单宁酸作为hiv-1潜伏感染激活剂的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及化合物的新应用，特别设及单宁酸作为HIV-1潜伏感染激活剂的应 用。
【背景技术】
[0002] HIV-1病毒是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒，它通过攻击人体T淋己细胞， 破坏人体免疫系统，最终导致获得性免疫缺陷综合征艾滋病的产生。该病毒最初发现于 1981年，在此之后的Ξ十余年研究人员一直致力于对该病毒控制及清除，从而达到艾滋病 的治愈。目前的常规治疗方法为简称HAART的高效抗逆转录病毒治疗，该治疗方法能够有 效的抑制病毒的复制，从而将病人外周血中的病毒载量控制到较低的水平。但是目前的通 用治疗方法只能够在一定程度上控制病毒，并不能有效的清除。究其原因是因为HIV-1可 潜伏在细胞内形成HIV-1储藏库，常规药物不能影响运些储藏库，并且病人一旦停止治疗， 它们会因为各种原因被激活，从而导致病情反复。综上所述，HIV-1储藏库的存在已成为 HIV-1治愈的巨大障碍，如何有效的清除HIV-1储藏库是目前HIV-1领域的研究热点之一。 当今的主流方法"hock and kill"是采用先激活后杀灭的思路。因此，研发安全、高效的 HIV-1潜伏感染激活剂是当前亟待解决的问题之一。
[0003] 单宁酸（TannicAcid),结构式为
在药典上又称较酸，属于水解类单宁，水解可得到倍酸和葡萄糖，是最早研究的单宁之一，具有很强的生物和药理活性，在医药、食品、日化等方面具有广泛的应用。现有研究未公 开单宁酸具有激活HIV-1储藏库的作用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供单宁酸作为HIV-1潜伏感染激活剂的应用。
[0005] 实验数据显示，单宁酸具有良好的HIV-1潜伏激活能力。发明人采用本实验室构 建的整合了表达GFP的全长HIV-1的化rkat潜伏感染的细胞模型，通过高通量筛选含有 1600种成药的成药库发现单宁酸能够有效地激活潜伏感染的HIV-1。进一步用多种J-Lat 潜伏感染的细胞模型重复实验，发现单宁酸激活HIV-1潜伏感染的效果相对稳定。下一步 我们将分别在人原代CD4+T细胞的HIV-1潜伏感染模型和病人的临床样本中分别验证单 宁酸的激活效果。经实验证明，单宁酸在化rkat细胞中的EC50为46. 63μ6,具有较好的 潜伏激活作用。单宁酸是已经在临床上使用的药物，其毒性较低，安全性好，但目前尚未有 人报道其作为HIV-1潜伏感染激活剂的相关用途。本专利旨在为单宁酸作为HIV-1潜伏感 染激活剂的进一步开发提供的强有力的理论基础和实践基础，证明其具有重要的研发价值 和开发意义。
【附图说明】
[0006] 图1:本实验室的化rkatHIV-1潜伏感染细胞系的激活效果及单宁酸在该细胞 系中对HIV-1潜伏感染的激活情况，结果显示单宁酸在该系统中能够有效地激活潜伏的 HIV-1。
[0007] 图2:单宁酸在不同的HIV-1潜伏感染细胞系模型J-Lat8. 4及J-Lat10. 6中能 够有效地激活HIV-1。
[0008] 图3:使用目前常见的多种HIV-1潜伏感染的激活剂对比在它们各自在J-Lat HIV-1潜伏感染细胞系中的激活效果。
[0009] 图4:使用目前常见的多种HIV-1潜伏感染的激活剂对比在它们各自在J-Lat HIV-1潜伏感染细胞系中的激活效果。 图5 :单宁酸在J-LatHIV-1潜伏感染的细胞系中的EC50是46. 63μ邑。
【具体实施方式】
[0010] 下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。
[0011] 实验一：化rkatHIV-1潜伏感染细胞系的构建及单宁酸在该系统中的激活效果。 [001引 1.实验方法： 1) 取生长良好的人肾上细胞株239T细胞，接种于10cm平底板中。使用的培养基是完 全培养基：高糖DMEM，10%胎牛血清W及1%双抗，培养条件是5%二氧化碳、37°C; 2) 24h贴壁后，转染抑L4-3-转染件是培养基是完全培养基和VSV-G，如1)的条件继 续培养； 3) 48h后，收取上清，使用阳G-6000离屯、浓缩病毒颗粒，使用化ISAP24试剂盒检测病 毒P24; 4) 取生长良好的化rkat细胞计数后，用3)中得到的病毒进行感染，病毒用量约为10 ng/lg/到6细胞；(感染时使用促感染试剂polybrene); 5) 感染6h后换液，使用PBS清洗Ξ次，弃上清，使用1640培养基（10%胎牛血清，1%双 抗）培养， 6) 培养4-5天后，使用流式分选仪分选GFP-细胞，继续使用1640培养基培养； 7) 培养7天后，用TNF-;刺激分选后的细胞，浓度为10ng/ml。24h后，使用流式分选 仪分选GFP+细胞，继续使用1640培养基培养； 8) 培养4weeks后，用TNF-e刺激分选后的细胞，浓度为lOng/ml。24h后，使用流式分 选仪分选GFP+细胞，继续使用1640培养基培养； 9) 重复8)Ξ次，此时使用TNF-此的激活，GFP+比例大概在25%左右，化rkat潜伏 细胞模型构建成功，并可进行后续优化，其特点是该细胞模型是一个复合群，里面存在各种 HIV-1整合位点； 10) 取生长良好的化rkat潜伏细胞铺于96孔透明板中，每孔2透明板5细胞.分别加 入单宁酸，终浓度50加入，对照使用DMS0。使用1640培养； 11) 培养2地，离屯、收取细胞，弃上清，使用PBS清洗一次，弃上清，然后用PBS重悬； 12) 使用流式细胞仪检测相应细胞的GFP表达水平，并作统计图分析结果。
