专利名称：一种含ldv序列短肽的聚乙二醇化衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含阻断FN及VCAM-I等配体与整合蛋白α4β 1结合的关键序列 LDV短肽的聚乙二醇化衍生物，属于医药技术领域。
背景技术：
整合蛋白α 4β 1主要表达在淋巴细胞、嗜酸性粒细胞等炎症细胞表面，其与配体纤维粘连蛋白(FN)、血管细胞粘附分子-I(VCAM-I)的相互作用是炎症启动和发展过程中的关键步骤，在许多慢性炎症和自身免疫性疾病如哮喘、类风湿性关节炎、多发性硬化症、 炎性肠道疾病中发挥重要作用。干扰整合蛋白α 4β1与配体的结合可达到治疗许多慢性炎症和自身免疫性疾病的目的。LDV(Leu-Asp-Val)是FN、VCAM-I与整合蛋白α 4 β 1结合的关键序列，近年来整合蛋白α 4β1的肽类拮抗剂研究较多以LDV序列为基础进行。但是，与其它肽类药物的性质相似，目前已经合成的众多整合蛋白α 4β 1拮抗肽由于分子量小，易被清除和酶解破坏，其体内代谢时间很短，较大的治疗剂量和频繁、较短的给药时间间隔可能成为其应用的
重要障碍。利用聚乙二醇(Polyethlene glycol, PEG)修饰可以增加蛋白质和多肽药物的稳定性、延长血浆半衰期、增加生物利用度等性能，我们进行了 LDV及其相关肽的PEG修饰研究工作。研究提示，对于基于配体序列设计合成的LDV及其衍生的整合蛋白α4β 1拮抗肽， 由于能够部分解释整合素-配体相互作用的结构特征，因此其PEG修饰是可行的，甚至对提高药物生物利用度、降低给药剂量和延长给药间隔时间前景乐观。2004年，P印insky RB等报告了 PEG修饰LDV衍生物B0I5192及其构效关系分析的研究结果(ASpetOurnalS，2005，2 :742-750)。研究表明，修饰产物血浆半衰期明显增加 (修饰前后分别为1. Ih和17. 9h)、清除率显著降低(修饰前后分别为426ml/h/kg和6. 2ml/ h/kg)。未经修饰的B0I5192在S. C途径给药时对EAE模型的实验治疗有效剂量高达30mg/ kg，而BI05192的PEG修饰产物剂量降低至每周lmg/kg仍可维持锁定整合蛋白α 4β 1功能的水平。P印inskyRB等的研究验证了对LDV及其衍生的整合蛋白α 4 β 1拮抗肽进行PEG 修饰的可行性。分析蛋白类药物PEG修饰的既往研究资料，对同一被修饰对象，PEG修饰位点、共价连接PEG的数量及PEG的种类，都可能对修饰产物活性产生较大影响。并且，在被修饰物和PEG之间，PEG分子量越大，可能引起修饰产物的活性下降越多，被修饰物分子量越小则其活性部位被屏蔽的可能性越大。根据以上分析，适当分子量PEG及种类的选择是保证有效延长被修饰物半衰期， 增加被修饰物生物活性，同时避免被修饰物活性部位被较多屏蔽的首要因素。另一方面， Pepinsky RB等以LDV衍生物氨基基团作为修饰位点的PEG修饰方案仍存在反应条件不易控制，以及影响修饰产物产率及纯度、增加合成(生产)成本等不利因素。
发明内容
本发明的目的是提供一种含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物，为科学研究和临床治疗提供一种新的结构简单，合成反应条件温和、简便、可控的药物分子或前体化合物， 也为肽类药物的改造和聚乙二醇化修饰研究提供新的方法和思路。本发明的技术解决方案是对采用化学合成和基因重组方法制备的含LDV序列短肽进行C末端的聚乙二醇定点修饰，获得具有较长体内半衰期和良好抗炎免疫药理活性的含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物。