种时先用2ml的无菌注射器刺入 猪真皮0. 3mm，每次注入0. lml，针孔密度为0. 1个/cm2,多个点均匀接种，然后将细胞液滴 在猪真皮表面，轻轻振荡使其均匀覆盖在猪真皮上。加入适量配制的培养基a使其刚刚浸 没猪真皮，贴壁生长2小时，然后再补加培养基a使其液面距离猪真皮表面lcm左右。放入 37°C 5 % 0)2培养箱中进行振荡培养，培养1天，之后更换培养基b，淹没猪真皮，培养1天 后更换为培养基c，液面与猪真皮平齐，继续培养2天后更换为培养基d，同样浸没猪真皮， 培养1天。培养期间每天换液；
[0092] 用无菌PBS溶液反复清洗培养完成的猪真皮，然后控制冻干程序以6°C /min的速 率降至-60°C，保持3小时后，冷冻干燥20小时。冻干后进行包装，再次15kGy钴60辐照灭 菌后得到皮肤溃疡修复基质。
[0093] 实施例5
[0094] SD大鼠10只，体重200~250g，雌雄各半，分笼饲养3d (英文day的简写，"天"的 意思），烫伤前一天禁食，并以戊巴比妥钠（35mg/kg)腹腔注射麻醉，背部剃毛，擦干皮肤。 以脊柱为中线，在大鼠的背部两侧分别用自控手持烫伤仪制造直径为2cm的圆形创面，烫 伤温度为80°C，烫伤时间为5s。同时腹腔注射10mL林格氏液抗休克，分笼饲养。经组织病 理学检查得知烫伤程度为深II度。烫伤3d后去除坏死皮肤组织，对创面进行处理，然后将 复水后的皮肤溃疡修复基质（材料组）和未接种细胞的牛心包膜（对照组）剪裁成适合 的尺寸，分别覆盖在创面上，缝合，打包固定。腹腔内注射含青霉素的生理盐水（20000IU/ mL) 0. 2mL预防感染，大鼠分笼饲养。
[0095] lw (材料组，图4A;对照组图4B，w为周的英文week的简写）和3w (材料组图4C ; 对照组图4D)后拍照结果显示：
[0096] 在移植后lw，材料组能与大鼠的自体皮肤较好的融合，随着时间延长，移植物中毛 细血管的数量逐渐增多，3w后基本愈合，瘢痕较少。对照组未完全愈合，移植区瘢痕形成，颜 色较深。结果表明材料组在烧/烫伤创面愈合过程中能促进创面愈合、减少瘢痕形成。
[0097] 观察应用材料组合对照组后创面的愈合时间、创面愈合率、创面的炎症反应以及 有无过敏反应等情况。其中创面愈合率的计算时间点选取术后11天、18天、25天进行，计 算公式为：
[0098] 固定时间创面愈合率=(治疗前创面面积一固定时间创面面积）/治疗前创面面 积 X100%o
[0099] 在观察过程中材料组前期炎症反应较小，无过敏反应出现，创面愈合时间和愈合 率结果如表1所示。表明应用材料组后创面的平均愈合时间为18天，对照组为25天。应 用材料组的创面修复效果明显优于对照组。
[0100] 表1.深II度烧/烫伤创面愈合时间和愈合率
[0101]
【主权项】
1. 一种皮肤溃疡修复基质的制备方法，其特征在于：采用脱细胞、去抗原和增厚处理 后的天然细胞外基质作为生物支架，复合种子细胞在天然细胞外基质表面形成具有2~10 层的多层细胞的细胞膜，经冷冻干燥处理后即得皮肤溃疡修复基质； 所述种子细胞是自体或同种异体来源的成纤维细胞或干细胞。2. 根据权利要求1所述的皮肤溃疡修复基质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 步骤一、细胞外基质的制备：将完成脱细胞去抗原和灭活处理的胶原膜组织用碱液 浸泡进行增厚处理，然后用〇. 01~〇. 05M PBS溶液进行清洗至pH为6~7为止，并用所述 PBS溶液浸泡1~6小时得到细胞外基质，然后用10~25kGy钴60辐照灭菌后备用； 2) 步骤二、培养基的配制： 2. 1)、配制基础液：按9:1的体积比将DMEM/F12商用培养液与胎牛血清或新生牛血清 混合为基础液； 2. 2)、配制基础培养基：按500ml所述基础液标准加入胰岛素1~100ng，转铁蛋白1~ 50mg，亚硒酸钠1~30 y g，氢化可松10~600 y g，表皮细胞生长因子1~20 y g，碱性成纤 维细胞生长因子1~l〇〇ng，转化生长因子P 1~100ng，维生素C 1~100mg，配制成基础 培养基； 2. 