35] 上述干细胞是脐带间充质干细胞、脐血间充质干细胞、皮肤干细胞、口腔黏膜干细 胞和牙髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、造血干细胞、肝脏干细胞、 神经干细胞中的任一种。
[0036] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0037] (1)本发明涉及的方法，单次接种即实现在细胞外基质表面形成多层细胞膜的效 果，保证在修复创面时能够分泌足够量的多种细胞因子，诱导新生血管形成，促进创面愈 合。加之天然细胞外基质的保护、支撑、屏障作用以及三维立体空间结构引导细胞长入和组 织再生等的作用，能够有效保护促进创面的修复，较少瘢痕的形成。
[0038] (2)用碱液浸泡脱细胞处理后的胶原膜，不仅方法简单，而且使得到的细胞外基质 胶原纤维结构更加疏松。这种疏松的胶原纤维结构不仅为细胞的生长增殖提供了更加适宜 的三维空间结构，而且保证了培养基中的营养成分能够快速的交换渗透，极大的促进了细 胞的增殖。之后用PBS溶液进行清洗浸泡，不仅去除了残留的试剂，而且改善了细胞生长增 殖的微环境。使形成复层化细胞膜更加紧密的粘附在细胞外基质上，甚至能够使细胞部分 长入基质中，也延长了细胞因子发挥作用的时间。
[0039] (3)采用冻干的方式进行处理，不仅保证了产品具有预期的使用效果，并且能够延 长保质期，大大降低了运输和储存的要求。
[0040] (4)制备周期短，工艺简单，适合产业化，适用范围宽，创面修复效果好，减少瘢痕 形成，愈合的创面与正常皮肤的弹性和韧性相近。
【附图说明】
[0041] 图1A是经碱液浸泡处理后的牛心包膜的HE图片。
[0042] 图1B是经碱液浸泡处理后的牛心包膜的HE图片。
[0043] 图2A为培养2天后细胞外基质表面细胞膜的扫描电镜图。
[0044] 图2B为培养3天后细胞外基质表面细胞膜的扫描电镜图。
[0045] 图2C为培养5天后细胞外基质表面细胞膜的扫描电镜图。
[0046] 图3为细胞外基质上单次接种细胞培养5天后的HE染色结果。
[0047] 图4A为大鼠烧烫伤创面使用皮肤溃疡修复基质治疗后lw(l周）的实物图。
[0048] 图4B为对照组治疗大鼠烧烫伤创面lw(l周）后的实物图。
[0049]图4C为大鼠烧烫伤创面使用皮肤溃疡修复基质治疗后3w(3周）的实物图。
[0050] 图4D为对照组治疗大鼠烧烫伤创面3w(3周）后的实物图。
【具体实施方式】
[0051] 为了解决现有的组织工程皮肤构建方法存在的培养周期长、成本高、工艺复杂、不 适合产业化、不能满足调节创面微环境的作用，从而使其对创面的修复效果有限、保质期 短，对存储条件和运输要求高的缺点，本实施例提供了一种皮肤溃疡修复基质的制备方法： 将种子细胞直接接种在经特殊处理的细胞外基质上，实现了细胞外基质表面细胞复层化和 细胞外基质内部部分细胞长入的效果，并将其进行冻干灭菌处理，所制备的皮肤溃疡修复 基质能够有效的促进糖尿病足部溃疡、静脉溃疡、深度烧烫伤等慢性伤口的愈合，并能减少 瘢痕的形成，愈合的创面与正常皮肤的弹性和韧性相近。
[0052] 该皮肤溃疡修复基质的制备方法具体是采用脱细胞、去抗原和增厚处理后的天然 细胞外基质作为生物支架，复合种子细胞在天然细胞外基质表面形成多层细胞的细胞膜 (具有2~10层细胞膜的细胞），经冷冻干燥处理后即得皮肤溃疡修复基质；其中涉及的种 子细胞是自体或同种异体来源的成纤维细胞或胚胎或干细胞。
[0053] 按照制备过程，该皮肤溃疡修复基质的制备方法，主要包括细胞外基质的制备、培 养基的配制、种子细胞的分尚和体外培养、接种细胞和三维培养、冻干等步骤；具体制备过 程如下：
[0054] 步骤一、细胞外基质的制备：
[0055] 脱细胞：用于制备细胞外基质的胶原膜组织在除去脂肪和其他杂物后，进行 脱细胞去抗原和灭活处理，具体的处理方法可参照专利申请号为CN201110145229. 0、 CN201210251134. 1、CN201310358048. 5、CN201310117569. 1 和 CN201310109216. 7 中记载 的任一种脱细胞去抗原和灭活处理方式均可。如专利申请号为CN201310109216. 7中提及 的方法：将前处理完成的胶原膜置于2. 0M氯化钾和0. 1M的氨水混合溶液中浸泡60分钟， 之后更换用等量的纯化水震摇1小时，如此交替循环处理3次，最后用纯化水清洗至pH值 6. 0 ~8. 0〇
