创伤治愈剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及创伤治愈剂。
【背景技术】
[0002] 为了治愈烧伤、采皮伤、皮肤剥脱伤和外伤性皮肤缺损以及褥疮性皮肤溃疡和糖 尿病性皮肤溃疡等创伤，需要将创伤部保持在适度的湿润环境中，创造出促进细胞增殖的 环境。为此，作为适应于患部的创伤被覆材料，以往使用纱布和脱脂棉等。这些材料对渗出 液的吸收快，但另一方面容易受到细菌感染，另外，还存在若创面干燥则在去除时会伴有疼 痛、出血等这样的问题。另外，为了使创面不干燥，还将创伤被覆材料与软膏等合用，但存在 渗出液的吸收不充分、创面处于过度湿润状态的问题。
[0003] 另外，为了维持适度的湿润环境，有时使用羧甲基纤维素（CMC)凝胶（专利文献1) 等以维持湿润环境为目的的创伤被覆材料来代替纱布、脱脂棉和软膏等。但是，CMC凝胶因 渗出液等而难以保持凝胶结构，存在从创伤部脱离或者变成细菌感染的温床的问题。
[0004] 另一方面，作为不仅保持湿润环境、而且还促进肉芽组织形成和上皮化的创伤治 愈剂，已知有胶原蛋白海绵（专利文献2)。胶原蛋白海绵具有生物适合性良好等特征，但其 存在缺乏维持湿润环境的能力、容易被细菌感染、细菌容易增殖、因渗出液而劣化、以及材 料难以获得等问题。
[0005] 另外，在使用现有的创伤治愈剂的情况下，有时会产生作为生物体防御反应之一 的异物反应，使得向作为创伤治愈过程的炎症期的过渡延迟，结果使创伤治愈延迟。因此， 正在寻求可抑制由创伤治愈剂引起的异物反应的创伤治愈剂。
[0006] 现有技术文献
[0007] 专利文献
[0008] 专利文献1 :日本特开平06-009373号公报
[0009] 专利文献2 :日本特开平10-080438号公报
【发明内容】
[0010] 发明所要解决的课题
[0011] 本发明的目的在于提供抑制细菌增殖、且促进肉芽组织形成和上皮化、而且抑制 异物反应的创伤治愈剂。
[0012] 用于解决课题的手段
[0013] 本发明涉及一种创伤治愈剂，其含有蛋白质（A)和水，该蛋白质（A)具有GAGAGS 序列（1)以及下述氨基酸序列（X)和/或下述氨基酸序列（X'），上述创伤治愈剂中，通过圆 二色性光谱法求得的上述蛋白质（A)的转角结构与无规卷曲结构的合计比例为60~ 85%;上述蛋白质（A)的总氨基酸数中，氨基酸序列（X)的氨基酸数和氨基酸序列（X'）的 氨基酸数所占的合计比例为50~70%。
[0014] 氨基酸序列（X):选自由VPGVG序列（2)、GVGVP序列（3)和GAHGPAGPK序列（4) 组成的组中的至少一种氨基酸序列。
[0015] 氨基酸序列（X'）：氨基酸序列（X)中的1~2个氨基酸分别被赖氨酸（K)或精氨 酸（R)置换而得到的氨基酸序列。
[0016] 发明的效果
[0017] 本发明的创伤治愈剂发挥如下效果：具有细菌增殖抑制作用，肉芽组织形成和上 皮化促进作用优异，抑制异物反应。
【具体实施方式】
[0018] 本发明中，蛋白质（A)通过从天然物提取、有机合成法（酶法、固相合成法和液相 合成法等）和基因重组法等而得到。关于有机合成法，可以应用《生化学実験講座1、夕> A夕質①化学IV(生物化学实验讲座1、蛋白质化学IV) (1981年7月1日、日本生物化学会 编、株式会社东京化学同人发行）》或《続生化学実験講座2、夕> A夕質?化学（下）（续 生物化学实验讲座2、蛋白质的化学（下））（1987年5月20日、日本生物化学会编、株式会 社东京化学同人发行）》中记载的方法等。关于基因重组法，可以应用日本专利第3338441 号公报中记载的方法等。从天然物提取、有机合成法和基因重组法均可得到蛋白质（A)，从 能够简便地变更氨基酸序列、能够价格低廉地大量生产的观点等考虑，优选基因重组法。