本发明的含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物由含LDV序列短肽和与含LDV序列短肽共价连接的聚乙二醇组成，其中的含LDV序列短肽具有下式结构X-Y1-Ile-Leu-Asp-Val-Y2-Y3-Z 或 X-Leu-Asp-Val-Y3-Z其中，X是H或Ac J1是Lys或Glu J2是Pro或Ala ;Y3是Cys或高Cys或Lys或 Arg或His，是PEG修饰的残基；Z是OH或NH2。本发明所说的含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物的制备方法，包括以下步骤用化学合成方法或基因工程方法制备供修饰的前体含LDV序列短肽；前体含LDV 序列短肽C端与聚乙二醇进行共价连接。本发明中的含LDV序列短肽的制备方法可使用本领域公知的任何方法进行制备， 此制备方法优选为固相和液相化学合成法。固相方法包括使用Fmoc或Boc保护的氨基酸， 用多肽合成仪或手工合成法进行氨基酸序列的合成，再经切除，经高效液相(HPLC)分离纯化，冻干，所得肽段为进行聚乙二醇修饰的中间体前体。本发明中的含LDV序列短肽也可用基因工程法制备，包括以下步骤(1)按含LDV序列短肽的氨基酸序列合成基因片段。(2)基因片段经连接，转化，筛选得到阳性菌株。(3)菌株经发酵，收集菌体，破壁，抽提得到包涵体。(4)包涵体裂解，分离得到粗品，经HPLC分离纯化，冻干，所得肽段为进行聚乙二醇修饰的中间体前体。 本发明的含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物，该聚乙二醇在含LDV序列短肽的C 端进行修饰，其特点是含LDV序列短肽的C端可以连接在聚乙二醇的一个末端或其两个末端。聚乙二醇的分子量范围为2000Da-80000Da，优选为5000Da_40000Da。本发明的含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物的制备方法包括以下步骤(1)制备或获得含迈克尔加成反应(Michael addition reaction)受体的聚乙二醇与含迈克尔加成反应给体的含LDV序列短肽；或含迈克尔加成反应给体的聚乙二醇与含迈克尔加成反应受体的含LDV序列短肽。(2)进行迈克尔加成反应，用其受体或给体的聚乙二醇和含LDV序列短肽进行反应，形成含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物，如含马来酰亚胺衍生的聚乙二醇与含半胱氨酸的含LDV序列短肽反应而形成产品。如果如本发明所述含LDV序列短肽结构中Y3是Cys或高Cys，则聚乙二醇是用硫醚键或双硫键共价结合；如果Y3是1^8，则聚乙二醇是用酰胺键或二级胺而共价结合；如果 Y3是His，则聚乙二醇是用组氨酸的咪唑环而共价结合；如果Y3是Arg，则聚乙二醇是通过杂环而连接的。
本发明的化合物是含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物，亦包括为进行聚乙二醇修饰而产生的新的中间体，是用于制备防治慢性炎症或自身免疫病的药物或药物的前体化合物。药代学研究证实，较大分子量mPEG修饰含LDV序列短肽较原型(前体)含LDV序列短肽血浆半衰期和相对生物利用度明显增高。mPEG修饰含LDV序列短肽对豚鼠和小鼠的实验性哮喘及其支气管EOS的浸润和渗出，对哮喘小鼠血清和BALF中Eotaxin水平、肺组织Eotaxin、CCR3蛋白及其mRNA的表达、病理组织学检查的炎症表现表现了较强的拮抗作用。在含LDV序列短肽等摩尔浓度剂量下，以及修饰物含原型含LDV序列短肽分别为1/9. 74 和1/4. 12时药效优于其原型(前体化合物)。修饰用mPEG分子量较大时产物活性较强。 实验肯定了 PEG修饰后产物相对生物利用度的增加，证明LDV类肽的PEG修饰达到了预期充分暴露配体结合部位、保留原化合物药理活性的合成目的。本发明取得了以下技术进步与未经聚乙二醇修饰的含LDV序列短肽前体比较，适当分子量的聚乙二醇修饰提高了含LDV序列短肽前体的体内半衰期和抗炎免疫药理活性。