悬浮状；用150目的滤网过滤并计数，用培养液I调整细胞浓度为I X 16个/mL,接种于75mL培养瓶，培养液为培养液II。在37°C、5%C02、湿度饱和条件下培养48h，弃培养液II，用浓度为
0.lmol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两遍并更换新的培养液II。以后每72h更换培养液
III次，待细胞融合率达到75%时，进行传代扩大培养，取P3代细胞用做构建骨髓间充质干细胞细胞聚合体的材料。
[0071]步骤三、骨基质的一次处理
I年龄长白条猪进行颅骨直径5cm极限缺损造模(与步骤二中取骨髓的猪一一对应，为自体干细胞移植实验)，将颅骨造模处取出的骨片进行处理，用含有青霉素和链霉素的无Ca2+、Mg2+的PBS清洗颅骨骨片，弃去颅骨骨片残存血液、结缔组织、骨碎粒等，将收集的颅骨骨片(骨组织材料)进行3次反复冲洗和筛选，将获得的骨块(颅骨骨片)置于无菌50mL离心管中，封口膜封口并置于-80 V冰箱进行冷冻储存。
[0072]步骤四、骨髓间充质干细胞聚合体构建取取步骤二培养的P3代的骨髓间充质干细胞，每ImL培养液III含有5 X 16个细胞，制备成骨髓间充质干细胞悬液。将骨髓间充质干细胞悬液以2mL的体积接种于孔径为5cm培养皿中，静置于5% C02、37°C孵箱中培养；每隔24小时更换培养液III一次，共培养10天，肉眼可见乳白色膜样结构(膜片或骨髓间充质干细胞细胞聚合体)，膜片在六孔板边缘有轻微翘起时，此时骨髓间充质干细胞细胞聚合体形成。更换培养液IV，继续培养3天。用生理盐水清洗骨髓间充质干细胞细胞聚合体，用镊子轻轻从皿底撕下，生理盐水漂洗3次，并悬浮于生理盐水中备用。
[0073]步骤五、骨基质颗粒的制备
3个月后，取出-80°C保存的骨材料(骨基质)，37°C水浴解冻，无菌条件下将骨基质进行粉碎处理，用80目的不锈钢钢筛除去粒径0.2cm以下的颗粒，用30目的不锈钢钢筛筛选粒径在0.2?0.5cm之间的骨基质颗粒，收集后无菌储存，4°C保存备用。
[0074]步骤六、组织工程骨的构建
将处理好备用的骨髓间充质干细胞聚合体与骨基质颗粒支架材料按照以下方式进行组合构建:将2张骨髓间充质干细胞聚合体平铺于底层，均匀的将骨基质颗粒材料平铺于骨髓间充质干细胞聚合体上，再将2张骨髓间充质干细胞聚合体在骨基质颗粒上平铺，继续均匀的将骨基质颗粒材料平铺于骨髓间充质干细胞聚合体上，最后将2张骨髓间充质干细胞聚合体在材料上平铺；形成三层骨髓间充质干细胞聚合体包裹两层骨基质颗粒材料的修复产品。
[0075]采用本实施例所述方法进行猪颅骨极限缺损修复。首先，构建猪颅骨极限缺损，直径=5cm、厚度=3cm的缺损模型，模拟临床治疗一次开颅，取出的骨处理后_80°C无菌保存，同时取骨髓并分离培养间充质干细胞并构建细胞聚合体膜片样活性材料(见图4a，图4b，图4c)。3个月后，用构建的组织工程骨进行移植骨缺损修复，见图4d。待组织工程骨进行骨缺损修复12周后，CT扫面鉴定骨缺损修复完成且效果理想，见图4e和图4f。本实施例说明，构建的组织工程骨具有理想的生理骨再生能力，缺损修复时间短，有较好的骨修复功會K。
[0076]上面结合实施例对本发明做了进一步的叙述，但本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。
【主权项】
1.一种骨缺损再生修复组织工程骨，其特征在于，所述组织工程骨是由三层骨髓间充质干细胞聚合体与两层骨基质颗粒构成的复合层状结构体；所述复合层状结构体由下至上依次为底层骨髓间充质干细胞聚合体，均匀平铺于底层骨髓间充质干细胞聚合体上的骨基质颗粒，在骨基质颗粒上平铺中间层骨髓间充质干细胞聚合体，均匀平铺于中间层骨髓间充质干细胞聚合体上的骨基质颗粒，以及平铺于骨基质颗粒上的上层骨髓间充质干细胞聚合体； 其中，所述骨髓间充质干细胞聚合体包括骨髓间充质干细胞以及由骨髓间充质干细胞分泌的并分布在骨髓间充质干细胞周围的胞外基质。2.根据权利要求1所述的骨缺损再生修复组织工程骨，其特征在于，所述每层骨髓间充质干细胞聚合体均包括两张骨髓间充质干细胞聚合体，每张骨髓间充质干细胞聚合体具有6?10层骨髓间充质干细胞层。3.根据权利要求1所述的骨缺损再生修复组织工程骨，其特征在于，所述骨基质颗粒是选用自体骨制备的骨基质颗粒。4.