生孢子数。
[0075] 实施例6培养基质中不同含水量对培养过程的影响
[0076] 准确称取75. 0g干蚕体，加入适量干净饮用水，密封浸泡一天一夜，使蚕体含水量 约为45%~50% (由前后质量差计算得出），取出均匀分装在10个广口瓶中，包扎好灭菌， 冷却后接入700 μ L种子液，置于27 °C环境下培养，观察记录。
[0077] 其他条件不变，依次设置含水量为50 %~55%、55 %~60 %的培养梯度试验，培 养过程中观察记录，确定三者中的最佳含水量。
[0078] 实施例7不同培养温度对培养过程的影响
[0079] 准确称取75. 0g干蚕体，加入适量干净饮用水，密封浸泡一天一夜，使最终含水量 约为50 % (由前后质量差计算得出），取出均匀分装在10个广口瓶中，包扎好灭菌，冷却后 接入700 μ L种子液，置于23 °C环境下培养，观察记录。
[0080] 其他条件不变，依次设置培养为27°c、3rc的培养梯度试验，培养过程观察记录， 确定三者中的最佳培养温度。
[0081] 实施例8是否通氧对培养过程的影响
[0082] 准确称取75. 0g干蚕体，加入适量干净饮用水，密封浸泡一天一夜，使蚕体含水量 约为50 % (由前后质量差计算得出），取出均匀分装在10个广口瓶中，包扎好灭菌，冷却后 接入700 μ L种子液，置于27 °C环境下培养，观察记录。
[0083] 照此另外设置同样的10个广口瓶培养，在培养两天后打开瓶盖，使通气，并观察 记录，确定通氧是否对菌丝生长有影响。
[0084] 不同条件对蚕体培养过程的影响，表2蚕体硬化过程的描述
[0087] 注："一"未见孢子萌发；有少量孢子萌发；" + "孢子大量萌发；"++"孢子萌发， 连成菌苔；"+++"菌苔扩大；覆盖蚕体；"++++"覆盖蚕体，并侵入蚕体内，蚕体硬化
[0088] 从表2可以看出，在接种量试验中，当其他条件相同时接种量的不同影响着蚕体 的硬化，当接种量为〇. lL/kg时，蚕体硬化速度最快，菌丝生长健壮，随着接种量的减少，蚕 体硬化的速度逐渐减慢；
[0089] 在含水量试验中，当其他条件相同时蚕体中不同的含水量对其硬化和菌丝生长有 影响，含水量在50%~55%时培养情况最佳，蚕体硬化速度最快；在培养温度试验中，发现 温度为27°C时最有利于菌丝的生长，23°C时菌丝也能生长，但速度较慢，环境温度为31°C 时对白僵菌的生长有抑制作用；在是否通氧的试验中，发现通氧对白僵菌的生长有促进作 用，孢子萌发较快，培养得到的蚕体硬化率更高。
[0090] 对球孢白僵菌的生物学特征研究实验结果表明，球孢白僵菌菌丝光滑，有隔，大小 在2. 5 μ m到3. 5 μ m之间，产孢细胞基部膨大为瓶形或近球形，颈部明显延长成产孢轴，轴 上产分生孢子。分生孢子透明，光滑，多为球形和近球形，个别为长柱形，直径约为4. 5 μ m。
[0091] 在以黄豆粉、玉米粉、麸皮、（NH4)2S04为供选氮源的筛选试验中，发现以黄豆粉为 唯一氮源的培养基产孢力最高，发酵后得到的液生分生孢子浓度和芽生孢子浓度都明显高 于其他氮源培养基。以玉米粉为唯一氮源的培养基经接种发酵后得到的液生分生孢子和芽 生孢子形态表现畸形，形态、大小各异，不适合做发酵培养基的氮源。在以马铃薯淀粉、蔗 糖、葡萄糖为供选碳源的的筛选试验中，发现以马铃薯淀粉为唯一碳源的培养基产孢力最 高，发酵后得到的液生分生孢子浓度和芽生孢子浓度都明显高于其他两个碳源培养基。以 蔗糖为唯一碳源和以葡萄糖为唯一碳源的培养基产孢能力相当。在研究最佳微量元素和最 适装液量对液生分生孢子产生的影响的试验中，得到的结果是MnS04、CuS04、ZnS0 4、？6(：13四 种微量元素同时加入的时候获得最好的结果，而最适宜的装液量是在250mL规格的三角瓶 中装液40mL，得到最高孢子浓度。
[0092] 在固体培养基质中，微生物的生长会经历三个时期，即延滞期、对数生长期和稳定 期，在对数生长期，由于微生物的快速增殖会产生大量的生物热，如不能及时降温会对微生 物生长产生影响，而微生物生长受到限制也会导致最后产物的减少。对于多数虫生真菌来 说，适宜的生长温度在20~30°C之间。实验结果表明，培养温度控制在27°C的时候对白僵 菌的生长有利，在此温度条件下菌丝能在7d内覆盖蚕体表面并侵入内部，使其硬化。