[0019] 本发明的创伤治愈剂含有蛋白质（A)和水，该蛋白质（A)具有GAGAGS序列（1)以 及下述氨基酸序列（X)和/或下述氨基酸序列（X'），上述创伤治愈剂中，通过圆二色性光 谱法求得的蛋白质（A)的转角结构与无规卷曲结构的合计比例为60~85% ;蛋白质 (A)的总氨基酸数中，氨基酸序列（X)和氨基酸序列（X'）所占的合计比例为50~70%。
[0020] 氨基酸序列（X):选自由VPGVG序列（2)、GVGVP序列（3)和GAHGPAGPK序列（4) 组成的组中的至少一种氨基酸序列。
[0021] 氨基酸序列（X'）：氨基酸序列（X)中的1~2个氨基酸分别被赖氨酸（K)或精氨 酸（R)置换而得到的氨基酸序列。
[0022] 本发明中，通过使蛋白质（A)的0 -转角结构与无规卷曲结构的合计比例为上述 范围，蛋白质（A)中的氨基酸序列（X)和/或氨基酸序列（X'）有效地与细胞发生相互作 用，肉芽组织形成作用和上皮化促进作用优异。而且，能够长期保持凝胶结构。此外，通过 使蛋白质㈧的转角结构与无规卷曲结构的合计比例、以及蛋白质（A)的总氨基酸数 中的氨基酸序列（X)的氨基酸数和氨基酸序列（X'）的氨基酸数所占的合计比例为上述范 围，可抑制由创伤治愈剂引起的异物反应。另外，本发明的创伤治愈剂随着时间的经过以及 通过施加热等刺激等而发生凝胶化，因此在应用于创伤时发生凝胶化，能够将创伤部密闭， 能够抑制细菌的增殖。另外，凝胶化物能够维持湿润环境，能够促进细胞的增殖。
[0023] 本发明的蛋白质（A)是通过圆二色性光谱法求得的蛋白质（A)的转角结构与 无规卷曲结构的合计比例为60~85%的蛋白质。通常，即使蛋白质的序列相同，根据蛋白 质的制作方法、蛋白质的提纯方法、溶解蛋白质的溶剂的pH和溶剂的极性等的不同，蛋白 质的0-转角结构与无规卷曲结构的合计比例也不相同。
[0024] 从与细胞的相互作用的容易性（以下简称为细胞亲和性）的观点和抑制异物反应 的观点考虑，蛋白质（A)的转角结构与无规卷曲结构的合计比例优选为60~85%、进 一步优选为65~80%、特别优选为70~75%。
[0025] 可以通过利用硫酸铵沉淀、超滤、亲和层析法和阴离子交换层析法等使蛋白质（A) 重折叠来增加上述比例。另外，可以通过利用变性剂、热等使蛋白质（A)变性来降低上述比 例。
[0026] 蛋白质⑷的0 _转角结构与无规卷曲结构的合计比例通过下述测定法来求出。
[0027] 〈蛋白质的0 _转角结构与无规卷曲结构的合计比例的测定方法〉
[0028] 将蛋白质以0. 3mg/ml溶解在去离子水（4°C )中，制作蛋白质的水溶液。利用圆二 色性光谱测定器（日本分光株式会社制造，"J-820"）对所制作的蛋白质的水溶液进行测定 (测定温度：4°C )，利用二次结构解析程序（JWSSE型-480型：日本分光株式会社制造）计 算出转角结构的比例和无规卷曲结构的比例，将它们合计作为转角结构与无规卷 曲结构的合计比例。
[0029] 本发明中，蛋白质（A)具有氨基酸序列（X)和/或氨基酸序列（X'）。
[0030]氨基酸序列（X):选自由VPGVG序列（2)、GVGVP序列（3)和GAHGPAGPK序列（4) 组成的组中的至少一种氨基酸序列。
[0031] 氨基酸序列（X'）：氨基酸序列（X)中的1~2个氨基酸分别被赖氨酸（K)或精氨 酸（R)置换而得到的氨基酸序列。
[0032] 需要说明的是，蛋白质（A)可以具有多个氨基酸序列（X)，也可以具有多个氨基酸 序列（X'）。另外，在蛋白质（A)具有多个氨基酸序列⑴的情况下，各氨基酸序列⑴的 种类可以不同；在蛋白质（A)具有多个氨基酸序列（X'）的情况下，各氨基酸序列（X'）的 种类可以不同。此外，蛋白质（A)也可以同时具有氨基酸序列（X)和氨基酸序列（X'）。
[0033] 作为氨基酸序列（X)，从细胞亲和性的观点、抑制异物反应的观点和蛋白质（A)凝 胶化的观点考虑，优选为VPGVG序列⑵和/或GVGVP序列（3)。
