剂量依赖性的减少肿瘤的长轴和短轴长度，其中在25和50ml/kg具有 统计学意义；阳性药组与模型组相比肿瘤的大小没有显著变化。第12天，取肿瘤称重，如表 3,阿霉素治疗组瘤重与肿瘤对照组相比显著降低，差异具有统计学意义；与阿霉素治疗组 相比，中药组合物提取液与阿霉素联用则剂量依赖性的继续降低瘤重，其中在25和50ml/ kg具有统计学意义。阳性药组与阿霉素组相比瘤重无显著差异。
[0027] 试验例3荷瘤小鼠体重及心脏重量的测量 在给药第7d、9d、12d分别用称量体重。在第12d处死小鼠取心脏称重。
[0028] 如表4和表5所示，与肿瘤对照组相比，在第7d、9d和12d，阿霉素显著降低小鼠的 体重；与阿霉素组相比，在第7d，中药组合物提取液50ml/kg显著增加小鼠体重；在第9d和 12d，中药组合物提取液25ml/kg和50ml/kg显著增加小鼠体重；在第12天，中药组合物提 取液25ml/kg和50ml/kg显著增加小鼠心脏重量。与模型组相比，阳性药右雷佐生也显著 增加小鼠体重与心脏重量，差异具有统计学意义。但在第12天，阳性药组小鼠体重与心脏 重量低于中药组合物提取液50ml/kg剂量组。
[0029] 试验例4荷瘤小鼠心肌收缩功能检测 小鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉。然后用褪毛剂将小鼠的胸部毛剃光，卧位放置于操作 台。用M型超声心动仪测量左心室（LV)收缩期内径（LVIDs)和舒张期内径（LVIDd)，左心室 后壁收缩期（LVPWs)和舒张期厚度（LVPWd)。计算机软件计算左心室舒张末期容积（lvvd)， 左心室收缩末期容积（Ivvs)，短轴缩短率（FS)，射血分数（EF)，和左心室质量（AW)。
[0030] 结果如图1和表6 :与对照组相比，阿霉素组小鼠的左室短轴缩短率（FS%)，心脏 射血分数（EF%)，舒张期左室容积（LVVd)、左室实际重量（LV Mass)及收缩末期左室容积 (LVVs)显著降低。中药组合物提取液与阿霉素联用剂量依赖性的提高FS%，EF%，LVVd及 LV Mass (AW)，其中50ml/kg作用显著，具有统计学意义，但对LVVs无影响。阳性药右丙亚 胺和中药组合物提取液50ml/kg相比无显著差异。
[0031] 试验例5小鼠心电图检测 小鼠1%戊巴比妥钠腹腔麻醉（75mg/kg)。先打开powerlab多导生理记录仪，然后打 开配套的软件程序，设置好参数，准备记录心电图图形。待麻醉合适后将小鼠固定于动物 台上，四肢接上针电极，电极连于多通道电生理记录仪上，显示肢体II导联心电图，开始记 录。持续记录5分钟心电图。保存心电图图形，用于分析。
[0032] 结果如图2 :阿霉素组小鼠心电图S-T段显著升高。中药组合物提取液10ml/kg、 25ml/kg、50ml/kg剂量依赖性的降低S-T段。阳性药右雷佐生也显著降低小鼠心电图S-T 段。但本实验中小鼠心率没有显著变化。（1:对照组；2:阿霉素模型组；3:中药组合物提 取液lOml/kg剂量组；4:中药组合物提取液25ml/kg剂量组；5:中药组合物提取液50ml/ kg剂量组；6:右丙亚胺阳性药组） 试验例6血浆收集和心肌三酶活力检测 小鼠眼球取血，4000g离心10min，分离血清，用全自动生化仪检测血清中LDH、CK、AST 活性。
[0033] 结果如图3 :与肿瘤对照组相比，阿霉素组小鼠血清中LDH、CK、AST活力显著升高， 与阳性药右雷佐生一样，中药组合物提取液剂量依赖性的降低小鼠血清中LDH、CK、AST水 平。中药组合物提取液50ml/kg组的LDH与CK活力低于阳性药组。（1:对照组；2:阿霉 素模型组；3 :中药组合物提取液lOml/kg剂量组；4:中药组合物提取液25ml/kg剂量组； 5:中药组合物提取液50ml/kg剂量组；6:右丙亚胺阳性药组） 试验例7心肌组织病理观察 各处理组小鼠在取血后迅速处死取出心脏。小心切取左心室组织，用10%的福尔马林 固定2~3天。经过脱水、透明、浸蜡、包埋后进行石蜡组织切片（4~5μπι)。HE染色时， 首先将带有组织的载玻片置于二甲苯中脱蜡，用苏木素染色6~10 min ;用流动的水冲洗 几次，蒸馏水平衡后用含1%盐酸的乙醇进行分色，氨水反蓝IOmin后，用伊红染色l〇s。固 定封片。用光学显微镜观察。
[0034] 结果如图4 :显微镜下观察，肿瘤对照组：心肌组织结构基本无异常，心肌细胞排 列比较整齐。阿霉素治疗组：可见心肌纤维溶解、核溶解或固缩深染。lOml/kg组：心肌 纤维间轻微淤血，可见心肌纤维溶解，核溶解或固缩深染。25ml/kg组：心肌纤维间轻微淤 血及核深染。50ml/kg组：心肌纤维间轻微淤血，心肌组织结构基本无异常。阳性给药组： 心肌纤维间轻微淤血，心肌组织结构基本无异常。（1:对照组；2:阿霉素模型组；3:中药 组合物提取液lOml/kg剂量组；4:中药组合物提取液25ml/kg剂量组；5:中药组合物提取 液50ml/kg剂量组；6:右丙亚胺阳性药组） 试验例8心肌组织TUNEL凋亡检测及凋亡相关蛋白Caspase3/9、Bax、Bcl-2检测 心肌组织在固定、切片后，二甲苯中脱蜡5-10分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10 分钟。无水乙醇5分钟。90%乙醇2分钟。70%乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。滴加 20 μ g/ ml不含DNase的蛋白酶K，20-37°C作用15-30分钟。PBS或HBSS洗涤3次。在样品上加 50 μ I TUNEL检测液，37°C避光孵育60分钟。用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观 察。可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm(绿色荧光）。
