[0068] 这里提及的细胞即为种子细胞，是自体或同种异体来源的成纤维细胞、干细胞，如 脐带间充质干细胞、脐血间充质干细胞、皮肤干细胞、口腔黏膜干细胞和牙髓间充质干细 胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、造血干细胞、肝脏干细胞和神经干细胞中等。
[0069] 接种的较优选择是在细胞外基质的粗糙面上进行接种，因为粗糙面的胶原纤维结 构更加疏松，能够更好的为细胞的生长增殖提供三维立体空间。加之步骤一中的碱液浸泡 疏松了胶原纤维（胶原膜）的结构，使得到的细胞外基质具有更加适宜细胞生长增殖的立 体空间，最终使得细胞易于紧密粘附在细胞外基质上，甚至引导细胞长入其中。另外，此接 种方法也增加了使细胞对细胞外基质的粘附性，并在其的表面形成复层化的细胞膜，如图 2A、图2B、图2C(细培养后的胞外基质表面的细胞膜呈复层化）和图3所示，在碱液处理后 的细胞外基质表面紧密粘附了多层细胞，内部浅层也分布了一定量的细胞）。
[0070]步骤五、冻干包装和灭菌：将培养完成的样品进行冻干，控制冻干程序以5~ 12°C /min的速率降至-80~-20°C，保持1~4小时后，冷冻干燥10~24小时，得到冻干 后的样品。对样品进行包装，再次10~25kGy钴60辐照灭菌后得到皮肤溃疡修复基质。 [0071] 通过该方法得到的皮肤溃疡修复基质，移植后产品中的丰富的细胞因子首先发挥 作用，调节创面不利细胞和组织再生的微环境，解除微循环毛细血管痉挛，从而促进上皮再 生修复和皮肤血管重塑。此时，细胞外基质的作用主要是保护创面，保持湿润环境，释放细 胞因子等。当有新生血管和肉芽组织出现后，细胞外基质的作用便突显出来，其天然的三维 立体结构能够有效的引导细胞长入，能够保护促进创面愈合，并能够防止形成的胶原纤维 过度累积，较少瘢痕的形成，愈合的创面与正常皮肤的弹性和韧性相近。
[0072] 以下结合实例对本发明技术方案做进一步的详细说明。
[0073] 实施例1
[0074] 将牛心包膜进行脱细胞处理清洗完成后，在室温条件下用1M氢氧化钠溶液浸泡 5min，之后用大量的0.01M PBS溶液进行清洗至pH为7左右。此时牛心包膜厚度增加了 3~4倍。然后将牛心包膜浸没在PBS溶液中2h〇将牛心包膜剪切成10cm的圆形，lOkGy 钴60辐照灭菌后备用。
[0075] 按9:1的体积比将DMEM/F12商用培养液与10%的胎牛血清混合为基础液；再按 500ml基础液标准加入胰岛素50ng，转铁蛋白30mg，亚硒酸钠10 y g，氢化可松60 y g，表皮 细胞生长因子20 y g，碱性成纤维细胞生长因子40ng，转化生长因子0 20ng，腺嘌呤10mg， 维生素C 30mg。
[0076] 将灭菌后的牛心包膜平铺在直径为10cm的无菌培养皿上，轻轻按压使其完全贴 附在培养皿底部。取于新生儿脐带，以传代培养至2~6代的脐带间充质干细胞为种子细 胞，按5X10 5/cm2的接种密度在牛心包膜粗糙面上进行接种。接种时先用2ml的无菌注射 器刺入牛心包膜1_，每次注入0. 5ml，针孔密度为0. 5个/cm2,多个点均匀接种，然后将细 胞液滴在牛心包表面，轻轻振荡使其均匀覆盖在牛心包上。加入适量配制的培养基a使其 刚刚浸没牛心包膜，贴壁生长2小时，然后再补加培养基a使其液面距离牛心包膜表面lcm 左右，放入37°C 5% 0)2培养箱中进行振荡培养，培养1天，之后更换培养基b，淹没牛心包 膜，培养2天后更换为培养基c，液面与牛心包膜平齐，继续培养1天后更换为培养基d，同 样浸没牛心包膜，培养2天。培养期间每天换液。
[0077] 用无菌PBS溶液反复清洗培养完成的牛心包膜，然后控制冻干程序以5°C/min的 速率降至-80°C，保持1小时后，冷冻干燥10小时。冻干后进行包装，再次lOkGy钴60辐照 灭菌后得到皮肤溃疡修复基质。
[0078] 实施例2
[0079] 将牛心包膜进行脱细胞处理清洗完成后，在室温条件下用1%。次氯酸钠溶液浸泡 2h，之后用大量的0. 05M PBS溶液进行清洗至pH为7左右。此时牛心包膜厚度增加了3~ 6倍。然后将牛心包膜浸没在PBS溶液中6h。将牛心包膜剪切成10cm的圆形，25kGy钴60 辐照灭菌后备用。