不同PEG修饰方法研究发现，与例如P印insky RB等进行的LDV衍生物B0I5192 的氨基修饰，以及其他不确定位点的聚乙二醇修饰技术(含氨基、羧基和巯基修饰)比较， 本发明所提供的在C端巯基修饰的含LDV序列短肽的聚乙二醇衍生物，反应条件便于控制， 合成修饰产物产率和纯度较高。如本发明提供的优选实施例中，在被修饰的含LDV序列短肽EILDVP的C端加入带巯基的Cys，采用Rink树脂合成后，用活化的mPEG_MAL进行巯基修饰，与N端氨基修饰比较，反应条件便于控制，合成修饰产物产率和纯度较高。并且本发明所提供的在C端的定点修饰，可克服不确定位点聚乙二醇修饰可能屏蔽前体化合物、尤其是分子量较小的肽类化合物活性部位的缺点。
图1是药代动力学实验A组=EILDVPY-125I的r值-浓度标准曲线。图2 是药代动力学实验 B 组EILDVP-Cys- (mPEG2000-MAL) -Y-125I 的准曲线。图3 是药代动力学实验 C 组EILDVP-Cys- (mPEG2__MAL) -Y-125I 的准曲线。
具体实施例方式除非特殊指明，本发明所用到但未明确阐述或简单阐述的技术和方法是指本技术领域通常使用的技术和方法，可以一般的按照本领域公知的技术和方法进行。除非特殊定义，本发明所用的术语是在有关技术领域中公知的术语。标准的化学符号及缩写符号可以与其全名互换使用。除非特殊指明，本发明中所用氨基酸为L-氨基酸。本发明中的缩写词具有下面的含义α 4 β 1 粘附分子整合素超家族成员，是α 4 (155kDa)和β 1 (150kDa)亚单位的非共价异源二聚体，主要表达在淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞等炎症细
r值-浓度标 r值-浓度标胞表面。 FN:纤维粘连蛋白
VCAM-I 血管细胞粘附分子-1
LDV 为NF、VCAM-I等配体与整合蛋白α 4β 1结合的关键序列，氨基酸序列为 -Asp-Val
EILDVP 含LDV序列的被修饰原型肽，为整合蛋白α 4 β 1识别FN的CSl区的基本氨基酸序列为Glu-IIe-Leu-Asp-Val-Pro PEG:聚乙二醇 mPEG:单甲氧基聚乙二醇 PEG-MAL 马来酰亚胺基聚乙二醇Val缬氨酸
Tyr酪氨酸
Leu亮氨酸
Ile异亮氨酸
Pro脯氨酸
Cys半胱氨酸
Glu谷氨酸
Asp天冬氨酸
Lys赖氨酸
Tyr酪氨酸
Ala丙氨酸
Leu亮氨酸
Ile异亮氨酸
Pro脯氨酸
Cys半胱氨酸
Glu谷氨酸
Asp天冬氨酸
Lys赖氨酸
Arg精氨酸
His组氨酸
Fmoc芴甲氧羰基
Boc叔丁氧羰基
DCC二环己基碳二亚胺
DIEA:N, N-二异丙基乙胺
DMAP:4-二甲氨基吡啶
HOBT:1-羟基苯并三氮唑
HBTU:2-(1Η-1-羟基苯并—
TFA三氟乙酸
Ts-Cl :对甲苯磺酰氯
EDT1,2-乙二硫醇
Et3N三乙胺
DMF二甲基甲酰胺
DCM二氯甲烷
TCA三氯乙酸
TIS三异丙基硅烷
NaI碘化钠RP-HPLC 反相高效液相色谱MS 质谱MALDI-T0F-MS 基质辅助激光吸收离子化飞行时间质谱tl/2 半衰期AUC:生物利用度TIS 三异丙基硅烷CL 清除率V(C)分布容积AHR 气道高反应性BALF 支气管肺泡灌洗液CCR3 =C-C趋化因子受体3Eotaxin 嗜酸粒细胞趋化子EOS 嗜酸性粒胞ELISA 联免疫吸附实验mRNA 信使核糖核酸OVA:卵白蛋白下述实施例代表本发明的说明性实施方案，但本发明不受这些实施例的限制。在本发明优选的实施例1和实施例2中，PEG化试剂为Fluka产品，Rink树脂、DCC、 HOBT、HBTU、TFA、NMM、Fmoc-保护氨基酸为上海吉尔生化产品，Ts-Cl、EDT、Et3N为常规购置的分析纯试剂。