[0093] 球孢白僵菌的生长需要较高的湿度。湿度过低不能满足白僵菌对生长的需求，生 长缓慢，湿度过高则导致基质中含氧量降低，且容易被细菌污染。在发明的试验中设置了含 水量为45 %~50 %、50 %~55 %、55 %~60 %三个梯度试验，其中当含水量在50 %~55 % 区间时蚕体硬化情况最好。本发明发现白僵菌是好氧真菌，在生长过程中供应充足的氧气 能加快白僵菌的生长。本发明发现最佳发酵条件以提高产孢力，再以脓病蚕为培养基质，初 步研究了最佳培养条件，并获得了较好效果，为药用白僵蚕的人工培养提供了新的途径。
[0094] 以上仅为本发明的较佳实施例，当不得以此限定本发明实施的技术范围，因此凡 参考本发明的说明书内容所作的简单等效变化与修饰，皆应仍属本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种利用脓病蚕生产药用白僵蚕的方法，其特征在于包括以下步骤： 步骤A :采集白僵病蚕，并清理其表面的污染物，烘干待用； 步骤B :取白僵病蚕表面的孢子粉，用无菌水溶解； 步骤C :进行菌株鉴定，该菌株为球孢白僵菌； 步骤D :确定所述球孢白僵菌培养的最佳条件； 步骤E :选取脓病蚕，利用上述球孢白僵菌对上述脓病蚕进行硬化处理； 步骤F :确定脓病蚕的蚕体的硬化处理的最佳条件； 步骤G :按照步骤F中确定的最佳条件硬化脓病蚕，得到合格的药用白僵蚕。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于， 所述步骤C中，确定菌株为球孢白僵菌是通过菌株的形态以及菌株的rRNA ITS序列分 子鉴定和系统发育树的构建进行鉴定的。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于， 所述菌株的rRNA ITS序列片段扩增后的序列的测序结果与NCBI数据库中的白僵菌序 列进行比对，用CLUSTAL X软件进行序列比对分析，并用MEGA 4. O软件的最大似然法构建 系统发育树，选用蜡蚧轮枝菌Lecanicillium lecanii F J515771的同源序列作为外群，进 行1000次重复。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于， 确定所述球孢白僵菌的最佳发酵时间，最佳碳源，最佳氮源以及最佳微量元素的用 量； 所述球孢白僵菌最佳发酵时间为120小时；最佳碳源为马铃薯淀粉；最佳氮源为黄豆 粉；最佳微量元素为CuS04, FeCl3, MnSOj^组合。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于， 所述步骤F中，对脓病蚕进行硬化处理时，75. Og干脓病蚕体的最佳接种量为0. lL/kg， 脓病蚕体的最佳含水量为50%~55%，脓病蚕体上培养菌体的最佳培养温度为27°C。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于， 所述步骤F中，对脓病蚕进行硬化处理时，脓蚕体的最佳含水量为50 %~55 %。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于， 所述球孢白僵菌菌丝光滑，有隔，大小在2. 5 y m到3. 5 y m之间，产孢细胞基部膨大为 瓶形或近球形，颈部明显延长成产孢轴，轴上产分生孢子。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于， 所述脓病蚕的蚕体的硬化处理过程中，通入氧气对所述球孢白僵菌进行培养。
【专利摘要】本发明公开了一种利用脓病蚕生产药用白僵蚕的方法，其包括以下步骤：步骤A：采集白僵病蚕，并清理其表面的污染物，烘干待用；步骤B：取白僵病蚕表面的孢子粉，用无菌水溶解；步骤C：进行菌株鉴定，该菌株为球孢白僵菌；步骤D：确定所述球孢白僵菌培养的最佳条件；步骤E：选取脓病蚕，利用上述球孢白僵菌对上述脓病蚕进行硬化处理；步骤F：确定脓病蚕的蚕体的硬化处理的最佳条件。本发明利用脓病蚕生产药用白僵蚕的方法，其提供了一条新的制备药用白僵蚕的途径，充分利用将被遗弃的脓病蚕，避免了养蚕过程中经济损失，开启了废物利用的新途径，且该制备方法简单，成本低，制备效率高，制备的药用白僵蚕质量好。
【IPC分类】A61K35/64
【公开号】CN105232580
【申请号】CN201510450281
【发明人】安慧, 蒋利荣, 崔萍, 高丽霞, 覃玥, 梁振龙, 黄贵洋, 陈祖民
【申请人】河池学院
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年7月28日