一种皮肤溃疡修复基质的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于组织工程技术领域，涉及一种皮肤溃疡修复基质的制备方法。
【背景技术】
[0002] 皮肤是人体的第一道防御屏障，具有维持机体稳态的重要功能，因此，无论何种原 因引起的皮肤缺失性损伤，都需要及时给予治疗。小面积浅层皮肤损伤是可以通过人体自 身调节自行修复的，但伤口直径大于20cm或深至真皮层以及慢性皮肤溃疡患者，需要通过 其他手段加以治疗。
[0003] 慢性皮肤溃疡（chronicskinulcer，CSU)又叫难治性溃疡，是一种临床常见疾病。 糖尿病足和静脉溃疡等都属于难治性溃疡。近年来随着人们生活水平提高以及社会老龄 化，糖尿病（diabctesmellitus，DM)发病率逐年攀升。目前我国糖尿病患者约9200万，其 中15%~25%的患者会患有足部溃疡。若不加以治疗，可能会导致截肢。
[0004] 对于治疗各种皮肤缺损，传统的植皮方法存在诸多不能克服的缺点，如会造成多 处创面，增加患者的痛苦；不能满足大面积植入的需求等。另外，如糖尿病足和静脉溃疡等 一些难治性溃疡创面也无法通过简单植皮实现创面愈合。皮肤溃疡修复基质则为这些难题 提供了解决的途径。
[0005] 组织工程皮肤一般通过种子细胞和支架材料制备而成。支架材料的种类较多，但 由于材料本身性质和处理方法等所限，目前报道的支架不能很好的满足细胞增殖要求或制 备工艺繁琐。细胞外基质（extracellularmatrix，ECM)是结缔组织中细胞外物质的总称， 是一种很好的支架材料。它能够对生长因子起到存储、显示及释放的作用。已有很多报道 证明细胞外基质能够有效的引导纤维细胞长入并促进新生血管形成。接种的细胞分泌的生 长因子对溃疡、烧烫伤等创面愈合过程有重要影响。生长因子可以直接促进移植细胞的增 殖与分化，还可维持其生物功能；溃疡、深度烧烫伤等创面局部生长因子及其受体的活性下 降和数量的相对或绝对的缺乏是创面难以愈合的病理生理基础。
[0006] 专利申请号为200910078357. 0的中国发明专利（专利权已失效）公开了一种以 人源表皮细胞为种子细胞，人源成纤维细胞分泌形成的细胞外基质为生物支架构建组织工 程皮肤的方法。该方法存在培养时间长（一般为20~50天）、成本高和工艺复杂的缺陷。
[0007] 专利申请号为200810116108. 1的中国发明专利（专利权已失效）提及了一种以 人源成纤维细胞为种子细胞，接种于凝胶生物材料中构建组织工程皮肤的方法。该方法同 样存在培养周期长（一般为15~20天）、成本高、工艺复杂等缺点。
[0008] 专利申请号为201510100264. 9的中国发明专利申请，公开了一种组织工程皮肤 及其应用，其是以脱细胞真皮基质（Acellular dermal matrix，ADM)作为支架材料，脐带间 充质干细胞为种子细胞构建的组织工程皮肤。该技术虽然缩短了培养时间，但在制备过程 中需要在脱细胞真皮基质表面包被一层明胶，然后进行多次接种，并在ADM表面进行扎孔 后培养一段时间，才可以达到细胞膜覆盖ADM表面的效果。若不包被明胶则无法得到表面 具有完整细胞膜的产品。该种制备方法不仅没有使脱细胞基质在细胞培养时充分发挥自身 作用，而且工艺较为繁琐，成本高，不适合产业化。而且，这种制备方法也只能在ADM表面形 成单层细胞膜，而细胞分泌的生长因子作为一种蛋白质会在体内快速降解，因而单层的细 胞膜分泌生长因子的量远远不能满足调节创面微环境的作用，从而使其对创面的修复效果 有限。另外，目前已报道的组织工程皮肤类产品几乎都存在同样的问题，即由于产品形态而 导致保质期短，对存储条件和运输要求高的缺点。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是解决现有的组织工程皮肤构建方法存在的培养周期长、成本高、 工艺复杂、不适合产业化、不能满足调节创面微环境的作用，从而使其对创面的修复效果有 限、保质期短，对存储条件和运输要求高的缺点。
[0010] 为此，本发明提供了一种皮肤溃疡修复基质的制备方法，主要是采用脱细胞、去抗 原和增厚处理后的天然细胞外基质作为生物支架，复合种子细胞在天然细胞外基质表面形 成具有多层细胞的细胞膜，经冷冻干燥处理后即得皮肤溃疡修复基质；