实施例1固相化学合成法制备供聚乙二醇修饰的前体C端半胱氨酸 EILDVP (EILDVA-Cys-NH2)和 C 端半胱氨酸 LDV (LDV-Cys-NH2)所采用的氨基酸包括Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Cys (Trt)-OH、Fmoc-Glu (OtBu) -0H> Fmoc-Tyr (tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH ；其中 tBu 为叔丁基(tert-butyl)、Trt为三苯甲基(trityl)，Fmoc为芴甲氧羰基。多肽序列的合成采用多肽合成仪(美国CS公司产品，CS136XT型)操作进行。操作步骤UDVA-Cys-NH2 和 KILDVA-Cys-NH2 的合成(以 DVA-Cys-NH2 为例，EILDVP-Cys-NH2 参照同样方法进行)(1)取 4g Rink Amide AM 树脂(0. 5mmol/g)，溶胀 20min ；(2)将所需 Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Val-OH 以及HBTU分别溶于65% DCM/DMF(v/v)制得浓度为1. 6mmol/L和1. 44mmol/L各的溶液，DIEA溶于65% DCM/DMF(v/v)制得浓度为3. 2mmol/L的溶液，分别加入对应的多肽合成仪的储存罐中，按照LDV-Cys的多肽顺序设定程序，从C端向N端次序连接；
3)抽掉溶胀的DMF溶液；
4)DMFX2X0.5min ；
5)20%哌啶 XlX5min ；
6)20%哌啶 XlX20min ；
7)DMFX2X0.5min
8)DCMX1X0. 5min
9)DMFX2X0.5min
10)仪器暂停，取少量树脂，参照Kziser法用茚三酮试剂检测(以下简称“检测) 生；
11)Fmoc-Cys(Trt)-OH8mmol, HBTU 7. 2mmol, DIEA 16mmol,2Xlh ；
仪器暂停，取少量树脂，检测呈阴性； 20%哌啶 XlX5min ； 20%哌啶 XlX20min ； DMFX2X0. 5min DCMX 1X0. 5min DMFX2X0. 5min
仪器暂停，取少量树脂，检测呈阳性； Fmoc-Val-OH 8mmol, HBTU 7. 2mmol, DIEA 16mmol,2Xlh ； DMFX2X0. 5min ；
仪器暂停，取少量树脂，检测呈阴性； 20%哌啶 XlX5min ； 20%哌啶 XlX20min ； DMFX2X0. 5min DCMX 1X0. 5min DMFX2X0. 5min 仪器暂停，取少量树脂，检测呈阳性；
Fmoc-Asp(otBu)-0H 8mmol, HBTU 7. 2mmol, DIEA 16mmol,2Xlh DMFX2X0. 5min ；
仪器暂停，取少量树脂，检测呈阴性； 20%哌啶 XlX5min ； 20%哌啶 XlX20min ； DMFX2X0. 5min DCMX 1X0. 5min DMFX2X0. 5min
仪器暂停，取少量树脂，检测呈阳性；
38)Fmoc-Leu-OH 8mmol, HBTU 7. 2mmol, DIEA 16mmol,2Xlh
(39)DMFX2X0. 5min ；(40)仪器暂停，取少量树脂，检测呈阴性；01)20%哌啶 XlX5min ；(42) 20 % 哌啶 X 1 X 20min ；(43)DMFX2X0. 5min ；(44)DCMX 1X0. 5min ；(45)DMFX2X0. 5min ；(46)仪器暂停，取少量树脂，检测呈阳性；(47) CH3OH 2 X 10ml，收缩并抽干直至颗粒状，称重为6. 87克；(48) RinkAmide AM树脂的切割将脱掉Fmoc的肽树脂置于IOOml茄型瓶中，加入 TFA TIS EDT 间甲酚=92. 5 2. 5 2. 5 2. 5，40ml，0°C，搅拌反应 90min。