肽-白蛋白水凝胶的性能及其应用

肽-白蛋白水凝胶的性能及其应用
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年12月7日递交的，发明名称为肽-白蛋白水凝胶的性能及其应 用的美国临时专利申请No. 61/734, 708的权益，其全部内容以全文参考的方式引入本文。
[0003] 序列表
[0004] 本发明含有计算机可读形式（CRF)的序列表，在2013年12月4日以名称为"序列 表"的17. 6KB的ASCII格式文本文件递交。CRF的内容以全文参考的方式引入本文。
技术领域
[0005] 本发明涉及自组装的肽-白蛋白水凝胶。
【背景技术】
[0006] 使用肽水凝胶作为可注射的材料，用于组织工程以及其他生物工程的应用，是过 去几十年重要的发现。由于肽水凝胶具有高含水量和聚合物网络，是用于存储和转移蛋白 质而不显著损失其生物活性的很有前途的材料。溶胶_凝胶转变发生在肽分子自组装成能 聚拢水分子的结构明确的纳米纤维网时。因为这种转变发生在特定的温度和pH值下，肽水 凝胶前体可以液相注入人体内，并且当在生物体内生理条件（例如，pH，温度）变化时转变 成水凝胶，这对可注射应用非常重要。
[0007] 特别需要具有剪切稀化特性且具有快速恢复特性的可注射的水凝胶。这种水凝胶 应具有在剪切力的作用下急剧下降的储能模量，但当除去所述力后可以恢复。也需要形成 肽水凝胶的改进的方法，该方法避免了需要对水凝胶溶液进行化学或环境修饰来诱导水凝 胶的形成。

【发明内容】

[0008] 本发明广义地涉及自组装的、具有三维纳米纤维基质的肽-白蛋白水凝胶。所述 纳米纤维基质包含两未性的妝和白蛋白（基本上由两未性的妝和白蛋白组成或由两未性 的肽和白蛋白组成）。两亲性的肽包含一个末端疏水区域，一个中央转动区域以及一个末端 亲水区域。
[0009] 描述了形成肽-白蛋白水凝胶的方法。所述方法包括提供含有肽分散、溶解或悬 浮在溶剂体系中的肽溶液，以及在室温下混合白蛋白源与所述肽溶液，以形成肽-白蛋白 溶液。所述肽是两亲性的且包括一个末端疏水区域，一个中央转动区域和末端亲水区域。所 述肽和白蛋白自组装成肽-白蛋白水凝胶而不需要调节肽-白蛋白溶液的pH值、温度、盐 或尚子成分。
[0010] 本文也描述了使用肽-白蛋白水凝胶的方法，包括传递活性剂至患者的方法。所 述方法包括向患者施用本文描述的任何实施例的肽-白蛋白凝胶，其中所述活性剂被包裹 在水凝胶基质中。
【附图说明】
[0011] 图1显示了肽-白蛋白混合物的TEM图像：图la. h9e/BSA混合物，图lb. h9e/HSA 混合物；
[0012] 图2显示了 h9e/BSA水凝胶的机械性能的图；
[0013] 图3显示了 h9e/HAS水凝胶的机械性能的图；
[0014] 图4显示了在MEM中的肽的水凝胶化。A:提出了 MEM-诱导的h9e肽自组装水凝 胶化的机理（SEM图像显示了水凝胶基质的纳米纤维支架）。B和C:在37°C的条件下凝胶 化的lmM、2mM、和3mM的肽水凝胶的储能模量G'。D: ImM肽水凝胶的SEM图像。E: 3mM肽水 凝胶的SEM图像；
[0015] 图5显示了 h9e水凝胶的动态流变学研究。A: ImM、2mM、和3mM的肽水凝胶的剪切 稀化和恢复试验的储能模量G'。B:剪切应变从1 %至500%且间隔为1分钟、5分钟和10 分钟的四次振幅扫描试验。C:用移液管多次转移肽水凝胶；水凝胶被剪切稀化，但快速重 新组装，而不永久性破坏水凝胶结构。D:在4°C和50°C之间的lmM、2mM、和3mM的肽水凝胶 温度曲线试验；
