用。
[0018]步骤二:骨基质颗粒制备
将预处理后的自体骨或脱钙骨基质置于_80±5°C度冰箱中进行冷冻储存；37°C水浴解冻，在无菌条件下将自体骨或脱钙骨基质粉碎，筛选颗粒粒径为0.2?0.5cm的骨基质无菌储存，2?8°C保存备用。
[0019]步骤四:组织工程骨的构建
将2张底层骨髓间充质干细胞聚合体平铺，均匀的将自体骨或脱钙骨基质颗粒平铺于底层骨髓间充质干细胞聚合体上；再将2张中间层骨髓间充质干细胞聚合体平铺在自体骨或脱钙骨基质颗粒上，继续均匀的将自体骨或脱钙骨基质颗粒平铺于中间层骨髓间充质干细胞聚合体上；最后将2张底层骨髓间充质干细胞聚合体平铺在自体骨或脱钙骨基质颗粒上，形成所需的组织工程骨。
[0020]在骨缺损再生修复组织工程骨的构建方法中，使用了 4种培养液，分别为培养液
1、培养液I1、培养液III和培养液IV。[0021 ] 其中，培养液I为DMEM培养液，可以购买sigma公司的产品。
[0022]培养液II为含FBS的DMEM培养液，并且DMEM培养液中FBS的体积分数为10%。
[0023]培养液III由FBS、DMEM培养液、维生素C、8_异戊烯基柑橘素、甘草查尔酮A和淫羊藿苷组成；其中，FBS的体积分数为10%，维生素C的浓度为50?100mg/L，8-异戊烯基柑橘素的浓度为10 5?10 smol/L，甘草查尔酮A的浓度为5 X 10 4?5 X 10 6mol/L，淫羊藿苷的浓度为10 5?10 mo I/L ο
[0024]培养液IV由FBS、DMEM培养液、β -磷酸甘油钠、地塞米松、维生素C、8_异戊烯基柑橘素、甘草查尔酮A和淫羊藿苷组成；其中，FBS的体积分数为10%，β -磷酸甘油钠的浓度为10?20mmol/L，地塞米松的浓度为5?20nM，维生素C的浓度为50?100 μ g/ml，8-异戊烯基柑橘素的浓度为10 5?10 smol/L，甘草查尔酮A的浓度为5 X 10 4?5 X 10 6mol/L,淫羊藿苷的浓度为10 5?10 mol/Lo
[0025]对于上述骨缺损再生修复组织工程骨的构建方法，还需要说明的是，组织工程骨是由骨髓间充质干细胞聚合体和骨基质颗粒组成的，骨髓间充质干细胞聚合体的构建以及骨基质颗粒制备的先后顺序，可以做出调整。本发明给出的构建方法，只是一种优选的实施方式，还可以包括培养液的制备步骤。
[0026]还有，本发明还给出了所述的组织工程骨在骨缺损再生修复中的应用。
[0027]本发明对骨缺损再生修复组织工程骨的构建进行了方法学的创新，制备出了骨基质颗粒作为再生支架，同时复合活细胞及活性因子的组织工程骨。该组织工程骨中含有大量丰富的生长、血管化、骨诱导等生物活性因子，较单纯的骨材料、材料与因子复合、材料复合细胞，更具骨形成能力。骨基质颗粒的制备以自体骨为原料，避免了缺损处自体骨的废弃和引起不必要的排异反应，提供了更加有益于间充质干细胞生长、增殖、分化的微环境。移植本发明所述的组织工程骨后能快速修复大面积骨缺损，修复重建过程快速与周围骨融合，同时生物因子及干细胞分泌的因子促进自体修复参与细胞的生物学行为，快速参与修复，新生骨具有良好的力学性能、生物学性能、结构稳定性(与天然骨一致，可形成骨缝)、与周边自体骨结合完整厚度一致。
[0028]通过细胞聚合体技术使得骨髓间充质干细胞分泌的大量活性因子聚集于胞外基质中，保留了细胞与细胞之间的通讯及相互作用，避免了现有细胞移植过程中胰酶消化导致胞外基质散失和细胞之间通讯终结情况的出现，最大程度的保留了细胞增殖、分化及发挥功能的微环境。
[0029]低温保存技术实现了骨或脱细胞骨组织支架的长时间保存，降低了临床治疗中单纯用骨材料的费用，以及实现了生理性骨再生，同时通过使用含有活细胞的组织工程骨提高并保证了骨缺损修复的质量。
[0030]与专利申请号为201210090795.0的专利文献公开的无载体骨髓间充质干细胞膜片的制备方法相比，细胞聚合体技术操作更简单，无需使用支架材料和温敏材料。在细胞膜片形状及面积相同的情况下，采用细胞聚合体技术制备的骨髓间充质干细胞聚合体的厚度是专利文献201210090795.0制备的骨髓间充质干细胞膜片的1.5?3倍，此外，细胞聚合体的韧性以及胞外基质的积累量明显提高。同时，在聚合体诱导体系中的小分子化合物(培养液中的组分)促进成骨分化，并抑制骨髓间充质干细胞分化成脂肪。与单纯使用维生素C诱导间充质干细胞膜片(参见专利申请号为201110210523.5的专利文献)相比，本发明提供的骨缺损再生修复组织工程骨的构建方法更易于参与新骨形成和重建。