根据权利要求3所述的骨缺损再生修复组织工程骨，其特征在于，所述骨基质颗粒的粒径为0.2?0.5cm。5.构建如权利要求1至4中任一项所述的骨缺损再生修复组织工程骨的方法，其特征在于，包括如下步骤: 骨髓间充质干细胞分离培养 过滤骨髓血样本，用培养液I调整骨髓间充质干细胞浓度为5.0X 15?1.0X 10 6个/mL，并接种于培养瓶中，静置12?18h，待骨髓间充质干细胞贴壁后将培养基I更换为培养液II ； 在37±1°C、4.5?5.5%C02、湿度饱和条件下培养48?72h，弃培养液II，用0.lmol/LPBS洗涤两遍并更换新的培养基II，以后每72?96h更换培养液II I次，待细胞融合率达到70%?85%时，进行传代扩大培养至P3代细胞； 所述培养液I为DMEM培养液；培养液II为含FBS的DMEM培养液，并且DMEM培养液中FBS的体积分数为10% ; (2)骨髓间充质干细胞聚合体的构建 将P3代骨髓间充质干细胞，用培养液III配制成细胞浓度为5.0 X 15?1.0X10 7个/mL的骨髓间充质干细胞悬液，取2mL?8mL骨髓间充质干细胞悬液接种于直径为3cm?1cm培养皿中，静置于37±1°C、4.5?5.5%C0J?箱中培养；每隔22?26小时更换培养液III一次，培养7?10天至骨髓间充质干细胞聚合体形成，将培养液III更换为培养液IV，继续培养3天；用生理盐水清洗骨髓间充质干细胞聚合体，从培养皿中取出骨髓间充质干细胞聚合体并用生理盐水漂洗3次，备用； 所述培养液III由FBS、DMEM培养液、维生素C、8_异戊烯基柑橘素、甘草查尔酮A和淫羊藿苷组成；其中，FBS的体积分数为10%，维生素C的浓度为50?100mg/L，8-异戊烯基柑橘素的浓度为10 5?10 smol/L，甘草查尔酮A的浓度为5 X 10 4?5 X 10 6mol/L，淫羊藿苷的浓度为10 5?10 W/L ; 所述培养液IV由FBS、DMEM培养液、β -磷酸甘油钠、地塞米松、维生素C、8_异戊烯基柑橘素、甘草查尔酮A和淫羊藿苷组成；其中，FBS的体积分数为10%，β -磷酸甘油钠的浓度为10?20mmol/L，地塞米松的浓度为5?20nM，维生素C的浓度为50?100 μ g/ml，8-异戊烯基柑橘素的浓度为10 5?10 smol/L，甘草查尔酮A的浓度为5 X 10 4?5 X 10 6mol/L,淫羊藿苷的浓度为10 5?10 mol/L ； (3)骨基质颗粒制备 将预处理后的自体骨或脱钙骨基质置于_80±5°C度冰箱中进行冷冻储存；37°C水浴解冻，在无菌条件下将自体骨或脱钙骨基质粉碎，筛选颗粒粒径为0.2?0.5cm的骨基质无菌储存，2?8°C保存备用； (4)组织工程骨的构建 将2张底层骨髓间充质干细胞聚合体平铺，均匀的将自体骨或脱钙骨基质颗粒平铺于底层骨髓间充质干细胞聚合体上；再将2张中间层骨髓间充质干细胞聚合体平铺在自体骨或脱钙骨基质颗粒上，继续均匀的将自体骨或脱钙骨基质颗粒平铺于中间层骨髓间充质干细胞聚合体上；最后将2张底层骨髓间充质干细胞聚合体平铺在自体骨或脱钙骨基质颗粒上，形成所需的组织工程骨。6.如权利要求1至4中任一项所述的组织工程骨在骨缺损再生修复中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种骨缺损再生修复组织工程骨及其构建方法与应用，组织工程骨由三层骨髓间充质干细胞聚合体与两层骨基质颗粒构成的复合层状结构体；复合层状结构体是由骨髓间充质干细胞聚合体-骨基质颗粒-骨髓间充质干细胞聚合体-骨基质颗粒-骨髓间充质干细胞聚合体组成的复合体；骨髓间充质干细胞聚合体包括骨髓间充质干细胞以及由骨髓间充质干细胞分泌的并分布在骨髓间充质干细胞周围的胞外基质。采用本发明构建方法形成的组织工程骨同时复合活细胞及活性因子，修复重建过程快速，新生骨与周边自体骨结合完整、厚度一致，适用于骨缺损再生修复，实现了骨的生理再生并提高了骨缺损的修复治疗效果。
【IPC分类】A61L27/40, A61L27/36, A61L27/54, A61L27/50, A61L27/38
【公开号】CN105013016
【申请号】CN201510453635
【发明人】梅丽洁
【申请人】西安芙金细胞科技有限公司
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月29日