[0016] 图6显示了 h9e-MSC水凝胶的动态流变学研究。A:水凝胶形成过程中ImM，2mM和 3mM的h9e-MSC水凝胶的G'。B:2mM h9e-MSC水凝胶的剪切稀化和恢复试验的G'和G"。C: 稀释20倍后的2mM的h9e-MSC水凝胶的G'和G" ；
[0017] 图7显示了 h9e-2i水凝胶的动态流变研究。A:水凝胶形成过程中ImM，2mM和3mM 的h9e-2i水凝胶。B:2mM h9e-2i水凝胶的剪切稀化和恢复试验的G'和G'。C:稀释20倍 后的2mM h9e-2i水凝胶的G'和G" ；以及
[0018] 图8显不了 h9e_2水凝胶和h9e溶液的稳定性。A.从第1天至第7天的h9e_2i 水凝胶的G'。在所述h9e溶液在4°C的冰箱储存1、6、18和24天后h9e-2i混合物形成水 凝胶。
【具体实施方式】
[0019] 本发明涉及自组装的水凝胶及其制备和使用方法。水凝胶基质网络包括构成三维 纳米纤维网络的水凝胶结构的肽和白蛋白。肽-白蛋白水凝胶的特征是水凝胶基质是"可 逆"的，即在三维纳米纤维基质被剪切稀化（即，随着作用在凝胶上的剪切应力的速度增加 粘度降低），凝胶破坏之后可以迅速恢复，如下面更详细讨论的。所述水凝胶在多种应用中 有用，包括用于组织工程的支架，三维（3-D)的细胞培养物，药物传递，以及包裹治疗剂（细 胞，分子，药物，化合物），可注射剂（包括原位凝胶，如止血组合物），伤口敷料，药物载体或 赋形剂，细胞移植，细胞储存，病毒培养，病毒储存等应用。
[0020] 肽-白蛋白水凝胶具有多孔结构和通孔的均匀互联网络形态。在扫描电子显微 镜下观察到，水凝胶基质的平均孔尺寸为约10 ym至约80 ym，优选约20 ym至约60 ym， 且更优选约30ym至约50ym。平均孔尺寸的范围为约50nm至约200nm。在透射电镜 (Transmission electron microscope)下测量，水凝胶肽以具有平均直径为约3nm至约 30nm，优选约5nm至约20nm，并且更优选约8nm至15nm的肽纳米纤维的形式存在。所述肽 纳米纤维具有约〇? 3 y m至约5 y m，优选约0? 8 y m至约3 y m，更优选约1 y m至约2 y m的 平均长度。
[0021] 肽-白蛋白水凝胶的储能模量（与凝胶强度有关）至少约50Pa，优选至少约 lOOPa，更优选为约lOOPa至约10,000Pa。可以理解通过改变所述肽和白蛋白的浓度，调节 到特定的水凝胶强度以用于期望的凝胶应用。例如，对于可注射的水凝胶，水凝胶基质将具 有约50Pa至约3000Pa，优选为从约70Pa至约lOOOPa的储能模量。在一些实施例中，例如 支架，可以形成很强的水凝胶，具有至少约300Pa，优选为约500Pa至约10, OOOPa，并更优选 为约lOOOPa至约5000Pa的储能模量。这些凝胶强度是基于中性pH值（约为7)和室温的 温度（又称为"常温"或约20-25°C )。
[0022] 如上所述，水凝胶基质是可逆的。这意味着，用足够强的机械力（例如，剪切稀化） 破坏凝胶之后，所述水凝胶在少于10分钟，优选少于约5分钟，更优选少于约2分钟（从 破坏的凝胶除去剪切应力后）的时间内具有至少约60%，优选至少约80%，更优选至少约 90%，甚至更优选约100%的恢复。如本文所使用的，水凝胶的" ％恢复"是当破坏凝胶后 然后重新水凝胶化得到的原始储能模量（凝胶破坏前）的百分比。换句话说，剪切稀化仅 暂时破坏凝胶结构或架构。剪切稀化可以使用多种能在水凝胶上施加剪切应变或剪切应力 的机械力，例如吹打，离心，震荡，注射，喷涂，过滤等来进行。