一种骨缺损再生修复组织工程骨及其构建方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于组织工程与再生医学医用生物材料技术领域，具体涉及一种具有生理性再生生物活性组织工程骨及其构建方法。该组织工程骨可用于骨缺损的再生修复。
【背景技术】
[0002]在目前的骨科治疗领域中，对各种创伤、感染、肿瘤切除以及某些先天性发育畸形等导致的四肢骨缺损、颅盖骨缺损仍然是骨科临床最常见、最棘手的一大难题。骨缺损的治疗方法主要包括骨移植、骨延长术、组织工程技术等。
[0003]组织工程骨的构建越来越多的被开发，其优势也越来越凸显，但不同的构建策略的效果存在很大的差异。其中，通过组织工程技术构建的骨移植材料通常包含一个或多个功能成分，即包括具有骨传导的基质材料，基质材料为新骨生长提供支架；具有骨诱导性的生物分子或化学药物形成具有再生潜能的微环境，诱导构建及修复过程中种子细胞分化为成骨细胞；筛选合适的种子细胞，在适当环境下快速生成新的骨组织。
[0004]( I)骨移植基质材料
天然骨材料加工处理的骨支架材料主要包括:①自体骨，其主要优点在于兼具骨传导性、骨诱导性和成骨作用；缺点主要体现在取骨区并发症(取骨区疼痛及其他潜在的切口感染、血肿、骨折等)、取骨量有限、出血量增加及手术时间延长等方面。②异体骨，异体骨移植物可提供骨传导支架，并保留大部分骨诱导蛋白成分，兼具骨传导及骨诱导能力，但免疫排异反应可使移植骨中供体来源的细胞被杀死，故缺乏成骨能力。此外，异体骨移植物应用的安全性一直备受关注，疾病传播仍是异体骨移植物应用的最大风险之一。③去矿物质骨基质(demineralized bone matrix，DBM)，又称为脱|丐骨基质，是由异体或自体骨组织经过不同的脱矿物工序处理后获得的骨移植材料，不仅能填充骨缺损，也有潜在的骨传导及骨诱导作用。DBM能促进血管再生，并诱导宿主干细胞分化为成骨细胞。据推测，DBM的生物活性与脱矿物处理后残存的基质蛋白及生长因子有关。
[0005](2)骨再生微环境
再生微环境主要是由生长因子形成的，在骨再生过程中发挥重要作用。生长因子是由特定细胞产生，在不同生理过程中发挥效用的一些多肽，其在骨组织修复过程中起着重要调控作用。胰岛素样生长因子(IGF-1)和转化生长因子(TGF-B)主要调节软骨基质合成。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)则为强力有丝分裂因子，能促进软骨细胞分化。血小板衍生生长因子(TOGF)和血管内皮生长因子(VEGF)表现出促进骨折愈合的作用。人骨形态发生蛋白(rhBMP-2)和磷酸三钙复合物在骨缺损修复中较单纯磷酸三钙为佳。
[0006]为了获得满意效果，上述生物分子需要载体送至所需部位并在适当时候释放，还需要一些辅助因子以最大程度地发挥效用。这些要求在很大程度上限制了生长因子的临床使用，同时亦需要更多研究证明生长因子的临床功效、可靠性及安全性。
[0007](3)种子细胞合适的种子细胞是生理性骨再生的重要基础。干细胞作为组织工程构建的种子细胞具有多向分化潜能、更新能力快、几乎无免疫原性等诸多优点，在骨组织工程中发挥重要作用。对于组织工程骨移植，最好的选择是能分化为骨和软骨等组织的间充质干细胞。
[0008]理想的骨修复再生移植材料支架应该具备良好的生物相容性、骨整合能力，可形成骨再生微环境以促进内源和外源种子细胞的骨再生，修复后能与宿主骨完美融合。还有，理想的骨修复再生移植材料支架还需满足生理学功能和力学功能达到自然状态水平，实现生理再生、价格低廉、容易制造等要求。人们对骨移植材料的研究集中于以下几个方面:①改善基质材料的生物力学性能和生物相容性，使骨移植材料具备与骨形成速度相匹配的降解速率；②增强基质材料与生物活性物质的亲和力，并使其释放过程可控；③生物活性物质的选择与获取，以及各物质间的最佳搭配等。总之，将生物活性物质与理想的基质材料组合构建复合骨移植材料，在结构仿生化、骨整合能力最优化和降解与再生同步化等方面获得更大进步，是未来骨移植材料的发展方向。
