一种治疗骨关节炎的细胞制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于组织工程学细胞治疗领域，具体涉及一种治疗骨关节炎的细胞制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]由于年龄增长、超重、免疫系统异常、关节不稳、外伤等原因所导致的关节炎已经成为影响人们正常工作生活甚至致残的重要原因。数据显示，在30岁以上的人群中，骨性关节炎的患病率超过6%，且随着年龄的增长该比例逐渐提高。据估计，中国的骨关节炎患者超过I亿人。
[0003]目前针对关节炎主要的治疗目标是:1，减轻疼痛、肿胀；2、改善肌肉力量、关节营养、血液循环、关节润滑；3、延缓关节软骨退变、保留关节功能或生活质量。
[0004]传统的治疗方法包括保守治疗和关节置换。保守治疗通常包括理疗、药物治疗等，可以短期缓解症状，但是治标不治本，并未实现损伤区域的修复，长期效果不佳，病情容易反复。
[0005]关节置换是用人工制造的关节代替疼痛且丧失关节功能的关节的方法，一般应用于较为严重的骨坏死、粉碎性骨折脱位不能复位者、疼痛及活动障碍的骨关节病、僵直或活动困难的类风湿性关节炎以及骨肿瘤等。关节置换存在假体松动、磨损或折断、深部感染、异物反应以及妨碍活动的软组织钙化等并发症。
[0006]随着组织工程与再生医学领域的发展，关于组织修复与再生的研宄也逐渐增多。间充质干细胞广泛存在于骨髓、脂肪、肝脏、外周血、脐带、脐血等组织中，具有高度自我更新能力及多向分化潜能，因而被广泛开发和应用。
[0007]专利号为ZL02815834.2的中国发明专利，公开了一种用于治疗关节软骨损伤、损害或缺陷的组合物。由从脐带血分离、增殖和/或分化而来的细胞组分、培养介质和生物相容性聚合物组成。
[0008]专利申请号为201010152461.2的中国发明专利申请，公开了一种用于治疗骨损伤的细胞注射剂及其制备方法，由自体骨髓来源的间充质干细胞和温敏型凝胶及自体血液分离提取的有效营养因子组成的复合物。
[0009]上述专利或专利申请文件中记载的复合的生物相容性聚合物或温敏凝胶植入体内后形成半固体或凝胶状，不利于间充质干细胞在关节腔内的分散，阻碍了通过干细胞的免疫调节功能来改善关节腔微环境的过程；在细胞的应用上，专利申请号为201010152461.2的申请文件中仅包含了间充质干细胞或软骨细胞单一的细胞类型，单纯应用间充质干细胞具有旁分泌、调节免疫功能，但是组织修复需要通过体内的诱导分化来实现，因此治疗所需时间较长；而单纯应用诱导后的间充质干细胞细胞进行治疗，仅具有组织修复功能，并不具备抗炎因子分泌功能，不利于关节炎的修复。
[0010]专利号为ZL201210410047.6的中国专利，公开了一种诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法及其在骨关节炎中的应用，该发明使用小球法诱导培养间充质干细胞分化为无支架软骨，使用时将该软骨消化制备成软骨细胞悬液进行关节内注射。该专利仍然存在使用单一诱导分化后间充质干细胞的问题，此外诱导过程所需时间长，形成的无支架软骨结构紧密，内部细胞容易出现凋亡。
[0011]综上所述，不难看出目前应用于关节炎治疗的细胞制剂细胞类型单一，不能充分发挥细胞的生物学性能，诱导分化方法效率较低。
【发明内容】
[0012]本发明的目的是克服现有关节炎治疗制剂或方法存在细胞制剂细胞类型单一、治疗时间长、不能充分发挥细胞的生物学性能，诱导分化效率较低等不利于关节炎的恢复的冋题。
[0013]为此，本发明提供了一种治疗骨关节炎的细胞制剂，该细胞制剂适用于骨关节炎疾病中炎症的缓解和受损组织的修复，实现患者症状的缓解和功能的恢复。
[0014]上述治疗骨关节炎的细胞制剂，由间充质干细胞、向软骨方向诱导分化的间充质干细胞、富含血小板血浆及分散介质组成。