[0031]本发明所述组织工程骨复合骨髓间充质干细胞聚合体与骨或脱钙骨基质颗粒，并同时创造了良好的骨诱导微环境，一方面源于骨髓间充质干细胞聚合体提供大量丰富的活性因子，促使骨髓间充质干细胞的成活及分化，参与骨重建；另一方面的优势源于骨颗粒或骨基质支架来源于自体骨，无排异反应，安全性得到了提高，同时保证了其成骨能力与成骨环境。因此，本发明较现有材料加消化后的干细胞修复骨缺损更快更有效，较现有合成高分子材料、生物材料、纳米材料更具修复优势。
[0032]与现有骨缺损修复产品相比，本发明所制备的骨缺损再生修复组织工程骨易于根据缺损形成与缺损形状、大小、厚度相匹配。
[0033]以下将结合实施例对本发明做进一步详细阐述。
【附图说明】
[0034]图1是实施例1大鼠颅骨缺损修复图。其中，图1A是大鼠2cm颅骨极限缺损模型图；图1B是骨髓间充质干细胞聚合体铺展于硬脑膜；图1C是骨基质颗粒均匀分布于缺损中；图1D是骨髓间充质干细胞聚合体铺展于骨颗粒上包裹支架材料。
[0035]图2是实施例1所述大鼠颅骨极限缺损的修复效果图。
[0036]图3A是实施例2兔子P3代骨髓间充质干细胞构建的骨髓间充质干细胞细胞聚合体。
[0037]图3B是实施例2构建的组织工程骨用于骨缺损修复图。
[0038]图3C是实施例2构建的组织工程骨移位移植至兔子皮下的异位成骨能力效果图。
[0039]图3D是实施例2骨缺损修复12周后CT扫面鉴定骨缺损修复效果图。
[0040]图4a是实施例3大动物模型用1.5岁长白条猪。
[0041]图4b是实施例3中直径5cm全层烦骨缺损图。
[0042]图4c是实施例3中深度3cm全层烦骨缺损图。
[0043]图4d是实施例3中构建产品移植修复颅骨缺损图。
[0044]图4e是实施例3中颅骨缺损修复后CT分析图。
[0045]图4f是实施例3中颅骨缺损修复后答题拍照图。
【具体实施方式】
[0046]实施例1:大鼠颅骨极限缺损修复
本实施例以大鼠为供试生物，对其颅骨极限缺损进行修复，具体包括以下步骤。
[0047]步骤一、培养液的配制
本实施例使用了 4种培养液，分别为培养液1、培养液I1、培养液III和培养液IV。其中，培养液I为DMEM培养液，购自sigma公司。培养液II为含FBS的DMEM培养液，并且DMEM培养液中FBS的体积分数为10%。
[0048]培养液III由FBS、DMEM培养液、维生素C、8_异戊烯基柑橘素、甘草查尔酮A和淫羊藿苷组成。其中，FBS的体积分数为10%，维生素C的浓度为100mg/L，8-异戊烯基柑橘素的浓度为10 6mol/L，甘草查尔酮A的浓度为5 X 10 5mol/L，淫羊藿苷的浓度为10 7mol/L0
[0049]培养液IV由FBS、DMEM培养液、β -磷酸甘油钠、地塞米松、维生素C、8_异戊烯基柑橘素、甘草查尔酮A和淫羊藿苷组成；其中，FBS的体积分数为10%，β -磷酸甘油钠的浓度为20mmol/L，地塞米松的浓度为ΙΟηΜ，维生素C的浓度为50 μ g/ml, 8-异戊烯基柑橘素的浓度为10 smol/L，甘草查尔酮A的浓度为5 X 10 5mol/L，淫羊藿苷的浓度为10 7mol/L0
[0050]步骤二、骨髓间充质干细胞的分离与培养
选用2周龄大鼠脱白处死，75%酒精浸泡消毒，取股骨获得骨髓并用注射器反复吹打成单核层悬浮状；用150目的滤网过滤并计数，用培养液I调整细胞浓度为5.0 X 15个/mL，接种于75mL培养瓶，培养液为培养液II。在37°C、5% CO2、湿度饱和条件下培养48 h，弃培养液II，用浓度为0.lmol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两遍并更换新培养液II。以后每72h更换培养液II I次，待细胞融合率达到80%时，进行传代扩大培养，取P3代细胞用做构建骨髓间充质干细胞细胞聚合体的材料。