一种利用脓病蚕生产药用白僵蚕的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药用白僵蚕的制备方法，尤其是涉及一种利用脓病蚕生产药用白僵蚕 的方法。
【背景技术】
[0002] 球抱白僵菌（Beauveria Bassiana(Balsamo) Vuillemin)，是一种常见的昆虫寄生 真菌，在分类学上属于属于半知菌亚门（Deuleromycotina)，丝孢纲（Hyphomycetes)，丛孢 梗目（Moniliales)，丛梗孢科（Moniliaceae)，白僵菌属（Beauveria)。白僵菌寄主广泛，毒 力强，能使多种昆虫在短时间内毙命，形成的白僵虫很多经炮制后都能作为中药，或单独入 药或配伍治疗多种疾病，白僵菌侵染家蚕形成的白僵蚕就是其中一类。脓病是丝茧育生产 中很常见，危害又极其严重的一类传染性蚕病。有统计数字表明因家蚕传染病造成丝茧生 产欠收绝收的90%以上是脓病造成。它具有传染性强、蔓延快、根治难等特点，一旦染病，就 会造成不可挽回的损失。
[0003] 白僵蚕作为一味作用广泛的中药，其市场需求不言而喻，但是随着家蚕养殖技术 的不断提高和完善，能够从家蚕养殖过程中收集足够的白僵蚕来满足市场需求的可能性越 来越小，而且收集来的僵蚕成色不一，质量不能保证，其中也不乏弄虚作假者。目前，现有技 术中生产药用白僵蚕的方法主要是采用健康的4龄或5龄蚕作为生产白僵蚕的原料，这样 从经济效益的角度来说不可取，也与养蚕获取蚕丝的初衷不相符。
[0004] 由此可见，现有的制备白僵蚕的方法存在明显的不足和缺陷，亟待进一步改进。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供利用脓病蚕生产药用白僵蚕的方法，其具有方法简单，成本 低，利用脓病蚕制备药用白僵蚕，避免了养蚕中的经济损失，制备的药用白僵蚕质量好，提 供了 一条新的制备药用白僵蚕的途径。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明提供一种利用脓病蚕生产药用白僵蚕的方法，其包 括以下步骤：
[0007] 步骤A :采集白僵病蚕，并清理其表面的污染物，烘干待用；
[0008] 步骤B :取白僵病蚕表面的孢子粉，用无菌水溶解；
[0009] 步骤C :进行菌株鉴定，该菌株为球孢白僵菌；
[0010] 步骤D :确定所述球孢白僵菌培养的最佳条件；
[0011] 步骤E :选取脓病蚕，利用上述球孢白僵菌对上述脓病蚕进行硬化处理；
[0012] 步骤F :确定脓病蚕的蚕体的硬化处理的最佳条件；
[0013] 步骤G :按照步骤F中确定的最佳条件硬化脓病蚕，得到合格的药用白僵蚕。
[0014] 本发明的一个实施例中，所述步骤C中，确定菌株为球孢白僵菌是通过菌株的形 态以及菌株的rRNA ITS序列分子鉴定和系统发育树的构建进行鉴定的。
[0015] 本发明的一个实施例中，所述菌株的rRNA ITS序列片段扩增后的序列的测序结 果与NCBI数据库中的白僵菌序列进行比对，用CLUSTAL X软件进行序列比对分析，并用 MEGA 4.0软件的最大似然法构建系统发育树，选用蜡蚧轮枝菌Lecanicillium lecanii F J515771的同源序列作为外群，进行1000次重复。
[0016] 本发明的一个实施例中，确定所述球孢白僵菌的最佳发酵时间，最佳碳源，最佳氮 源以及最佳微量元素的用量；
[0017] 所述球孢白僵菌最佳发酵时间为120小时；最佳碳源为马铃薯淀粉；最佳氮源为 黄豆粉；最佳微量元素为CuS04, FeCl3, MnSOj^组合。
[0018] 本发明的一个实施例中，所述步骤F中，对脓病蚕进行硬化处理时，75. 0g干脓病 蚕体的最佳接种量为〇. lL/kg，脓病蚕体的最佳含水量为50 %~55%，脓病蚕体上培养菌 体的最佳培养温度为27°C。
[0019] 本发明的一个实施例中，所述步骤F中，对脓病蚕进行硬化处理时，脓蚕体的最佳 含水量为50 %~55%。
[0020] 本发明的一个实施例中，所述球孢白僵菌菌丝光滑，有隔，大小在2. 5 μπι到 3. 5 μ m之间，产孢细胞基部膨大为瓶形或近球形，颈部明显延长成产孢轴，轴上产分生孢 子。