如上所述，剪切稀化和破坏胶 体结构后（即，去除或停止作用在所述破坏的凝胶上的机械力后），凝胶的重组装或水凝胶 化迅速地再次发生。即使多次破坏凝胶后，这种恢复特性仍然存在。有利的是，剪切稀化后 破坏的基质也可以用溶剂稀释为基本上的液体溶液（例如，G'〈0.2Pa)从而停止恢复过程。 换句话说，当肽-白蛋白溶液稀释到肽浓度小于约〇. 1%重量，肽-白蛋白溶液保持在低粘 度液化形式，并且不发生迅速重新组装。这种技术利于从水凝胶中分离，例如从细胞的液态 肽-白蛋白溶液中分离（例如，通过离心）细胞或其他成分。这个过程可以通过在分离过 程将液化的和稀释的肽-白蛋白溶液保持在低的温度（约4°C )来增强。
[0023] 本发明的凝胶是水溶性的且在高达约90°C下温度稳定。如本文所用，"水溶性"指 凝胶在形成后可用水稀释，而"温度稳定"指该水凝胶在从约1°C至约90°C的温度范围内不 会变性。有利的是，不同于其他类型的凝胶，本发明的肽-白蛋白水凝胶的储能模量随温度 上升而增加。
[0024] 水凝胶是由肽与白蛋白源相结合而制备的。如本文所使用的，"白蛋白源"指一种 或多种类型的可以直接与肽结合的（纯化的）白蛋白、含有一种或多种类型的白蛋白的组 合物，以及白蛋白衍生物。
[0025] 根据本发明，在一个或多个实施例中，该方法包括形成或提供肽溶液。该肽溶液包 括（基本上由以下肽组成或甚至由以下肽组成），以至少约〇. 1%，优选为约〇. 1%至约5% (重量），更优选约〇? 3 %至约3. 5 % (重量），并且甚至更优选为约0? 5 %至约2 % (重量） 悬浮、分散、或溶解在溶剂体系中的肽，基于溶液的总重量按重量计为1〇〇%。干燥的（例 如，冷冻干燥）肽适用于本发明，并且可以与溶剂体系形成肽溶液。所述肽溶液具有从约6 至约8,优选为约6. 5至约7. 5,更优选为约7至约7. 5,并且甚至更优选为约7的pH值。适 合的溶剂体系包括碱性水溶液，如碳酸氢钠、氢氧化钠，氢氧化钾，及其混合物的水溶液。
[0026] 所述肽溶液与白蛋白源例如包括白蛋白的成分（基本上由白蛋白组成或甚至由 白蛋白组成的成分）组合。适合本发明使用的白蛋白的种类包括从植物或动物来源分离、 提取、和/或纯化的白蛋白、以及合成的白蛋白，如重组/转基因白蛋白（例如，在植物系 统中表达的人白蛋白）及其衍生物（例如，修饰的白蛋白，如生物素标记的，乙酰化的，糖 基化的，硝化的等）。白蛋白本身可直接加入到肽溶液，或者它可以作为包含白蛋白的成 分的一部分进行提供。这种成分的例子包括血清，含血清细胞培养基（例如，最低必需培 养基（Minnimum Essential Medium, MEM)，Dulbecco 氏改良 Eagle 培养基（Dulbecco' s modified Eagle's medium，DMEM)，罗斯韦尔公园纪念研究所培养基（Roswell Park Memorial Institute medium, RPMI)以及 Leibovitz 培养基，CMRL 1066 (Sigma)中以及和 类似培养基。在一个或多个实施例中，白蛋白源可以和溶剂体系混合，例如水，以形成含有 白蛋白（或白蛋白源）的溶液。然后将该溶液与肽溶液混合，优选在约室温下进行。所得 的肽-白蛋白溶液具有基本上约6至约8,优选约6. 5至约7. 5,更优选约7至约7. 5,并且 进一步优选约7的中性pH值。
[0027] 白蛋白的用量至少为约0? 1% (重量），优选约0.5%至约20% (重量），更优选约 1%至约10% (重量），基于肽-白蛋白溶液的总重量