br>[0118] 透明质酸酶抑制率大小在一定程度上反应了样品的抗炎活力，抑制率越高，抗炎 活性越强。通过构建体外抑制透明质酸酶实验体系，评估复方神秘果叶提取物对透明质酸 酶的抑制率。不同受试浓度下复方神秘果叶提取物抑制透明质酸酶实验结果如表4所示。
[0119] 表4复方神秘果叶提取物透明质酸酶抑制率实验结果 阳 120]
阳121]由表4可知，复方神秘果叶提取物具有一定的透明质酸酶抑制率，表明其具有一 定的抗炎活性。且在相同的受试浓度下，复方神秘果叶提取物抑制透明质酸酶活性均优于 市售竞品。4、改善皮肤微循环实验
[0122] 皮肤微循环血流量在医学上有广泛的应用。在一定范围内，皮肤微循环血流量越 大表明皮肤细胞具有良好的自我更新及再生能力。将制备好的复方神秘果叶提取物添加进 膏霜基质中，添加浓度5 %，采用"激光多普勒血流测试仪"分析受试志愿者使用复方神秘果 叶提取物的膏霜前后改善皮肤微循环血流量的变化情况。
[0123] 受试志愿者15人，年龄25-35岁，实验过程中控制相对湿度（30 + 5% )及溫度 (25±rc)。结果显示，复方神秘果叶提取物具有良好的改善皮肤微循环血流量的功效。参 与实验15名志愿者中，共有11名受试志愿者的皮肤微循环血流量得到了有效的提高，有效 率达到73%。实验中，所有15名受试志愿者皮肤均无不良反应发生。据此，复方神秘果叶 提取物可运用于红润肌肤、改善黑眼圈。
[0124] 5、黑色素细胞试验
[01巧]探讨复方神秘果叶提取物样品对黑色素细胞的增殖及美白作用的影响。利用B16 黑色素瘤细胞，测定样品对黑色素细胞增殖作用的影响，W及对黑色素细胞合成黑色素的 影响。
[0126] (1)细胞增殖率的测定（MTT法） 阳127] 培养小鼠黑色素瘤B16细胞，待细胞生长到对数期，用0. 25%膜酶消化，调整细胞 浓度为5X104个/mU接种于96孔板中，每孔100yL。置于培养箱中培养24h后，弃上清 液，添加含药培养基，每个样品=个浓度组。每一浓度设3个复孔，对照组不加药物，代之W 相应的溶媒。解育7化后，每孔加入5g/L的M1T溶液20yL4h后弃上清液，每孔加入细胞 裂解液100y以继续培养过夜，在酶标仪上检测各孔吸光度值，波长为570nm。
[0128] 细胞增殖抑制率％ = (1-药物组平均吸光值/对照组平均吸光值）X100 阳129] (2)黑色素合成抑制率的测定 阳130] 将B16黑色素细胞W20X104个/血的密度接种于24板。每孔ImL，解育2地后， 弃上清液，添加待测药物（样品作用终浓度同前述），药物作用7化后，弃上清液，PBS洗涂， 每孔加入含10%DMS0的Imol/L化0H溶液500yL震荡5min。测量490皿下各孔吸光值。 阳131] 黑色素合成抑制率％= [1-(药物孔490nm吸光度值/药物孔570nm吸光度）/(对 照孔490nm吸光度值/对照孔570nm吸光度）]X100
[0132] 加入不同浓度复方神秘果叶提取物受试物后，样品对黑色素细胞黑色素合成抑制 率及细胞增殖抑制率实验结果如表5所示。 阳133] 表5不同浓度复方神秘果叶提取物样品对B16细胞的增殖抑制作用和黑色素生成 作用 阳 134]
[0135]结论：加入不同浓度的受试物后，复方神秘果叶提取物样品具有较好的抑制黑 色素细胞合成黑色素的作用，在受试浓度范围内（0. 5% -2. 0% )，黑色素合成抑制率在 30%-40%左右，表明复方神秘果叶提取物在细胞水平具有良好的美白功效，且对细胞增殖 的影响低于市售竞品。 阳136]二、本发明复方神秘果叶提取物产品的安全性评估阳137] 1、红细胞溶血试验