[0021] 本发明的一个实施例中，所述脓病蚕的蚕体的硬化处理过程中，通入氧气对所述 球孢白僵菌进行培养。
[0022] 本发明的有益效果：
[0023] 本发明利用脓病蚕生产药用白僵蚕的方法，提供了一条新的制备药用白僵蚕的途 径，利用将被遗弃的脓病蚕，避免了养蚕过程中经济损失，开启了废物利用的新途径，且该 制备方法简单，成本低，制备效率高，制备的药用白僵蚕质量好。
【附图说明】
[0024] 图1为本发明的球孢白僵菌在PDA培养基的菌落特征图；
[0025] 图2为本发明的球孢白僵菌液生分生孢子形态的显微观察（10X40)图；
[0026] 图3为本发明采用ML法构建的不同来源白僵菌基于rRNA ITS基因序列的系统发 育树的图；
[0027] 图4为本发明的液生分生孢子随时间的变化曲线图；
[0028] 图5为本发明的芽生分生孢子随时间的变化曲线图；
[0029] 图6为本发明图的白僵菌菌丝显微形态的图；
[0030] 图7为本发明的不同碳源对液生分生孢子形成的影响的图；
[0031] 图8为本发明的不同碳源对芽生孢子形成的影响的图；
[0032] 图9为本发明的不同氮源对液生分生孢子形成的影响的图；
[0033] 图10为本发明的不同氮源对芽生孢子形成的影响的图；
[0034] 图11为本发明图的不同微量元素对液生分生孢子产生的影响的图；
[0035] 图12为本发明图的不同微量元素对芽生孢子产生的影响的图。
【具体实施方式】
[0036] 本发明采集了八头自然发病的白僵病蚕，蚕体僵硬，表面密布白色粉末，头与身体 间构成一定角度，断折面黑色晶亮，有自然发酵味道。
[0037] 本发明中，采用的基础培养基为：白僵菌的分离采用普通PDA培养基：马铃薯 200. 0g，葡萄糖 20. 0g，琼脂 20. 0g，H201000mL。
[0038] 本发明的白僵菌的保藏采用改良的PDA培养基为：马铃薯200. 0g，葡萄糖20. 0g， 牛肉膏 20. 0g，CaC03 3. 0g，（NH4)2S04 1. 0g，Κ2ΗΡ04 0· 6g，MgS04 1. 0g，琼脂 20. 0g，H20 1000mL。液体深层发酵最佳时间培养基：黄豆粉15g，蔗糖25g，KH2P04 1. 50g，MgS04 0 . 50g， CaCl2 0. 01g,MnS04 40 μ g, CuS04 80 yg,ZnS04 4 00 yg,FeCl3 500 μ g, VB^O μ g, VB2 5 μ g, VB6 2 μ g，烟酰胺 100 μ g，右旋泛酸钙 10 μ g，H20 1000mL，吐温 800. 8 %，pH6. 5-7. 0。
[0039] 本发明的蚕体培养基，蚕体培养基采用从农户家收集个体完整、大小均匀的脓病 蚕，取回后清理干净表面污物，烘干保存待用。
[0040] 本发明的菌株通过稀释培养法进行分离，取自然发病的白僵蚕，清除表面的污物 后，用接种刀轻轻刮取表面的孢子粉，放入盛有无菌水的试管中，再置于振荡器上面震荡 15min，用移液枪吸取lmL孢子液，打入盛有9mL的无菌水中，得到10 1梯度的孢子液，依次 类推，得到10 2到10 7梯度的孢子液。用移液枪从10 3到10 7梯度的孢子液中吸取100 μ L 稀释液均匀涂布于PDA平板，置于27°C环境下培养。
[0041] 本发明的菌株的鉴定，形态鉴定分离得到白僵菌的观察：稀释孢子观察，切取一小 块病原菌菌落，放入适量无菌水中震荡打散，用滴管移取一小滴在干净载玻片上，盖上盖玻 片静置片刻后，进行显微观察。
[0042] 盖玻片蔓延法观察：在超净工作台环境下，取无菌的盖玻片轻轻放置于倒好的 PDA平板上，然后在空白处接入白僵菌病原菌，置于合适条件下培养，直到盖玻片表面覆盖 满菌丝，再用镊子取出进行显微观察，查看其菌丝、孢子的形态和产孢子的方式。记录下两 种鉴定原材料下观察得到的结果，参照《真菌鉴定手册》，对分离得到的白僵菌进行形态特 征鉴定。
[0043] rRNA ITS序列分子鉴定和系统发育树的构建，将扩增得到菌株rRNA ITS序列片段 的测序结果与NCBI数据库已登录中的白僵菌序列进行