( 漏斗过滤，取滤液，旋转蒸发至无液体蒸出。向瓶中缓慢滴入无水冰乙醚，沉淀出白色物质， 3000r/min,离心3min，倒掉上清液用无水冰乙醚洗涤，再离心，反复3次，真空干燥得粗肽 0. 99g。2、合成产物的纯化RP-HPLC方法，C18半制备型色谱柱，流动相为A相水+0. 1% TFA, B相纯乙腈 +0. 1% TFA，采用线性梯度，流动相流速为3ml/min，检测波长为215nm。样品稀释后，取20 μ 1上样，采用B相梯度5 % -95 %，30min,流速为lml/min。HPLC 图谱得出峰时间，计算最佳出峰梯度(B流动相最佳梯度)和线性梯度。最佳出峰梯度=(出峰时间-柱体积)X(梯度差/总时间)+初梯度线性梯度=最佳出峰梯度士 5%根据以上计算的线性梯度，不同合成产物的纯化条件如下LDV-Cys-NH2 :B 相梯度为 10% 30%，时间为 20min。EILDVP-Cys-NH2 :B 相梯度为 20% 40%，时间为 20min。3、合成产物的分析和鉴定(I)HPLC 分析鉴定]采用Kr100-5-Cw分析型色谱柱。检测条件流动相为A液(0. 1 % TFA水溶液) 和B液(100%乙腈+0. TFA)，采用线性梯度，流动相流速为lml/min，检测波长为215nm。 面积归一法计算合成产物纯度。(2) MS分析鉴定]采用基质辅助激光吸收离子化飞行时间质谱(MALDI-T0F-MS)，委托湖北大学生命科学学院和 ChinaiTech Peptide Co.，Ltd 进行。分析鉴定结果见表1。实施例2含LDV序列短肽前体与聚乙二醇反应，合成含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物1、mPEG-MAL 的生成(以 mPE(i2(1(1(1-MAL 的生成为例，mPE(i5(1(1(1-MAL、mPEG2(1(1(1(1-MAL 的生成参照同样方法操作)(1)称取 mPEG2Q(1(1-0H40. OgQOmmol)，溶于 100ml CH2Cl2 中，搅拌溶解后加入 15ml 三乙胺和19g对甲基苯磺酰氯，室温下搅拌反应约他，以TLC检测反应完全后，旋转蒸发除去溶剂，加入IOOml无水乙醚沉淀出固体，得到mPEG2_-(yrS。(2)对得到的mPE(i2_-0TS进行纯化将粗品mPE(i2_-0TS溶于水，先使用分液漏斗用乙醚萃取对甲基苯磺酰氯，弃去乙醚层，再用CH2Cl2提取水中的mPE(i2_-0TS，弃去水层， 无水硫酸镁干燥，旋转蒸发除去CH2Cl2,加乙醚沉淀出mPEG2_-0TS，滤去乙醚，五氧化二磷真空干燥。产物不纯时可多次提纯。(3)取 18. Og mPEG2000-OTs 溶于 50ml DMF，加入 5g(27mol)邻苯二甲酰亚胺钾盐， 120°C反应4h。减压蒸去溶剂，将残余物溶于50ml无水乙醇，然后加入13. 5ml水合胼，回流反应4h。旋转蒸发去溶剂，将残余物溶于CH2Cl2,再用无水乙醚沉淀出固体。再以无水乙醇乙醚重结晶。得 mPEG2Q(1(1-NH214. 2g。(4)将5. Og mPEG2000-NH2溶于IOml 二氧六环，加入马来酸酐2. 0g，80°C搅拌反应 30min。减压蒸去溶剂，加入50ml无水乙醚，冷却沉淀出固体，过滤掉乙醚，干燥后所得固体溶于15ml乙酸酐，加入5. Og乙酸钠，100°C搅拌反应45min。减压蒸去溶剂，将残余物用 CH2Cl2溶解，滤去不溶物，在滤液中加入适量活性炭，放置30min，滤去活性炭，旋转蒸发除去CH2Cl2，加入无水乙醚，沉淀出mPEh.-MAL滤去乙醚，五氧化二磷真空干燥。产物不纯时可多次提纯。最终得到纯化的mPEG2_-MAL。2、多肽前体的PEG修饰经工艺优化，确定采用pH值8、反应时间au25°C、活化PEG与肽的用量为按1 1 摩尔比值为合成肽的PEG修饰条件。