[0080] 按9:1的体积比将DMEM/F12商用培养液与10%的胎牛血清混合为基础液；再按 500ml基础液标准加入胰岛素60ng，转铁蛋白50mg，亚硒酸钠20 y g，氢化可松100 y g，表皮 细胞生长因子20 y g，碱性成纤维细胞生长因子50ng，转化生长因子0 40ng，牛垂体提取液 5mg，维生素 C 50mg。
[0081] 将灭菌后的牛心包膜平铺在直径为10cm的无菌培养皿上，轻轻按压使其完全贴 附在培养皿底部。以由人皮肤经胰蛋白酶处理、分离并体外培养的表皮干细胞为种子细胞， 按IX 104/cm2的接种密度在牛心包膜粗糙面上进行接种。接种时先用2ml的无菌注射器刺 入牛心包膜0. 5_，每次注入0. 6ml，针孔密度为0. 3个/cm2,多个点均匀接种，然后将细胞 液滴在牛心包表面，轻轻振荡使其均匀覆盖在牛心包上。加入适量配制的培养基a使其刚 刚浸没牛心包膜，贴壁生长2小时。然后再补加培养基a使其液面距离牛心包膜表面lcm 左右。放入37°C 5% 0)2培养箱中进行振荡培养。培养2天，之后更换培养基b，淹没牛心 包膜，培养1天后更换为培养基c，液面与牛心包膜平齐，继续培养2天后更换为培养基d， 同样浸没牛心包膜，培养2天。培养期间每天换液。
[0082] 用无菌PBS溶液反复清洗培养完成的牛心包膜，然后控制冻干程序以12°C /min的 速率降至-20°C，保持4小时后，冷冻干燥24小时。冻干后进行包装，再次25kGy钴60辐照 灭菌后得到皮肤溃疡修复基质。
[0083] 实施例3
[0084] 将猪腹膜进行脱细胞处理清洗完成后，在室温条件下用1 %次氯酸钠溶液浸泡 lh，之后用大量的0. 05MPBS溶液进行清洗至pH为7左右。此时猪腹膜厚度增加了4~7 倍。然后将猪腹膜浸没在PBS溶液中6h。将猪腹膜剪切成10cm的圆形，10kGy钴60辐照 灭菌后备用。
[0085] 按9:1的体积比将DMEM/F12商用培养液与10%的新生牛血清混合为基础液；再 按500ml基础液标准加入胰岛素10ng，转铁蛋白lmg，亚硒酸钠1yg，氢化可松600yg，表 皮细胞生长因子1yg，碱性成纤维细胞生长因子l〇〇ng，转化生长因子0 100ng，HRG15mg， 维生素C100mg。
[0086] 将灭菌后的猪腹膜平铺在直径为10cm的无菌培养皿上，轻轻按压使其完全贴附 在培养皿底部。以体外培养脐带血干细胞为种子细胞，按10Xl〇7cm2的接种密度在猪腹膜 粗糙面上进行接种。接种时先用2ml的无菌注射器刺入牛心包膜0. 2_，每次注入lml，针 孔密度为0. 4个/cm2,多个点均匀接种，然后将细胞液滴在猪腹膜表面，轻轻振荡使其均匀 覆盖在猪腹膜上。加入适量配制的培养基a使其刚刚浸没猪腹膜，贴壁生长2小时。然后 再补加培养基a使其液面距离猪腹膜表面lcm左右，放入37°C5%C02培养箱中进行振荡 培养，培养2天，之后更换培养基b，淹没猪腹膜，培养1天后更换为培养基c，液面与猪腹膜 平齐，继续培养2天后更换为培养基d，同样浸没猪腹膜，培养1天。培养期间每天换液；
[0087] 用无菌PBS溶液反复清洗培养完成的猪腹膜，然后控制冻干程序以8°C/min的速 率降至-40°C，保持3小时后，冷冻干燥16小时。冻干后进行包装，再次25kGy钴60辐照灭 菌后得到皮肤溃疡修复基质。
[0088] 实施例4
[0089] 将猪真皮进行脱细胞处理清洗完成后，在室温条件下用1M氢氧化钾溶液浸泡lh， 之后用大量的〇. 05M PBS溶液进行清洗至pH为7左右。此时猪真皮厚度增加了 2~4倍。 然后将猪真皮浸没在PBS溶液中4小时。将猪真皮剪切成10cm的圆形，15kGy钴60辐照灭 囷后备用。
[0090] 按9:1的体积比将DMEM商用培养液与10%的新生牛血清混合为基础液；再按 500ml基础液标准加入胰岛素lng，转铁蛋白10mg，亚硒酸钠5 y g，氢化可松80 y g，表皮细 胞生长因子15 y g，碱性成纤维细胞生长因子30ng，转化生长因子0 70ng，血小板衍生因子 5mg，维生素 C 80mg。
[0091] 将灭菌后的猪真皮平铺在直径为10cm的无菌培养皿上，轻轻按压使其完全贴附 在培养皿底部。以新生儿包皮经酶消化处理、分离体外培养得到的成纤维细胞为种子细胞， 按5X10 6/cm2的接种密度在猪腹膜粗糙面上进行接种。接