具有卵巢早衰及围绝经期综合征治疗作用的间充质干细胞及其细胞因子制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药技术领域，涉及间充质干细胞在再生医学领域的转化应用， 具体涉及具有卵巢早衰及围绝经期综合征治疗作用的间充质干细胞及其细胞因子制剂及 其制备方法。
【背景技术】
[0002] 卵巢早衰，是指已建立规律月经的妇女，40岁以前，由于卵巢功能衰退而出现持 续性闭经和性器官萎缩，常有促性腺激素水平的上升和雌激素的下降，40岁前卵巢早衰的 发病率约为1%~3%，而30岁内的发病率约为0.1%。临床表现伴有不同程度的潮热多汗、 失眠多梦、烦躁易怒、心悸、疲乏、情绪紧张、阴道干涩、性功能低下、不孕不育、提前闭经等 绝经前后症状，使患者未老先衰，如果得不到及时的调整和治疗，可导致骨质疏松、心脑血 管疾病等慢性病的出现，直接影响女性生活质量，严重影响女性的正常工作，同时给其身心 健康和夫妻生活带来极大痛苦。
[0003] 围绝经期综合征出现的根本的原因是由于生理性或病理性或手术而引起的卵巢 功能衰竭。卵巢功能一旦衰竭或被切除和破坏，卵巢分泌的雌激素就会减少。女性全身有 多种雌激素受体，分布在几乎女性全身所有的组织和器官，接受雌激素的控制和支配，一旦 雌激素减少，就会引发器官和组织的退行性变化，出现一系列的症状。由此可见，卵巢早衰 会引发围绝经期综合征，治疗卵巢早衰可以同时有利于治疗围绝经期综合征。卵巢早衰，其 病因迄今尚不清楚，所以对该病的研宄已成为国内外生殖发育界的热点和难点。目前，国内 外研宄多认为卵巢早衰与遗传、免疫、代谢以及医源性等因素有关。已有研宄资料显示染色 体突变，促卵泡生成素（FSH)促黄体生成素（LH)及其受体变异，代谢异常，药物作用， 放化疗损伤，病毒感染，免疫性以及其他高危因素如吸烟、抑郁等因素可能是其原因，这些 因素或使卵巢先天性卵细胞数目减少，或使其卵泡闭锁加速，或被直接破坏，使卵泡过早衰 竭，对于卵巢早衰的治疗现代医学一般采用激素替代治疗法。但卵巢早衰治疗比较困难，西 医临床上采用激素替代疗法，需要在大夫的指导下使用雌孕激素；研宄表明该雌激素和孕 激素治疗的时候，有一定的作用，可以改善症状，但对卵巢功能的恢复并不理想，同时停药 之后症状重新出现，使卵巢处于依赖状态，有导致卵巢功能更差的可能，也就是说激素替代 疗法仅仅起到了治标的作用，而且这种方法副作用大，长期使用外源性激素有导致子宫内 膜癌变的危险，并增加冠心病以及胆囊病的发病率。因此，该激素治疗的效果不理想，同时 存在安全隐患。
[0004] 近年来，随着基因治疗和干细胞技术的发展，采用干细胞技术来代替激素的疗法 愈来愈被关注；目前，存在有采用静脉回输间充质干细胞/细胞因子，或采用经腹部有创 介入腹腔镜下卵巢原位注射间充质干细胞/细胞因子的方法治疗卵巢早衰，取得一定的疗 效，但是该疗效不是很理想，有效率低，具体表现在： 首先，静脉回输间充质干细胞容易粘附成团，未经过滤输入易造成肺静脉栓塞，表现为 呼吸急促、紫绀、躁动和惊厥等，也有造成心脑血管卒中偏瘫的案例； 其次，虽然间充质干细胞是低免疫原性，不表达或低表达II类抗原，但多次静脉输入 间充质干细胞，仍有一定比例产生白细胞抗体，与输入细胞的量/次成正比，抗原抗体反应 可导致低热、疲乏、呼吸窘迫等反应，静脉输入细胞或因子，归巢的量有限，也一定程度影响 了疗效。
[0005] 介入疗法一般要在腹部开口，腹腔镜下介入导管到血管或病变局部，一次性介入 疗效有限，多次介入反复给患者带来医源性创伤，不能接受，不易普及。
[0006] 因此，到目前为止，还没有确切有效的方法能恢复卵巢的功能，所以卵巢早衰病因 复杂、治疗难度较大，现代医学迄今尚未取得突破进展。
【发明内容】
[0007] 本发明的一个目的是提供一种具有卵巢早衰及围绝经期综合征治疗作用的间充 质干细胞及其细胞因子制剂，解决了目前的卵巢早衰和围绝经期综合征治疗用药物吸收率 低、疗效有限及使用时造成的创伤大的问题。