[0034] 作为氨基酸序列（X'），具体而言，可以举出GKGVP序列（7)、GKGKP序列（8)、GKGRP 序列（9)和GRGRP序列（10)等。
[0035] 从细胞亲和性的观点和蛋白质（A)凝胶化的观点考虑，氨基酸序列（X'）优选为选 自由GKGVP序列（7)、GKGKP序列（8)和GRGRP序列（10)组成的组中的至少一种序列，进一 步优选为GKGVP序列（7)和/或GKGKP序列（8)。
[0036] 从细胞亲和性的观点、抑制异物反应的观点和蛋白质（A)凝胶化的观点考虑，蛋 白质（A)优选具有将氨基酸序列（X)中的1种以2~200个连续而成的多肽链（Y)和/或 下述多肽链（Y'）。
[0037] 多肽链（Y'）：多肽链（Y)中，多肽链（Y)的总氨基酸数的0. 1~20 %的氨基酸分 别被赖氨酸（K)或精氨酸（R)置换而得到的多肽链。
[0038] 具体而言，多肽链（Y)为（VPGVG) b序列、（GVGVP)。序列和（GAHGPAGPK) d序列（需 要说明的是，b~d分别为氨基酸序列（X)的连续个数，为2~200的整数）。
[0039] 在1分子蛋白质（A)中具有多个多肽链⑴的情况下，可以具有选自由（VPGVG)b 序列、（GVGVP)。序列和（GAHGPAGPK) d序列组成的组中的1种，也可以具有2种以上。
[0040] 另外，在蛋白质（A)中具有多个多肽链（Y)的情况下，上述氨基酸序列（X)的连续 个数在每个多肽链（Y)中可以相同，也可以不同。即，可以具有氨基酸序列（X)的连续个数 b~d相同的多个多肽链（Y)，也可以具有b~d不同的多个多肽链（Y)。
[0041] 作为多肽链（Y)，从细胞亲和性的观点、抑制异物反应的观点以及使蛋白质（A)的 0 -转角结构与无规卷曲结构的合计比例适度的观点考虑，优选为（VPGVG)b序列和/或 (GVGVP)。序列。
[0042] 多肽链（Y)是将氨基酸序列⑴以2~200个连续而成的（上述b~d为2~ 200)多肽链，从细胞亲和性的观点、抑制异物反应的观点、蛋白质（A)凝胶化的观点以及使 蛋白质⑷的转角结构与无规卷曲结构的合计比例适度的观点考虑，氨基酸序列（X) 的连续个数优选为2~100个（上述b~d为2~100)、进一步优选为2~50个（上述 b~d为2~50)、特别优选为2~40个（b~d为2~40个）。
[0043] 另外，多肽链（Y'）为多肽链⑴中的总氨基酸数的0. 1~20%的氨基酸分别被 赖氨酸（K)或精氨酸（R)置换而得到的多肽链，具体而言，包含在氨基酸序列（X)连续而成 的多肽链（Y)中氨基酸序列（X)的一部分或全部被置换为氨基酸序列（X'）的多肽链。
[0044] 多肽链（Y'）中，从蛋白质（A)在水中的溶解性的观点、细胞亲和性的观点、抑制异 物反应的观点以及使蛋白质（A)的转角结构与无规卷曲结构的合计比例适度的观点考 虑，多肽链（Y)中的总氨基酸数中被赖氨酸（K)和精氨酸（R)置换的合计比例优选为0. 5~ 10%、进一步优选为1~5%。
[0045] 是否为多肽链（Y'）通过将蛋白质（A)的序列中的全部赖氨酸（K)和精氨酸（R) 置换为其他氨基酸（G、A、V、P、H或K)时是否形成多肽链（Y)来判断。
[0046] 从蛋白质㈧在水中的溶解性的观点、细胞亲和性的观点、抑制异物反应的观点 以及使蛋白质（A)的转角结构与无规卷曲结构的合计比例适度的观点考虑，蛋白质（A) 中的多肽链（Y)与多肽链（Y'）的合计个数优选为1~100个、进一步优选为1~80个、特 别优选为1~60个。
[0047] 在蛋白质（A)中具有氨基酸序列（X)的种类和/或连续个数不同的多肽链（Y)的 情况下，将其分别作为1个来计数，多肽链（Y)的个数为其合计。多肽链（Y'）也同样。
[0048] 本发明中，对于蛋白质（A)而言，蛋白质⑷的总氨基酸数中的氨基酸序列（X)的 氨基酸数和氨基酸序列（X'）的氨基酸数所占的合计比例为50~70%，但从细胞亲和性的 观点和抑制异物反应的观点考虑，该合计比例优选为52.