[0009]现有骨修复移植材料及其在骨缺损修复上的应用，都属于非生理性再生。其整体表现出材料不能或不宜降解、生物相容性差，导致修复后几乎没有延展性、导热能力差，修复后与原来骨结合不完整、形状、大小、厚度均与自体骨有差异等诸多缺陷。从骨再生生理过程来看，采用单纯的骨材料、材料与因子复合、材料复合细胞技术形成骨的能力以及对骨缺损修复效果还不理想。因此，组织工程骨的构建仍需要从以下方面做出进一步的提升:修复重建过程快速与周围骨融合；同时生物因子及干细胞分泌的因子促进自体修复参与细胞的生物学行为；快速参与修复实现生理性骨再生；修复后的骨具有良好的力学性能、生物学性能、结构稳定性(与天然骨一致，可形成骨缝)；与周边自体骨结合完整厚度一致。
【发明内容】
[0010]本发明的目的在于构建了一种骨缺损再生修复组织工程骨，其可用于骨缺损的生理性再生修复。本发明可以实现骨的生理再生并提高骨缺损的修复治疗效果。
[0011]为达到上述的目的，本发明采取如下的技术方案:
本发明构建了一种骨缺损再生修复组织工程骨，是由三层骨髓间充质干细胞聚合体与两层骨基质颗粒构成的复合层状结构体，其中，骨基质颗粒作为再生支架，骨髓间充质干细胞聚合体黏附包裹再生支架。需要强调的是，骨髓间充质干细胞聚合体是由骨髓间充质干细胞快速增值形成的，并含有由骨髓间充质干细胞分泌的大量的胞外基质，胞外基质中含有促使新骨生成的活性因子。
[0012]所述复合层状结构体是由三层骨髓间充质干细胞聚合体包裹两层骨基质颗粒形成的骨缺损再生修复产品，是采用“骨髓间充质干细胞聚合体--骨基质颗粒--骨髓间充质干细胞聚合体--骨基质颗粒--骨髓间充质干细胞聚合体”的复合模式制备的修复产品。具体而言，所述复合层状结构体由下至上依次为平铺于底层的骨髓间充质干细胞聚合体，均匀平铺于底层骨髓间充质干细胞聚合体上的骨基质颗粒，在骨基质颗粒上平铺位于中间层的骨髓间充质干细胞聚合体，均匀平铺于中间层骨髓间充质干细胞聚合体上的骨基质颗粒，以及平铺于骨基质颗粒上的位于上层的骨髓间充质干细胞聚合体。
[0013]进一步地，所述骨髓间充质干细胞聚合体包括骨髓间充质干细胞以及由骨髓间充质干细胞分泌的并分布在骨髓间充质干细胞周围的胞外基质。骨髓间充质干细胞分泌的大量的胞外基质形成骨再生骨微环境，可以诱导内源和外源种子细胞参与骨重建。这里的种子细胞是指本发明所述的骨髓间充质干细胞。
[0014]为了与骨缺损的厚度相匹配，同时创造利于骨髓间充质干细胞参与骨重建的微环境，所述复合层状结构体的每层骨髓间充质干细胞聚合体均优选为两张骨髓间充质干细胞聚合体，每张骨髓间充质干细胞聚合体具有6?10层骨髓间充质干细胞层。在构建骨髓间充质干细胞细胞聚合体的过程中，胞外基质与骨髓间充质干细胞均匀分布和排列形成6?10层细胞膜片样聚合体，其厚度达到75?150 μ m。
[0015]如上所述骨基质颗粒作为组织工程骨的再生支架，优选地，所述所述骨基质颗粒是选用自体骨制备的骨基质颗粒，移植后无抗原排斥反应。进一步地，自体骨或脱钙骨基质颗粒的粒径为0.2?0.5cm。将自体骨或脱钙骨基质处理为直径0.2?0.5cm的微粒，有利于形成骨再生支架的合理空间。
[0016]另一方面，本发明还提供了所述骨缺损再生修复组织工程骨的构建方法，包括骨髓间充质干细胞分离培养、骨髓间充质干细胞聚合体的构建、骨基质颗粒制备和组织工程骨的构建等步骤。具体而言，包括如下步骤:
步骤一:骨髓间充质干细胞分离培养
过滤骨髓血样本，用培养液I调整骨髓间充质干细胞浓度为5.0X 15?1.0X 10 6个/mL，并接种于培养瓶中，静置12?18h，待骨髓间充质干细胞贴壁后将培养基I更换为培养液II ；
在37±1°C、4.5?5.5%C02、湿度饱和条件下培养48?72h，弃培养液II，用0.lmol/LPBS洗涤两遍并更换新的培养基II，以后每72?96h更换培养液II I次，待细胞融合率达到70%?85%时，进行传代扩大培养至P3代细胞。
[0017]步骤二:骨髓间充质干细胞聚合体的构建
将P3代骨髓间充质干细胞，用培养液III配制成细胞浓度为5.0 X 15?1.0X10 7个/mL的骨髓间充质干细胞悬液，取2mL?8mL骨髓间充质干细胞悬液接种于直径为3cm?1cm培养皿中，静置于37±1°C、4.5?5.5%C0J?箱中培养；每隔22?26小时更换培养液III一次，培养7?10天至骨髓间充质干细胞聚合体形成，将培养液III更换为培养液IV，继续培养3天；用生理盐水清洗骨髓间充质干细胞聚合体，从培养皿中取出骨髓间充质干细胞聚合体并用生理盐水漂洗3次，备