[0011] 所述种子细胞是自体或同种异体来源的成纤维细胞或干细胞。
[0012] 上述皮肤溃疡修复基质的制备方法，具体包括以下步骤：
[0013] 1)步骤一、细胞外基质的制备：将完成脱细胞去抗原和灭活处理的胶原膜组织用 碱液浸泡进行增厚处理，然后用0. 01~0. 05M PBS溶液进行清洗至pH为6~7为止，并用 所述PBS溶液浸泡1~6小时得到细胞外基质，然后用10~25kGy钴60辐照灭菌后备用；
[0014] 2)步骤二、培养基的配制：
[0015]2. 1)、配制基础液：按9:1的体积比将DMEM/F12商用培养液与胎牛血清或新生牛 血清混合为基础液；
[0016]2. 2)、配制基础培养基：按500ml所述基础液标准加入胰岛素1~100ng，转铁蛋 白1~50mg，亚硒酸钠1~30 y g，氢化可松10~600 y g，表皮细胞生长因子1~20 y g， 碱性成纤维细胞生长因子1~l〇〇ng，转化生长因子0 1~100ng，维生素C 1~100mg，配 制成基础培养基；
[0017] 2. 3)、配制培养基：向所述基础培养基中分别添加牛垂体提取液10~30 y g/ml、 腺噪呤1~50mg、HRG 50~300ng/ml和血小板衍生因子1~20ng/ml，分别配制成以下四 种不同的培养基：
[0018] 培养基a :基础培养基+牛垂体提取液10~30 y g/ml ;
[0019] 培养基b:基础培养基+腺嘌呤1~100 y g/ml;
[0020] 培养基c :基础培养基+HRG 50~300ng/ml ;
[0021] 培养基d :基础培养基+血小板衍生因子1~20ng/ml ;
[0022] 其中，所述牛垂体提取液、腺嘌呤、HRG和血小板衍生因子的浓度为终浓度；
[0023] 3)步骤三、种子细胞的分离和体外培养：采用组织贴壁法从所需的组织中进行种 子细胞的分离，或采用酶消化法从所需的组织中进行种子细胞的分离，或差速贴壁法从所 需的组织中进行种子细胞的分离；
[0024] 并用？12或1^]?或01^]\1或1^]\〇-1640培养基混合5%~20%的胎牛血清进行体 外传代培养，培养温度为25~38 °C，3 %~7 %的C02浓度；
[0025] 4)步骤四、接种细胞和三维培养：在无菌环境下，按IX 104~10X10 6个/cm2的 接种密度在所述步骤一制备的细胞外基质上进行细胞接种，接种时刺入所述细胞外基质 0. 2~1mm进行接种，每次注入0. 5~1.0ml，针孔密度为0. 1~0. 5个/cm2,并在所述细胞 外基质表面进行点状接种，然后通过轻微振荡使所述种子细胞均匀分布在所述细胞外基质 表面；
[0026] 在37 °C、5 %的0)2培养箱中，使接种后的细胞外基质完全浸没于培养基a中，培养 1~2天，之后更换培养基b，浸没所述接种后的细胞外基质，培养1~2天后更换为培养基 c，培养基c液面与所述接种后的细胞外基质平齐，继续培养1~2天后更换为培养基d，同 样浸没所述接种后的细胞外基质，培养1~2天；培养期间每天换液；
[0027] 5)步骤五、冻干包装和灭菌：将所述步骤三培养完成的样品进行冻干，控制冻干 程序以5~12°C /min的速率降至-80~-20°C，保持1~4小时后，冷冻干燥10~24小 时，之后进行包装，再以10~25kGy钴60辐照灭菌后即得皮肤溃疡修复基质。
[0028] 上述碱液浸泡处理系指在室温条件下，用1M碱溶液浸泡5~30min，或用1%〇~ 1 %的次氯酸钠浸泡1~2小时，进行浸泡处理，使所述胶原膜组织的厚度增加2~7倍。
[0029] 上述碱溶液是氢氧化钠碱溶液、碳酸氢钠碱溶液，碳酸钠碱溶液和氢氧化钾碱溶 液中的任一种。
[0030] 上述胶原膜组织的厚度增加3~5倍。
[0031] 上述步骤一中在制备的所述细胞外基质上均匀打孔处理后，然后用10~25kGy钴 60辐照灭菌后备用；
[0032] 所述孔的孔径为0.5~2mm，所述孔的孔密度为0.2~1个/cm2,灭菌后备用。
[0033] 上述胶原膜组织是同种异体皮肤和羊膜中的任一种；
[0034] 或牛、猪来源的皮肤、心包膜和腹膜中的任一种。
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