流变温 度分布试验来应对这个挑战。在两个测试周期中，将温度从4°C调整到50°C。图?显示了 水凝胶的G'随温度变化，在50°C比4°C高2-3倍。根据水凝胶加热和冷却周期，这种热反 应是可逆的（图f5D)。该结果为使用这种肽水凝胶作为三维细胞培养的基质提供了支持： 当保持在37°C时，该水凝胶基质可变硬用于细胞包裹，但在4°C使用标准离心法分离细胞 时该水凝胶基质可变软。
[0091] B.干细胞培养基中的肽-培养基水凝胶
[0092] 两种不同类型的干细胞培养基被选择用于此试验。一种用于间充质干细胞的含 2% (体积/体积）胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS)的低葡萄糖DMEM培养基（MSC培 养基）。另一种是用于小鼠胚胎干细胞的含0.5% (体积/体积）牛血清白蛋白（BSA)的 N2B27补充性的无血清2i培养基（ESC，2i培养基）。在时间扫描流变测试下监控水凝胶形 成过程1小时。并测试了 h9e肽水凝胶的特殊剪切稀化和自愈性能。当水凝胶稳定后，加 入更多的细胞培养基以稀释水凝胶20倍；储能模量（G'）的数据被用来证明这种水凝胶体 系的细胞恢复能力。此外，测试了水凝胶以及水凝胶形成之前的肽溶液的稳定性。
[0093] 1.肽合成和水凝胶化
[0094] 该h9e肽根据上述方法合成。将冻干的肽加入至100mM碳酸氢钠中，通过磁力搅 拌3小时至完全溶解，最终肽的浓度为10mM。对于水凝胶化，将肽溶液加入到MSC培养基或 2i培养基中并将混合物手工摇动约10秒或轻轻吹打混合3次。最终的肽浓度为 和 3mM。
[0095] 2?流变试验
[0096] h9e水凝胶的储能模量和损耗模量（G'和G"，分别地）在37°C用具有20mm直径的 平行板几何形状和500 y m间隙大小用C-V0R150流变仪系统（马尔文仪器，马尔文，伍斯特 郡WR141XZ，英国）进行测定。用于水凝胶形成试验和剪切稀化及自愈试验的方法与上述癌 细胞培养基的方法相同。水凝胶形成后24小时，通过加入细胞培养液将2mM的肽水凝胶稀 释20倍，并用移液器使其充分混合。将稀释液移至流变仪系统并在1Hz的频率和1 %的剪 切应变及4°C的条件下，测试1小时。
[0097] 测试h9e_2i培养基水凝胶的稳定性。放置一塑料托盘在孔板的底部。然后，1 % (重量）h9e溶液与2i培养基以1:1 (体积：体积）的比例放入离心管中，然后转移到孔板 中。每个孔含500 yL肽水凝胶。然后将此孔板放置在培养箱中1小时。当水凝胶稳定后， 缓慢地向水凝胶的顶部加入另外500 yL的2i培养基。每天更换顶端培养基。对于机械试 验，除去该顶端2i培养基，并用托盘将水凝胶转移到动态流变仪中。使用存储在4°C冰箱中 高达24天的lwt%的肽溶液用于测定肽溶液的稳定性。在第1，6,18和24天，将部分肽溶 液取出并与2i培养基以1:1 (体积：体积）混合。在使用1 %的剪切应变的单频监测（1Hz) 流变试验下，监测水凝胶的形成过程1小时。
[0098] 结果与讨论
[0099] 1. MSC培养基中的肽水凝胶形成
[0100] 将10mM h9e溶液与MSC细胞培养基以1:9,2:8和3:7(V/V)的比例混合，制备三 种浓度（lmM，2mM和3mM)的h9e-MSC水凝胶。混合后立即测定肽-培养基混合物的G'。图 6a显示了水凝胶的G'随肽浓度的增加而增加。ImM，2mM和3mM的h9e-MSC的水凝胶的稳定 的G'分别为70Pa，350Pa和800Pa。选择2mM的h9e-MSC水凝胶进行剪切稀化和重新愈合 试验（图6b)。将样品在室温下保存过夜，并在测量系统上稳定10分钟。在500%的剪切 应变条件下，水凝胶被破坏成G'低于0.2Pa的液体形式。当剪切停止1分钟后，大于90% 的凝胶强度得以恢复。在后续1小时的1 %剪切应变恢复试验中，水凝胶的机械强度在几分 钟内100%恢复（图6b)。为确定该h9e-MSC水凝胶的细胞恢复能力，将细胞培养基加入到 一个稳定的水凝胶中。用移液器彻底搅拌后，水凝胶中的肽浓度由2mM至0.1 mM被稀释20 倍。然后将稀释后的溶液转移到流变仪中进行单一频率的测试。图6c显示了在1个小时的 测试中，所述溶液的G'和G"均低于4Pa，表现为粘性极低的溶液。这种现象保证h9e-MCS 水凝可转化为液体形式，并允许三维细胞培养后分离细胞。
