一种辅助iPS-RPE移植的层粘连蛋白膜的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种蛋白膜，尤其涉及一种辅助iPS-RPE移植的层粘连蛋白膜。
【背景技术】
[0002]难治性视网膜病变是一类视网膜组织损伤或退行性疾病，包括老年黄斑变性、Stargardt病和视网膜色素变性等，在我国50岁以上人群中患病率达20%以上，已经成为我国日益突出的主要致盲眼病，其共同病理特征为视网膜色素上皮细胞(RPE细胞)变性和死亡，导致失明。干细胞技术的发展使新的RPE细胞替代缺失或变性RPE细胞成为可能。
[0003]然而细胞移植后，即使应用了免疫抑制剂，移植细胞也无法长期存活，临床疗效不显著，现在仍无法广泛推广应用。动物模型发现在视网膜下腔移植7天后存活率仅有约
0.01% (20万个ES细胞来源的细胞移植后发现仅有数百个细胞存活)。
[0004]移植细胞难以存活的重要原因之一是:干细胞是在实验室培养皿扩增的，一旦移植到体内特定位点就有增殖困难。这是因为新环境充满复杂的未知因素，移植的干细胞通常会死亡，或不能正确整合到周边组织中。近期研究表明，水凝胶可促进干细胞治疗效果，但其主要成份是透明质酸和甲基纤维素，仍存在异源性及降解的问题。因此开发新生物材料技术，成为提高干细胞治疗效力的有效手段。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种辅助iPS-RPE移植的层粘连蛋白膜，作为iPS-RPE的移植载体，以期促进移植后细胞的贴附和存活，提高干细胞治疗致盲性眼病的成功率。本发明还提供了由该层粘连蛋白膜制得的iPS-RPE细胞膜片，本发明还提供了所述层粘连蛋白膜在制备细胞载体中的用途。
[0006]为实现上述目的，所采取的技术方案:一种辅助iPS-RPE移植的层粘连蛋白膜，所述层粘连蛋白膜是通过交联剂将层粘连蛋白在溶液中交联后干燥而得的。
[0007]优选地，所用的交联剂为戊二醛。海绵状胶原生物膜片的内孔隙形成原理为其均质浆液中的液体在冷冻交联过程中形成的冰晶所决定，因为血清蛋白分子具有很强的粘稠性，高密度、高质量胶原生物膜的化学制作思路以及操作困难之处在于如何将粘稠的物质形成可流动性的均质浆液，为此如何能将长胶原纤维从均质浆液中析出形成高浓度的纤维本体是本发明的关键，添加戊二醛是本发明独特的技术。
[0008]优选地，所述戊二醛在所述溶液中的浓度为5mg/mL。
[0009]优选地，所述交联温度为4°C，所述交联时间为24小时。
[0010]优选地，所述干燥温度为50 0C，干燥时间为48小时。
[0011]优选地，所述层粘连蛋白膜的孔隙大小为20?80微米。更优选为20-60微米，最佳值为25微米。
[0012]本发明还提供了一种iPS-RPE细胞膜片，所述iPS-RPE细胞膜片是通过将iPS-RPE细胞接种于上述所述的辅助iPS-RPE移植的层粘连蛋白膜层粘连蛋白膜上后培养而得的。
[0013]优选地，在所述接种前，将所述层粘连蛋白膜先在浓度为70%?75%的乙醇溶液中浸泡，然后在DMEM中浸泡。在冷冻干燥程序中，膜片的灭菌消毒，以尽可能避免种植细胞后的由于膜片消毒不完全造成的污染问题。但膜片为自体血清来源的材料，高温高压及常规化学消毒方法易造成其降解。因此，本发明采用的措施为:将血清层粘蛋白膜先泡入乙醇溶液中24hr，再泡入DMEM中24hr后用于细胞的接种。酒精分子具有很强的渗透力，能穿过细菌表面的膜，进入细菌内部，使构成细菌生命基础的蛋白质凝固，将细菌杀死。酒精的浓度不同，用途也会有所区别。本发明采用70%-75%的酒精用于消毒，这是因为过高浓度的酒精会在细菌表面形成一层保护膜，阻止其进入细菌体内，难以将细菌彻底杀死；若酒精浓度过低，则虽可进入细菌，但不能将其体内的蛋白质凝固，同样也不能将细菌彻底杀死。这里乙醇溶液的浓度为体积浓度。
[0014]本发明还提供了所述层粘连蛋白膜在制备细胞载体中的用途。本发明所述层粘连蛋白膜可以作为干细胞粘附支撑物，制备iPS-RPE细胞膜片，将制备的iPS-RPE细胞膜片用于视网膜下腔移植，用于治疗难治性视网膜病变，包括老年黄斑变性、Stargardt病和视网膜色素变性等。
[0015]本发明所述层粘连蛋白膜片能在3-6个月内完全降解吸收。所述iPS-RPE细胞膜片可应用于视网膜下腔注射的任何部位而且可以存活的细胞量较等量细胞悬液注射后高50%。所述iPS-RPE细胞膜片在防止或减少视网膜光感受器细胞的退行性改变中具有一定的用途。所述iPS-RPE细胞膜片具有防止或减少视网膜胶质瘢痕形成的用途。
[0016]本发明层粘连蛋白膜可以保存于水中，所述层粘连蛋白膜在水中的浓度优选为1% -4%,更优选为1.5-3%,最佳值为1.75-2%。这里所述百分值单位均为质量/体积。
[0017]总之，本发明提供一种使用自体血清层粘连蛋白为材料制作高浓度、高密度、微/无开放孔隙的可降解的层粘连蛋白膜的制备方法。可用于视网膜下腔移植干细胞，提供细胞黏附的着力点，提高细胞存活率，进而治疗难治性视网膜病变。