[0035] 新鲜的或_80°C保存的心脏组织按1 :10加入生理盐水，匀浆，lOOOr/min离心 5min。加入适量的哺乳动物组织蛋白抽提试剂(含1%蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟；PMSF)， 混匀后置于冰上裂解40min。裂解完全后，4°C离心10min (12000Xg)，轻轻的吸取取上清 (注意不要洗到沉淀)。BCA测定蛋白浓度。蛋白定量、煮样、上样。盖上电泳槽盖，电压80V， 电流300mA电泳，约2h。电泳结束后，100 V，300mA转膜lh。转膜结束后，将膜放入含5% 脱脂奶粉的TBST溶液中，摇床上室温封闭2h。一抗用含5%脱脂奶粉的TBST溶液稀释相 应倍数，将封闭后的PVDF膜直接放入适量的一抗中，使封闭液全部覆盖膜表面，4°C孵育过 夜。将PVDF膜取出，用IXTBST漂洗三次，每次15 min。之后将膜放入用含5%脱脂奶粉的 TBST稀释好的二抗（1 :1000)中，室温孵育2h。将现配的ECL发光工作液滴加在膜上，室温 避光孵育5min，显色后用凝胶成像系统进行扫描、拍片。
[0036] 结果如图5所示：TUNEL检测表明阿霉素治疗组小鼠心肌凋亡明显，而中药组 合物提取液剂量依赖性的减少心肌细胞的凋亡；Westernblot检测显示阿霉素组凋亡蛋白 caspase3/9的表达显著增加，促凋亡蛋白Bax表达增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低。而 中药组合物提取液可以剂量依赖型的降低凋亡相关蛋白的表达，增加抗凋亡蛋白Bcl-2表 达。（1 :对照组；2 :阿霉素模型组；3 :中药组合物提取液lOml/kg剂量组；4:中药组合物 提取液25ml/kg剂量组；5:中药组合物提取液50ml/kg剂量组；6:右丙亚胺阳性药组） 显然，本发明的上述试验例仅仅是为清楚地说明本发明中药组合物的新用途，而并非 是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上 还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而 这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
【主权项】
1. 一种中药组合物在制备具有消除抗肿瘤药心脏毒性副作用药物中的应用；其中所 述的中药组合物是由下列用量的中药原料组成：黄芪35-40重量份、麦冬15-20重量份、人 参5-10重量份、茯苓15-20重量份、地黄10-15重量份、龟板5-10重量份、紫石英25-30重 量份、桂枝10-15重量份、淫羊藿15-20重量份、金银花15-20重量份、丹参10-15重量份、 郁金5-10重量份和枳壳5-10重量份。2. 根据权利要求1所述的用途，其中所述的中药组合物是由下列用量的中药原料组 成：黄芪36重量份、麦冬18重量份、人参9重量份、茯苓18重量份、地黄13重量份、龟板9 重量份、紫石英26重量份、桂枝13重量份、淫羊藿18重量份、金银花18重量份、丹参13重 量份、郁金9重量份和枳壳9重量份。3.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述药物是中药组合物与药学上可接受的载 体或赋形剂制成各种常规剂型。4.根据权利要求3所述的应用，其中所述的剂型为口服给药的各种常规剂型。5.根据权利要求4所述的应用，其中所述的口服剂型为片剂、胶囊、软胶囊、口服液、糖 浆、颗粒、滴丸、口崩片、缓释片、缓释胶囊、控释片或控释胶囊。6. 根据权利要求1或2所述的用途，其中所述的抗肿瘤药是阿霉素。7.根据权利要求5所述的用途，其中所述的抗肿瘤药是阿霉素。
【专利摘要】本发明公开了一种中药组合物在制备具有消除抗肿瘤药阿霉素的心脏毒性副作用药物中的用途，本发明也公开了该中药组合物在制备具有与阿霉素协同抗肿瘤作用药物中的应用，其中所述的中药组合物是由下列用量的中药原料组成：黄芪36重量份、麦冬18重量份、人参9重量份、茯苓18重量份、地黄13重量份、龟板9重量份、紫石英26重量份、桂枝13重量份、淫羊藿18重量份、金银花18重量份、丹参13重量份、郁金9重量份和枳壳9重量份。
【IPC分类】A61K31/704, A61P35/00, A61K36/9066, A61K33/14, A61P39/02, A61K35/586
【公开号】CN105267867
【申请号】CN201510761657
【发明人】华玉强, 邹敬韬, 孙晓波, 孙桂波, 马廷震
【申请人】华玉强
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年12月14日