[0015]上述间充质干细胞来源是骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、外周血间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、脐带间充质干细胞和脐带血间充质干细胞中的任一种。
[0016]上述细胞制剂的终细胞浓度为15?108/ml，其中，所述间充质干细胞与所述诱导分化后的间充质干细胞比例为0.25:1?4:1。
[0017]上述富含血小板血浆中血小板浓度在I?2 X 16/ μ I之间。
[0018]上述富含血小板血浆与分散介质的体积比在0.5:1?2:1。
[0019]上述分散介质是MEM、DMEM、D/F12、a -MDM、IMDM, BME、RPMI 1640 和 McCoy’s 5A培养基中的任一种。
[0020]同时，本发明提供了一种制备上述治疗骨关节炎的细胞制剂的方法，包括以下步骤:
步骤一、间充质干细胞的分离培养:分离间充质干细胞后，接种于细胞培养基中，于37°C、体积分数为0.05%的0)2培养箱中培养，隔天换液，待细胞铺满瓶底80%时，用0.25%胰酶消化传代；
选用的种子细胞包括各种来源的间充质干细胞，所述间充质干细胞是骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、外周血间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脐带血间充质干细胞中的任一种；
步骤二:间充质干细胞的诱导分化:
取传代至2?6代的上述间充质干细胞，培养于诱导分化培养基中，隔天换液，同时，对间充质干细胞进行10?40kpa，1Ηζ，2?6h/d的压应力刺激，通过细胞形态改变、酶表达、组织化学染色、组织免疫染色、分子生物学检验、生化含量分析，以确定所述间充质干细胞的分化；
所述的诱导分化培养基为高糖DMEM培养基，其中含有胎牛血清(FBS) I?20%、转化生长因子(TGF-β )1?40ng/mL、维生素C (Vc)15?100yg/mL、胰岛素3?20yg/ml、转铁蛋白2?30 μ g/ml、丙酬酸纳I?10mmol/L、地塞米松10 7?10 5mol/L、亚油酸2?30 μ g/mg、牛血清白蛋白0.5?10ng/ml ； 通过诱导分化培养基和压应力刺激共同作用进行间充质干细胞的诱导分化，以促进软骨相关基因的表达以及蛋白多糖的分泌，进而利于所述间充质干细胞向软骨方向的分化；步骤三:富含血小板血浆的制备:取加入抗凝剂的静脉血，离心法浓缩血小板，获取血小板浓度为I?2 X 16/ μ I的血楽；
步骤四:细胞制剂的制备
将间充质干细胞与诱导分化的间充质干细胞消化计数待用，将富含血小板血浆与分散介质以0.5:1?2:1的体积比混合，之后以此悬浮待用细胞，调整终细胞浓度为15?18/ml，其中间充质干细胞与诱导分化后的间充质干细胞比例为0.25:1?4:1 ;
上述分散介质是 MEM、DMEM、D/F12、a-MDM、MDM、BME、RPMI 1640 和 McCoy’s 5A 培养基中的任一种；
培养基可以为细胞的生存和繁殖提供基础营养，而富含血小板血浆中含有丰富的生长因子，这些生长因子在细胞增殖分化，组织修复再生中发挥重要作用，将细胞、富含血小板血浆及培养基三者复合，可有效发挥各自性能，实现关节炎的症状缓解与组织修复。
[0021]与现有产品及技术相比，本发明具有以下优点:
(I)将间充质干细胞与诱导分化后的间充质干细胞混合使用，既可以发挥间充质干细胞的免疫调节功能，改善关节腔微环境，利于炎症的缓解和损伤的修复；又能够使已分化的间充质干细胞在植入体内之后即开始组织修复过程，缩短修复进程。两种细胞混合使用可以最大程度发挥各自的生物学效用，促进组织的修复与再生。此外复合了富含血小板血浆成分，其多种生长因子和活性成分利于损伤组织的修复和