[0018]本发明的有益效果在于:本发明提供了一种辅助iPS-RPE移植的层粘连蛋白膜以及由该膜制得的iPS-RPE细胞膜片，所述层粘连蛋白膜可以促进损伤退变的视网膜细胞在提供的胶原支架上移行、分化、再生，形成自身相同的组织，同时干扰非序的成纤维细胞的增生形成瘢痕。本发明提高了自体血清层粘连蛋白生物材料的力学性能，可以在视网膜下腔移植，克服了现有技术因力学性能弱，免疫原性高，难以降解而使干细胞移植后存活率低的缺陷，有效修复病变的组织，提供新的治疗方法和思路，减少病人的痛苦。
【附图说明】
[0019]图1为本发明所述iPS-RPE细胞膜片的制备及使用流程图。
【具体实施方式】
[0020]为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0021]实施例1
[0022]本发明所述层粘蛋白的制备方法的一种实施例，所述制备方法如下:
[0023]同基因大鼠心脏取血，放置lOmin，100rpm离心20min，弃沉淀，留上层血清，去除乳糜粒，分离出血清层粘蛋白；凝胶层析提纯血清层粘蛋白，DEAE纤维素阴离子交换层析纯化血清层粘蛋白并浓缩，得到所述层粘蛋白。将浓缩后的血清层粘蛋白移入培养皿中静置于4摄氏度冰箱中至脱除气泡为止。
[0024]本发明所述辅助iPS-RPE移植的层粘连蛋白膜的制备方法的一种实施例，所述制备方法如下:
[0025]向上述制备的层粘蛋白溶液中加入戊二醛，所述戊二醛在所述溶液中的浓度为5mg/mL，再置入4摄氏度冰箱中交联24hr ;然后放入50摄氏度烘干箱中烘干48hr后取出，得到所述层粘蛋白膜。将所述层粘蛋白膜用蒸馏水冲洗干净密封于冰箱中备用。
[0026]本发明所述iPS-RPE细胞膜片的制备方法的一种实施例，所述制备方法如下:
[0027]将上述制备的层粘蛋白膜先泡入体积浓度为70%的乙醇溶液中24hr，再泡入DMEM中24hr后用于iPS-RPE细胞的接种；在经过上述处理后的层粘蛋白膜上种植iPS-RPE细胞，每2-3天更换培养液。2周后细胞开始黏附层粘连蛋白膜，形成典型的鹅卵石样单层色素上皮膜，此时更换无血清培养液，4周后细胞完全黏附于层粘连蛋白膜，得到所述iPS-RPE细胞膜片。
[0028]使用激光显微切割系统将iPS-RPE细胞膜片切成移植所需大小和形状，在视网膜下腔移植，如图1所示。
[0029]最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
【主权项】
1.一种辅助iPS-RPE移植的层粘连蛋白膜，其特征在于，所述层粘连蛋白膜是通过交联剂将层粘连蛋白在溶液中交联后干燥而得的。2.根据权利要求1所述的辅助iPS-RPE移植的层粘连蛋白膜，其特征在于，所用的交联剂为戊二醛。3.根据权利要求2所述的辅助iPS-RPE移植的层粘连蛋白膜，其特征在于，所述戊二醛在所述溶液中的浓度为5mg/mL。4.根据权利要求1所述的辅助iPS-RPE移植的层粘连蛋白膜，其特征在于，所述溶液是水。5.根据权利要求2所述的辅助iPS-RPE移植的层粘连蛋白膜，其特征在于，所述交联温度为4°C，所述交联时间为24小时。6.根据权利要求2所述的辅助iPS-RPE移植的层粘连蛋白膜，其特征在于，所述干燥温度为50°C，干燥时间为48小时。7.根据权利要求2所述的辅助iPS-RPE移植的层粘连蛋白膜，其特征在于，所述层粘连蛋白膜的孔隙大小为20?80微米。8.一种iPS-RPE细胞膜片，其特征在于，所述iPS-RPE细胞膜片是通过将iPS-RPE细胞接种于如权利要求1-6任一所述的辅助iPS-RPE移植的层粘连蛋白膜上后培养而得的。9.根据权利要求8所述的iPS-RPE细胞膜片，其特征在于，在所述接种前，将所述层粘连蛋白膜先在浓度为70%?75%的乙醇溶液中浸泡，然后在DMEM中浸泡。10.权利要求1-7任一所述的辅助iPS-RPE移植的层粘连蛋白膜在制备细胞载体中的用途。
【专利摘要】本发明提供了一种辅助iPS-RPE移植的层粘连蛋白膜以及由该膜制得的iPS-RPE细胞膜片，所述层粘连蛋白膜可以促进损伤退变的视网膜细胞在提供的胶原支架上移行、分化、再生,形成自身相同的组织，同时干扰非序的成纤维细胞的增生形成瘢痕。本发明提高了自体血清层粘连蛋白生物材料的力学性能,可以在视网膜下腔移植，克服了现有技术因力学性能弱，免疫原性高，难以降解而使干细胞移植后存活率低的缺陷，有效修复病变的组织，提供新的治疗方法和思路，减少病人的痛苦。
【IPC分类】A61L27/50, A61L27/22
【公开号】CN105013010
【申请号】CN201510398770
【发明人】刘奕志, 郑颖丰
【申请人】中山大学中山眼科中心
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月7日