[0013] 实验结果如图1所示。从图中可W看出，本实验室构建的HIV-1潜伏感染模型，能 够有效的被HIV-1潜伏感染激活剂TNF-a激活。使用单宁酸处理该模型，同样可W有效激 活HIV-1潜伏感染细胞。
[0014] 实验二：单宁酸在HIV-1潜伏感染细胞模型J-Lat8. 4及J-Lat10. 6中的激活效 应 实验方法： 1) 分别取生长良好的J-Lat8. 4及J-Lat10. 6细胞铺于96孔透明板中，每孔2孔明 板5细胞；分别加入单宁酸，终浓度50μ0,对照使用DMS0。使用的培养基是完全培养基： 1640培养基，10%胎牛血清W及1%双抗，培养条件是5%二氧化碳、37°C; 2) 培养24h，离屯、收取细胞，弃上清，使用PBS清洗一次，弃上清，然后用PBS重悬； 3) 使用流式细胞仪检测相应细胞的GFP表达水平，并作统计图分析结果。
[0015] 实验结果如图2和3所示。从图中可W看出，对目前多个广泛使用的HIV-1潜伏 感染单克隆细胞模型，单宁酸同样可W起到良好的激活作用。
[0016] 实验Ξ:不同的HIV-1潜伏感染激活剂在J-Lat细胞模型中的激活效果的对比 实验方法： 1) 取生长良好的J-Lat细胞铺于24孔透明板中，每孔6透明板5细胞。分别加入单宁 酸、SAHA、JQ1，对照使用DMS0。使用的培养基是完全培养基：1640培养基，10%胎牛血清W 及1%双抗，培养条件是5%二氧化碳、37°C; 2) 培养24h，离屯、收取细胞，弃上清，使用PBS清洗一次，弃上清，然后用PBS重悬； 3) 使用流式细胞仪检测相应细胞的GFP表达水平，并作统计图分析结果。
[0017] 实验结果如图4所示。从图中可W看出，与其他已报道的能够有效激活HIV-1潜 伏感染的化合物相比，单宁酸的激活效果良好。
[0018] 实验四：单宁酸在J-LatHIV-1潜伏感染细胞系中的EC50 实验方法： 1)取生长良好的J-Lat细胞铺于96孔透明板中，细胞用量为2胞用量^孔。分别加 入不同浓度的单宁酸，终浓度分别为：320μM，160μM，80μM，40μM，20μM，10μM，5 μΜ，0μΜ： 2) 培养24h，离屯、收取细胞，弃上清，使用PBS清洗一次，弃上清，然后用PBS重悬； 3) 使用流式细胞仪检测相应细胞的GFP表达水平，并作统计图分析结果。
[0019] 实验结果如图5所示。从实验结果可W看出，单宁酸的EC50是46. 63μΜ(由 prism软件计算得出），具有较好的潜伏感染的激活效果。
[0020] 单宁酸的衍生物，特别是其为药学可接受的盐、醋，如其钢、钟、巧、铁、亚铁、锋盐、 乙醋、下醋等在体内可W水解出单宁酸，因而具有与单宁酸相同或相近的活性，同样可W激 活HIV-1潜伏感染，便于HIV的后续治疗。
【主权项】
1. 单宁酸及其衍生物作为HIV-ι潜伏感染激活剂的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：单宁酸的衍生物为其药学上可接受的盐、 酯。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：单宁酸药学上可接受的盐为其钠、钾、钙、 铁、亚铁、锌盐。4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：单宁酸药学上可接受的酯为其乙酯、丁 酯。5. -种HIV-1潜伏感染激活剂，其活性成分为单宁酸或其衍生物。6. 根据权利要求5所述的HIV-1潜伏感染激活剂，其特征在于：单宁酸的衍生物为其 药学上可接受的盐、酯。7. 根据权利要求6所述的HIV-1潜伏感染激活剂，其特征在于：单宁酸药学上可接受 的盐为其钠、钾、钙、铁、亚铁、锌盐。8. 根据权利要求6所述的HIV-1潜伏感染激活剂，其特征在于：单宁酸药学上可接受 的酯为其乙酯、丁酯。
【专利摘要】本发明公开了单宁酸作为HIV-1潜伏感染激活剂的应用。运用了整合了带有<i>GFP</i>报告基因的HIV-1的Jurkat潜伏感染细胞系，通过高通量筛选成药库证实单宁酸具有激活HIV-1潜伏的作用，导致筛选系统中GFP表达量将上调。并且进一步通过在J-Lat等多个HIV-1潜伏感染的细胞模型克隆株中的实验证实，该药物的确存在良好的激活HIV-1潜伏的作用。经实验证明，单宁酸在J-Lat细胞中的EC50为46.63μM，具有较好的HIV-1潜伏感染的激活效果，单宁酸在HIV-1潜伏感染的激活方面具有重要的研发价值和开发意义。
【IPC分类】A61K31/7024, A61P31/18
【公开号】CN105380954
【申请号】CN201510745224
【发明人】张辉, 陈灿灿, 刘超
【申请人】中山大学
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年11月3日