入适当浓度的受试化合物，继续培养适当时间。小心吸取上清，加入90 μ L新鲜培养液，再加入1yL MTT溶液，继续培养4h。弃去上清，每孔加入110 μ L Formazan溶解液，置摇床上低速振荡lOmin，使结晶充分溶解，在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。同时设置调零孔，对照孔，每组设定3复孔。
[0014]1.2.2布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7
抑制剂?Υ294002(20 μπιΟ1/υ与巨噬细胞作用lh，16Μ侵染巨噬细胞，细菌:细胞按50:1的个数比进行侵染细胞，并将侵染的RAW264.7细胞继续置于37°C、5%C02培养箱中分别培养4h、12h和24h。用Triton X-1OO细胞裂解液裂解细胞，梯度稀释裂解混合液，将其涂于固体培养基板，然后将其放入5%C02培养箱2-3d，对其菌落个数进行统计。实验重复三次。
[0015]1.2.3小鼠感染羊种布鲁氏菌16M
对布鲁氏菌固体培养基上分别挑取羊种布鲁氏菌16M的单个菌落于液体培养基中培养，收集菌液，将菌液稀释成1.0X 106CFU/0.2mL，空白对照组每只注射0.2mLPBS，每组10只小鼠。先给小鼠腹腔注射抑制剂LY294002(20mg/kg/day)，5d后感染16M。在感染的第5d将小鼠处死，取脾脏，用组织匀浆器碾碎脾脏，然后加入2mL的PBS制成匀浆混合液，取混合液100 μ L进行10倍梯度稀释，取合适稀释度的混合液各80 μ L涂布无抗板，置于37°C恒温培养箱，3-4d，记录平皿中细菌的数量。实验重复三次。
[0016]1.2.4 ELISA检测细胞因子小鼠ELISA检测标准曲线的制作见操作步骤。抑制剂LY294002(20 ymol/L)与巨噬细胞作用lh，16M侵染巨噬细胞，将细菌:细胞按50:1的比例进行感染细胞，并将感染的细胞继续置于37°C、5%C02培养箱中分别培养12h和24h。仅用16M感染的细胞作为对照组。在12h和24h收集细胞培养液上清，进行TNF- α的ELISA检测。实验重复三次。
[0017]1.2.5统计学分析
使用SPSS17.0验数据统计软件对实验数据进行统计学分析。
[0018]2结果与分析
2.1抑制剂LY294002对巨噬细胞活性的影响
抑制剂LY294002和DMSO分别与巨噬细胞作用48h，MTT法检测结果:当抑制剂LY294002的浓度为20 μ mol/L不影响细胞的活性(图1)。对照组加DMSO不影响细胞的活性。加DMSO后的细胞形态为小圆球形，与正常细胞形态相同，加入抑制剂LY294002的浓度为20 μ mol/L时细胞形态也为小圆球型，与正常细胞形态相同。结果表明，本研宄发现采用抑制剂LY294002的浓度20 μ mol/L不影