3)、配制培养基：向所述基础培养基中分别添加牛垂体提取液10~30 y g/ml、腺嘌 呤1~50mg、HRG 50~300ng/ml和血小板衍生因子1~20ng/ml，分别配制成以下四种不 同的培养基： 培养基a :基础培养基+牛垂体提取液10~30 y g/ml ; 培养基b :基础培养基+腺嘌呤1~100 y g /ml ; 培养基c :基础培养基+HRG 50~300ng/ml ; 培养基d :基础培养基+血小板衍生因子1~20ng/ml ; 其中，所述牛垂体提取液、腺嘌呤、HRG和血小板衍生因子的浓度为终浓度； 3) 步骤三、种子细胞的分离和体外培养：采用组织贴壁法从所需的组织中进行种子细 胞的分离，或采用酶消化法从所需的组织中进行种子细胞的分离，或用差速贴壁法从所需 的组织中进行种子细胞的分离； 并用F12或MEM或DMEM或RPMI-1640培养基混合5%~20%的胎牛血清进行体外传代 培养，培养温度为25~38 °C，3%~7%的CO2浓度； 4) 步骤四、接种细胞和三维培养：在无菌环境下，按I X IO4~10X 10 6个/cm 2的接种 密度在所述步骤一制备的细胞外基质上进行细胞接种，接种时刺入所述细胞外基质〇. 2~ Imm进行接种，每次注入0. 1~1. 0 ml，针孔密度为0. 1~0. 5个/cm2,并在所述细胞外基质 表面进行点状接种，然后通过轻微振荡使所述种子细胞均匀分布在所述细胞外基质表面； 在37°C、5%的0)2培养箱中，使接种后的细胞外基质完全浸没于培养基a中，培养1~ 2天，之后更换培养基b，浸没所述接种后的细胞外基质，培养1~2天后更换为培养基c，培 养基c液面与所述接种后的细胞外基质平齐，继续培养1~2天后更换为培养基d，同样浸 没所述接种后的细胞外基质，培养1~2天；培养期间每天换液； 5) 步骤五、冻干包装和灭菌：将所述步骤三培养完成的样品进行冻干，控制冻干程序以 5~12°C /min的速率降至-80~-20°C，保持1~4小时后，冷冻干燥10~24小时，之后 进行包装，再以10~25kGy钴60辐照灭菌后即得皮肤溃疡修复基质。3. 根据权利要求2所述皮肤溃疡修复基质的制备方法，其特征在于：所述碱液浸泡处 理系指在室温条件下，用IM碱溶液浸泡5~30min，或用1%。~1%的次氯酸钠浸泡1~2 小时，进行浸泡处理，使所述胶原膜组织的厚度增加2~7倍。4. 根据权利要求3所述皮肤溃疡修复基质的制备方法，其特征在于：所述碱溶液是氢 氧化钠碱溶液、碳酸氢钠碱溶液，碳酸钠碱溶液和氢氧化钾碱溶液中的任一种。5. 根据权利要求3所述皮肤溃疡修复基质的制备方法，其特征在于：所述胶原膜组织 的厚度增加3~5倍。6. 根据权利要求2所述的皮肤溃疡修复基质的制备方法，其特征在于：所述步骤一中 在制备的所述细胞外基质上均匀打孔处理后，然后用10~25kGy钴60辐照灭菌后备用； 所述孔的孔径为〇. 5~2_，所述孔的孔密度为0. 2~1个/cm2,灭菌后备用。7. 根据权利要求2所述的皮肤溃疡修复基质的制备方法，其特征在于：所述胶原膜组 织是同种异体皮肤和羊膜中的任一种； 或牛、猪来源的皮肤、心包膜和腹膜中的任一种。8. 根据权利要求1或2或3或5或6或7所述的皮肤溃疡修复基质的制备方法，其特 征在于：所述干细胞是脐带间充质干细胞、脐血间充质干细胞、皮肤干细胞、口腔黏膜干细 胞和牙髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、造血干细胞、肝脏干细胞、 神经干细胞中的任一种。
【专利摘要】本发明提供了一种皮肤溃疡修复基质的制备方法，采用脱细胞、去抗原和增厚处理后的天然细胞外基质作为生物支架，复合种子细胞在天然细胞外基质表面形成具有多层细胞的细胞膜，经冷冻干燥处理即得皮肤溃疡修复基质,实现了细胞外基质表面细胞复层化和细胞外基质内部部分细胞长入的效果，能够有效保护促进创面的修复，较少瘢痕的形成,制备周期短，工艺简单，适合产业化，适用范围宽，创面修复效果好，愈合的创面与正常皮肤的弹性和韧性相近。采用冻干灭菌处理，不仅保证了产品具有预期的使用效果，并且能够延长保质期，大大降低了运输和储存的要求。
【IPC分类】A61L27/60, A61L27/38, A61L27/36
【公开号】CN105013013
【申请号】CN201510454579
【发明人】姚远
【申请人】陕西博与再生医学有限公司
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月29日