[0008] 本发明的另一个目的是提供上述具有卵巢早衰及围绝经期综合征治疗作用的间 充质干细胞及其细胞因子制剂的制备方法。
[0009] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是： 一种具有卵巢早衰及围绝经期综合征治疗作用的间充质干细胞及其细胞因子制剂，是 由脐带或胎盘间充质干细胞及其细胞因子和用于承载所述脐带或胎盘间充质干细胞及其 细胞因子的透明质酸盐组成的混悬液；该透明质酸盐无免疫原性，广泛存在于人体结缔组 织中，有一定的抗炎作用和药物缓释作用，无细胞毒性； 所述脐带或胎盘间充质干细胞及其细胞因子与透明质酸盐的体积比为1:1~3 ; 所述脐带或胎盘间充质干细胞的终浓度为〇. 5X 107~5X 107个/ml，所述透明质酸盐的 终浓度为〇. 〇1~〇. 1%。
[0010] 在上述技术方案中，所述透明质酸盐的分子量为30~300万道尔顿。
[0011] 在上述技术方案中，所述脐带或胎盘间充质干细胞及其细胞因子是人的传代培养 8代以内的异体脐带或胎盘间充质干细胞及其细胞因子；更优选的是，所述间充质干细胞 及其细胞因子是来源于检测合格的健康产妇的胎盘或新生儿的脐带，将所述胎盘或脐带经 组织培养法培养获得原代间充质干细胞，再将原代间充质干细胞无血清培养至8代以内， 收集间充质干细胞及其细胞因子，冻存待用；其中，采用胎盘或脐带作为间充质干细胞及其 细胞因子的来源，是因脐带的增殖能力更强，胎盘分泌细胞因子的能力更强。
[0012] 上述具有卵巢早衰及围绝经期综合征治疗作用的间充质干细胞及其细胞因子制 剂，包括： 制备脐带或胎盘间充质干细胞及其细胞因子； 将所述脐带或胎盘间充质干细胞及其细胞因子与透明质酸盐按照所述比例混匀，制 得；所述脐带或胎盘间充质干细胞的终浓度为〇.5X107~5X107个/ml，所述透明质酸盐的 终浓度为〇. 〇1~〇. 1%。
[0013] 在上述技术方案中，所述脐带或胎盘间充质干细胞的制备方法为： 脐带来源的间充质干细胞的制备：取志愿、健康合格、产后24~72小时的冷藏新生儿脐 带，浸泡消毒后，剪切成3~4cm的小段，用止血钳去除每段脐带中的血管(一根静脉两根动 脉)，将脐带组织块与组织皮面分离，浸泡清洗后，将脐带组织块煎成3~4_3的块状，浸泡清 洗，2000rpm离心3min，弃上清，将得到的脐带组织按0. 5g/瓶的质量浓度接种到T175培养 瓶中，再在培养瓶中加入DMEM培养基和10%胎牛血清，摇匀，于37 °C、5%0)2培养箱中培养， 培养至第5天和第8天时分别换培养液，2周后，当细胞融合度达到40~80%时，加入胰酶首 次消化传代，换用无血清培养基，收集第3~8代间充质干细胞，冻存备用。
[0014] 胎盘来源的间充质干细胞的制备：取志愿、健康合格、产后24~72小时的冷藏胎 盘，用止血钳剥离覆盖在胎盘绒毛板表面的羊膜组织后，再用精细剪从胎盘上剪取足量的 胎盘绒毛膜组织块，清洗后，用组织镊剔除上述胎盘绒毛膜组织块上的血管组织和滋养层 组织，再次清洗后，用弯窄头精细剪将剔除后的胎盘绒毛膜组织块煎成3~5_ 3大小的组织 块，2000rpm离心5min，弃上清，将得到的胎盘绒毛膜组织按lg/瓶的质量浓度接种到T175 培养瓶中，再在培养瓶中加入DMEM培养基和10%胎牛血清，摇匀，于37°0、5%〇) 2培养箱中 培养，5天后首次换液，2周后，当细胞融合度达到40%~80%时传代，换用无血清培养基，收集 3~8代间充质干细胞，冻存备用。
[0015] 在上述技术方案中，所述脐带或胎盘间充质干细胞的细胞因子的制备方法为： 将脐带或胎盘间充质干细胞传至第3~8代后，加入胰酶消化再次传代，待细胞融合度 到达60%~70%时，采用1%~10%02低氧培养，或者换培养液撤去胎牛血清饥饿培养，72小时后 收集培养基上清，限外过滤除去小分子物质后，冻存待用。
[0016] 在上述技术方案中，所述间充质干细胞及其细胞因子制剂为用于局部靶向注射的 间充质干细胞及其细胞因子制剂；在本发明的技术方案中，该间充质干细胞及其细胞因子 制剂的使用方法为局部靶向注射； 在上述