[0101] 2.在2i培养基中形成肽水凝胶
[0102] 三种浓度（lmM，2mM和3mM)的h9e-2i水凝胶的制备方法与h9e-MSC水凝胶的制 备方法相同。图7a显示了 ImM的G'约为lOOPa。在2i培养基中，肽浓度为2mM和3mM的 水凝胶各自具有相似的稳定的G'为600Pa。选择2mM的h9e-2i水凝胶使用如h9e-MSC水 凝胶描述的相同的方法进行剪切稀化和重新修复试验（图7b)。当水凝胶剪切成液态后 (G'〈0. 2Pa)，水凝胶的G'在剪切力停止后迅速恢复。在1小时的1 %剪切应变恢复试验中， 在几分钟内水凝胶的机械强度可以恢复为100% (图7b)。此外，我们还将2mM的h9e-2i 的水凝胶稀释至〇. ImM浓度，并表明该方法可以将h9e-2i的水凝胶转换成液体形式用于细 胞恢复（图7c)。
[0103] 此外，也测定了 h9e_2i水凝胶的稳定性。图8a显示h9e_2i水凝胶的G'可以稳 定在约为130-160Pa下7天。另一方面，在h9e溶液在4°C储存1，6,18和24天后，通过监 测h9e-2i混合物的水凝胶形成来测定h9e溶液的稳定性。图8b显示了经过24天储存后， 当与2i培养基混合时，所述h9e溶液仍然可以形成水凝胶，并表现出相同的水凝胶形成速 率和稳定的G'值。最近的一项研究表明，h9e液的稳定性可超过2个月。
【主权项】
1. 一种肽-白蛋白水凝胶，具有自组装的、三维纳米纤维基质，所述纳米纤维基质包括 两亲性的肽和白蛋白，其特征在于，所述肽包含末端疏水区域，中央转动区域和末端亲水区 域。2. 根据权利要求1所述的肽-白蛋白水凝胶，其特征在于，所述水凝胶是可逆的。3. 根据权利要求2所述的肽-白蛋白水凝胶，其特征在于，在通过剪切稀化破坏所述三 维纳米纤维基质后少于约10分钟内，所述水凝胶具有至少约60%的恢复。4. 根据权利要求1所述的肽-白蛋白水凝胶，其特征在于，所述水凝胶在大约7的pH 下和大约20至25°C的温度条件下，具有约50Pa至约1000 OPa的储能模量。5. 根据权利要求1所述的肽-白蛋白水凝胶，其特征在于，所述肽与白蛋白的重量比为 约 100:1 至约 1:100。6. 根据权利要求1所述的肽-白蛋白水凝胶，其特征在于，所述亲水区域源自蜘蛛拖丝 蛋白的0 -螺旋模体，并且所述疏水区域和转动区域源自二氢吡啶敏感的人肌肉的L-型钙 通道中的亚基IV的第三跨膜片段。7. 根据权利要求1所述的肽-白蛋白水凝胶，其特征在于，进一步包括包裹在所述三维 纳米纤维基质中的活性剂。8. 根据权利要求1所述的肽-白蛋白水凝胶，其特征在于，进一步包含细胞培养基和在 所述三维纳米纤维基质中培养的细胞。9. 一种形成肽-白蛋白水凝胶的方法，所述方法包括： 提供含有肽分散、溶解或悬浮在溶剂体系中的肽溶液，其中所述肽是两亲性的且包括 末端疏水区域，中央转动区域，和末端亲水区域；以及 在室温下混合白蛋白源与所述肽溶液以形成肽-白蛋白溶液，其中在不调节所述 肽-白蛋白溶液的PH、温度、盐或离子成分的条件下，所述肽和白蛋白自组装成为所述 肽-白蛋白水凝胶。10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的肽溶液的pH约为6到8。11. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述溶剂体系包括溶解在水中的选自碳 酸氢钠，氢氧化钠，氢氧化钾及其混合物的溶剂。12. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述水凝胶在混合后少于约120分钟内 形成。13. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述白蛋白选自从植物或动物来源分 离、提取或纯化的白蛋白、合成的白蛋白、其衍生物以及其混合物。14. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述白蛋白源选自纯化的白蛋白、血清、 含血清细胞培养基以及其组合。15. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，将所述白蛋白源与溶剂体系混合，以在 与所述肽溶液混合前形成含有所述白蛋白的溶液。16. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的肽-白蛋白溶液具有基本中性的 pH〇17. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述白蛋白源为含血清细胞培养基，所 述细胞培养基包含细胞，其中所述细胞被所述肽-白蛋白水凝胶包裹，所述方法进一步包 含在所述水凝胶中对所述细胞进行培养。18. 根据权利要求17所述的方法，其特征在于，进一步包括将所述水凝胶应用到细胞 培养板或微孔中用于细胞培养。19. 根据权利要求18所述的方法，其特征在于，进一步包括用细胞培养基覆盖所述水 凝胶并在细胞培养条件下培养含有所述细胞的水凝胶。20. 根据权利要求17所述的方法，其特征在于，进一步包括从所述水凝胶中分离培养 的细胞。21. 根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述分离包括： 在机械力的作用下，破坏所述水凝胶基质； 用额外的细胞培养基稀释所述水凝胶；以及 从所述水凝胶中分离所述培养的细胞。22. 根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述的机械力选自吹打、离心、震荡、注 射、过滤、喷雾及其组合。23. 根据权利要求9所述的方法，进一步包括混合活性剂、所述的肽溶液以及所述白蛋 白源、在自组装后所述活性剂被包裹在所述肽-白蛋白水凝胶中。24. 根据权利要求9所述的方法，进一步包括在所述混合前将所述肽溶液施用到患者 的伤口部位，其特征在于，所述白蛋白源为来自所述伤口的血液，所述肽-白蛋白水凝胶在 所述的伤口部位进行原位自组装。25. -种肽-白蛋白水凝胶，根据权利要求9所述的方法形成。26. -种向患者传递活性剂的方法，所述方法包括将根据权利要求1-8任一项所述的 肽-白蛋白水凝胶施用给所述患者，其特征在于，所述的活性剂被包裹在所述水凝胶基质 中。
【专利摘要】描述了一种肽-白蛋白水凝胶，具有自组装的、三维纳米纤维基质。所述纳米纤维基质包含两亲性的肽和白蛋白。所述肽包含末端疏水区域，中央转动区域和末端亲水区域。还描述了制备所述凝胶的方法，以及使用所述水凝胶作为组织工程支架，作为三维细胞培养物，进行药物传递，活性剂(治疗性细胞，分子，药物以及化合物)的包裹，细胞移植，细胞储存，病毒培养和储存的方法。
【IPC分类】A61L27/52, C07K14/76, A61L27/22
【公开号】CN105025942
【申请号】CN201380063880
【发明人】秀芝·S·孙, 黄鸿洲, 秋·安娜丽斯·阮
【申请人】堪萨斯州立大学研究基金会
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2013年12月6日
【公告号】CA2886109A1, EP2928513A1, WO2014089472A1