[0138] 红细胞溶血率在一定程度上可W反应样品的刺激性，溶血率越高，潜在的刺激性 越大。复方神秘果叶提取物提取液红细胞溶血率实验结果如下表6所示。
[0139] 表6复方神秘果叶提取物红细胞溶血率实验结果
[0140]
阳141] 由表6可知，复方神秘果叶提取物提取液在10%的浓度范围内具有极低的红细胞 溶血率，表明其具有较好的安全性。 阳142] 2、小鼠多次皮肤刺激试验 阳143]通过小鼠多次皮肤刺激试验，确定和评价化复方神秘果叶提取物对哺乳动物皮肤 局部是否有刺激作用或腐蚀作用及其程度。
[0144]方法参照2007版化妆品卫生规范规定的皮肤刺激性/腐蚀性试验方法。将受试 物一次（或多次）涂敷于受试动物的皮肤上，在规定的时间间隔内，观察动物皮肤局部刺激 作用的程度并进行评分。采用自身对照，W评价受试物对皮肤的刺激作用。急性皮肤刺激 性试验观察期限应足W评价该作用的可逆性或不可逆性。
[0145] 试验结果显示，连续涂抹14天受试样品（分别添加复方神秘果叶提取物提取液 5%及10% )，小鼠皮肤均未出现红斑及水肿现象。 阳146] 结果说明，复方神秘果叶提取物安全性良好，无刺激性。 阳147] 3、人体封闭式斑贴试验
[0148] 人体斑贴试验方法参照《妆品卫生规范（2007版）》，制备含1.0%和5.0%的复方 神秘果叶提取物提取液的膏霜进行封闭式斑贴，考察样品对人体造成不良反应的可能性。
[0149] 皮肤不良反应分级如下表7所示。
[0150] 表7皮肤不良反应分级
[0151]
阳152] 根据表7,观察受试者去除斑试器30min、24h及4化时的皮肤反应情况。 阳153] 试验结果如下表8-表10所示。
[0154]表8去除斑试器30min观察结果 阳1巧]
阳156] 表9去除斑试器24h观察结果 阳 157]
[0158]表10去除斑试器4化观察结果 阳159]
阳161] 根据2007《化妆品卫生规范》的要求，判定样品1、样品2对人体皮肤无不良反应。 (其中，样品1为添加1. 0%的复方神秘果叶提取物提取液的膏霜，样品2为添加5. 0%的复 方神秘果叶提取物提取液的膏霜。） 阳162] 结论：添加1. 0%、5. 0%两个浓度的复方神秘果叶提取物的膏霜，对人体皮肤无 不良反应发生，安全性良好。
[0163] 4、光毒性试验
[0164] 采用体外3T3中性红摄取光毒性试验评估复方神秘果叶提取物是否存在潜在的 光毒性。
[0165] 通过计算光刺激因子PIF及平均光效应MPE综合评估样品是否存在光毒性，评判 标准如下：当PIF<2. 0或MPE<0. 1 :预期无光毒性；当PIF〉2. 0且巧.0或MPE〉0. 1且<0. 15 : 预期可能存在光毒性；当PIF〉5. 0或MPE〉0. 15 :预期存在光毒性。 阳166] 试验采用96-孔培养板进行。将生长状态良好的Ba化/c 3T3细胞接种于96孔细 胞培养板（受试品及阳性对照品各2块板），使每孔的细胞密度约为1. 0X104个/孔。培 养24小时后，加入含有不同浓度受试品给药制剂和阳性对照盐酸氯嗦（CP幻的皿SS溶液， 同时设置空白对照和赋形剂/溶媒对照，每个处理6个复孔，每种受试品2块板。加湿培养 1小时后，分别进行光照和非光照处理，然后换上新鲜的培养液继续培养18-22小时。培养 结束前约3小时，加入含中性红无血清的DMEM培养液继续培养。培养结束后，每孔加入中 性红洗脱液，置于振荡器快速振荡直至形成均匀的溶液。用分光光度计在540nm下测定各 孔的 0D值（0D540)。
[0167]W化ototox软件计算光刺激因子（PI巧值。试验中，赋形剂或溶剂对照组的 〇〇54。数值均大于0. 4且阳性对