[0056] 细胞外基质的获取：将上述处理完成的胶原膜组织（简称胶原膜）用1M碱溶液 浸泡5~30min，如氢氧化钠溶液、碳酸氢钠溶液，碳酸钠溶液、氢氧化钾溶液等，或用1%。~ 1 %的次氯酸钠浸泡1~2小时，使胶原膜的厚度增加2~7倍，较优的是增厚3~5倍。然 后用大量的0. 01~0. 05M PBS溶液进行清洗至pH为6~7为止，并用PBS溶液浸泡1~ 6小时得到细胞外基质。该步骤是通过碱液的作用使胶原膜的胶原纤维结构更加疏松，图 1B所示（与图1A相比，说明碱液处理可有效的疏松胶原纤维结构），便于细胞更好的粘附 甚至长入，使产品的结构和性能更加稳定。
[0057] 另外用PBS溶液清洗浸泡不仅可使胶原膜内部微环境更加适合细胞生长增殖，而 且能够去除其他残留试剂，保证细胞外基质不会对细胞的增殖产生任何负面影响。然后将 细胞外基质裁切成一定的规格，如圆形、矩形等，也可在细胞外基质上进行打孔（分为打通 和不打通，孔径0. 5~2mm)处理，使孔均匀分布在细胞外基质上，孔密度为0. 2~1个/cm2， 10~25kGy钴60福照灭菌后备用。
[0058] 不难看出，此时这里的细胞外基质为经过碱液增厚处理的脱细胞胶原膜，主要成 分为I、111型胶原，包括同种异体皮肤、羊膜等，也包括如牛、猪等异种来源的皮肤、心包膜、 腹膜等组织膜类。不仅与人体皮肤的成分相近，而且具有一定的弹性与韧性，几乎无免疫原 性。同时处理后的胶原膜具有更加疏松的三维立体空间结构，能够引导细胞和长入和组织 再生，使愈合的创面具有接近正常皮肤的特性，还能抑制瘢痕形成。
[0059] 步骤二：培养基的配制：
[0060] 按9:1的体积比将DMEM/F12商用培养液与胎牛血清或新生牛血清混合为基础液； 再按500ml基础液标准加入胰岛素1~100ng，转铁蛋白1~50mg，亚硒酸钠1~30 y g，氢 化可松10~600 y g，表皮细胞生长因子1~20 y g，碱性成纤维细胞生长因子1~100ng， 转化生长因子0 1~lOOng，维生素C 1~100mg，配制成基础培养基，再用基础培养基配制 成以下培养基，其中添加物的浓度为终浓度：
[0061] 培养基a :基础培养基+牛垂体提取液10~30 y g/ml ;
[0062] 培养基b:基础培养基+腺嘌呤1~100yg/ml;
[0063] 培养基c:基础培养基+HRG50~300ng/ml;
[0064] 培养基d:基础培养基+血小板衍生因子1~20ng/ml;
[0065] 添加的牛垂体提取液、腺嘌呤、HRG、血小板衍生因子都具有促进细胞生长增殖的 效果，有助于实现细胞膜复层化。
[0066] 步骤三、种子细胞的分离和体外培养：可参考现有技术进行相关种子细胞的分离 和体外培养，如采用组织贴壁法从所需的胶原膜组织中进行种子细胞的分离，或采用酶消 化法从所需的胶原膜组织中进行种子细胞的分离，或差速贴壁法从所需的胶原膜组织中进 行种子细胞的分离；并用F12或MEM或DMEM或RPMI-1640培养基混合5 %~20 %的胎牛血 清进行体外传代培养，培养温度为25~38°C，3%~7%的C02浓度。
[0067] 步骤四、接种细胞和三维培养：在无菌环境下，按1 X 104~10 X 10 6个/cm2的接种 密度在细胞外基质上进行细胞接种。接种时用顶端尖锐的器具刺入细胞外基质〇. 2~1_ 进行"打针式"接种即注射其中，每次注入0.5~1.0ml，针孔密度为0. 1~0.5个/cm2,并 在细胞外基质表面进行点状接种即逐滴滴在细胞外基质表面上，然后通过轻微振荡使细胞 均匀分布在细胞外基质表面。培养条件：37°C，5% C02，在37°C、5%的0)2培养箱中，使接种 后的细胞外基质完全浸没于培养基a中，培养1~2天，之后更换培养基b，浸没所述接种后 的细胞外基质，培养1~2天后更换为培养基c，培养基c液面与所述接种后的细胞外基质 平齐，继续培养1~2天后更换为培养基d，同样浸没所述接种后的细胞外基质，培养1~2 天；培养期间每天换液。