经RP-HPLC纯化EILDVP-Cys-NH2溶于少量水中，用NaHCO3调pH值至8， 分别加入适量的 mPEG2_-MAL、mPEG5000-MAL 和 mPEG2_-MAL 室温反应，用 RP-HPLC 监测反应进程，得 EILDVP-Cys (mPE(i2(1(1(1-MAL)-NH2、EILDVP-Cys (mPE(i5_-MAL)-NH2、 EILDVP-Cys (mPEG20000-MAL) -NH2 粗品。3、PEG修饰产物的纯化采用C18半制备型色谱柱，流动相为A液(水溶+0.1% TFA)和B液(乙腈 +0. TFA)，线性梯度，流动相流速为3ml/min，检测波长为215nm。B相梯度为5%到 95%, 30min 方法分离纯化 EILDVP-Cys (mPEG2000-MAL) -NH2, EILDVP-Cys (mPEG5000-MAL) -NH2, EILDVP-Cys (mPEG20000-MAL) -NH2。4、PEG修饰产物的分析和鉴定
(I)HPLC分析鉴定
检测条件同实施例1。
(2) MS分析鉴定
检测条件同实施例1。
分析鉴定结果见表1。
表1合成和修饰产物的基本条件、产率和HPLC、MS分析结果
权利要求
1.一种含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物，其特征在于由含LDV序列短肽和与LDV 序列短肽共价连接的聚乙二醇组成，其中的含LDV序列短肽具有下式结构X-Y1-Ile-Leu-Asp-Val-Y2-Y3-Z 或 X-Leu-Asp-Val-Y3-Z其中，X是H或Ac J1是Lys或Glu ;Y2是Pro或L-Pro或Ala ；Y3是Cys或高Cys或 Lys或Arg或His，是PEG修饰的残基；Z是OH或NH2。
2.根据权利要求1所述的含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物，其特征在于聚乙二醇在含LDV序列短肽的C端进行修饰。
3.根据权利要求1或2所述的含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物，其特征是聚乙二醇的分子量范围是从大于2000Da至小于或等于SOOOODa。
4.根据权利要求1或2或3所述的含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物，其特征在于脑啡肽类似物的C端可以连接在聚乙二醇的一个末端或其两个末端。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的化合物或含该化合物的组合物的应用，其特征在于用于制备防治慢性炎症和自身免疫性疾病药物或药物的前体化合物。
全文摘要
本发明公开了一种含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物，其制备方法，含它们的组合物。本发明的含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物由含LDV序列短肽和与含LDV序列短肽C端共价连接的聚乙二醇组成，其中含LDV序列短肽具有下式结构X-Y1-Ile-Leu-Asp-Val-Y2-Y3-Z或X-Leu-Asp-Val-Y3-Z以上结构中，X是H或Ac；Y1是Lys或Glu；Y2是Pro或Ala；Y3是Cys或高Cys或Lys或Arg或His，是PEG修饰的残基；Z是OH或NH2。本发明给出的含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物可用于制备防治慢性炎症和自身免疫性疾病的药物或药物的前体化合物。
文档编号C07K7/06GK102268067SQ20111018089
公开日2011年12月7日 申请日期2011年6月29日 优先权日2011年6月29日
发明者史子惠, 朱鸣阳, 甄晓兰, 赵铁华 申请人:河北师范大学