一种噬菌体制剂及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物工程领域，特别是一种隧菌体制剂JS-15及其应用。
【背景技术】
[0002] 仔猪腹泻是养猪业的常见问题，已成为制约养猪业健康发展的瓶颈问题，尤其是 1-3月龄的仔猪更为常见，断奶后的仔猪腹泻发生率高达30%，死亡率达10%-15%。仔猪发 病后生长速度缓慢，饲料报酬降低，同时，由于腹泻，体质下降、免疫功能减退、对疫病的抵 抗力减弱，轻易继发其它传染病，治疗不及时就会引起大批死亡，给养猪业造成极大的经济 损失。
[0003] 为追求母猪高产、增加母猪生产胎次，国际上推行仔猪早期断奶技术，即在小猪刚 生下28天到35天，就给小猪断奶、与母猪分开饲养，母猪重新配种怀孕生产。由于运个阶段 的小猪肠道还没发育完全，还没学会吃固体饲料、肠道微生物区系尚未建立、免疫系统发育 不全，外界寒冷、高溫、固体饲料等各种因素常导致仔猪应激、易受各种病菌感染，尤其易受 产肠毒素大肠杆菌感染、导致仔猪腹泻、脱水而死，或者导致仔猪生长停滞、变成僵猪。大量 研究发现，在发生腹泻的仔猪粪便中84.3%可W分离到产毒素大肠杆菌K88和K99,运表明， 产肠毒素大肠杆菌Κ88、Κ99是导致仔猪腹泻的主要病原菌。
[0004] 产肠毒素性大肠杆菌化nterotoxigenic Escherichia coli .，ETEC)是一类引起 幼畜（初生仔猪、辖牛、黑羊)腹泻的重要病原菌，初生幼畜被ETEC感染后，常因剧烈水样腹 泻和迅速脱水而死亡，发病率和死亡率均很高，给养殖业带来严重的经济损失。据报道，国 内约有35%的仔猪腹泻是由ETEC引起的，美国等国家新生仔猪腹泻中，由ETEC引起的占 45% W上，给养殖业带来严重的经济损失。ETEC粘附素抗原主要有K88化88ab，K88ac， 1(88曰(1)，1(99,987口^41^42等几种，其中1(88、1(99是最常见的、也是引起养殖场幼畜高发病 率和高死亡率的主要原因。
[0005] 目前，对于由产肠毒素大肠杆菌引发的仔猪腹泻，尚无特效药物和有效方法进行 治疗，实践中主要依赖抗生素治疗，抗生素的使用虽然能遏制病菌，但抗生素的使用破坏了 仔猪肠道微生物菌群区系、抑制了免疫系统的发育完善、常造成生长停滞甚至僵猪，且随着 细菌耐药性的增加，抗生素的治疗效果也受到影响。也有一些研究报道，采用卵黄抗体或中 药、或疫苗、或通过母猪免疫等治疗方法，但实际实验结果仍存在运样那样的问题，影响了 治疗效果。因此，寻找新型、有效的防治仔猪腹泻的药物或产品已经成为当务之急。
[0006] 隧菌体是一种细菌病毒，尤其裂解性隧菌体是一类W细菌为宿主、利用细菌复制 自己、最后把细菌裂解掉的病毒，因其具有天然的裂菌特性、被认为是一种潜在的新型杀菌 物质。目前，随着耐药菌的日益增加，隧菌体越来越受到国内外专家的广泛关注。2006年8 月，美国食品药品监督局(FDA)首次批准了隧菌体化ISTEXTM P100)产品作为食品添加剂， 用于防控即食性食品及家禽类制品中李斯特菌化isiteria)污染;2010年3月，韩国希杰饲 料公司又首次使用裂解性沙口氏菌隧菌体作为饲料添加剂用于杀灭饲料中的鸡沙口氏菌 和鸡白频沙口氏菌，运两个实例已充分证实隧菌体作为有效的天然杀菌剂有着极大的应用 价值及广阔的应用前景。
[0007]申请人于2009的专利化200910263295.0中公开了一种产肠毒素大肠杆菌隧菌体 EK99-C(保藏号为CCTCC Μ 209208)，对引起仔猪腹泻的产肠毒素大肠杆菌K99有很好的裂 解作用。但在后续的实验中发现，仔猪中大肠杆菌Κ88的感染也非常严重，仅WK99隧菌体不 能有效控制仔猪的腹泻。
[0008] 目前已存在关于大肠杆菌Κ88和Κ99的裂解性隧菌体的文献报道，如解大肠杆菌 Κ88的ΡΚ88-4隧菌体(王冉等，华北农学报，2012)，该隧菌体与本发明中ΕΚ88-4同时分离获 得，两者均属于带有可伸缩性尾己的肌尾科隧菌体，但ΕΚ88-4较ΡΚ88-4有更广的隧菌谱和 更强的杀菌效力；何觅之于2012年发表的硕±论文中（]11:19://'\￥冊.(1〇。88.(3〇111/口-9973640509846. html )，在种猪场分离获得1株大肠杆菌Κ8別蘆菌体化8Α0811和2株大肠杆菌 K99的隧菌体化9B1226、Bp9C1213,但是作者并没有公开隧菌体的透射电镜图，也没有提供 隧菌体裂菌谱，仅提供了对宿主菌的裂解效力，没有提供对仔猪腹泻病原菌分离株的裂解 能力及对仔猪腹泻防治药物应用方面的相关数据。
【发明内容】
[0009] 针对上述问题，本发明提供一种隧菌体制剂，W导致仔猪腹泻的主要病原菌产肠 毒素性大肠杆菌K88和K99的产肠毒素性大肠杆菌K88和隧菌体EK99-C为主要有效活性成 分，复合抗菌肤和辅料配制而成，用于制备防治仔猪由运两种病原菌引发腹泻的药物W及 净化养殖环境、设施，杀灭大肠杆菌K88和K99，本发明是运样实现的：
[0010] -种隧菌体制剂，包括有效成分和辅料，该有效成分是由保藏号为CCTCC No:M 209243的产肠毒素性大肠杆菌K8別蘆菌体与于保藏号CCTCCN0:M209208隧菌体邸99-C混合 而成，其总隧菌体有效量> 106PFU/mL。
[0011] 进一步，本发明所述有效成分中产肠毒素性大肠杆菌K88隧菌体与隧菌体邸99-C 的含量比值为1:1。
[0012] 进一步，本发明所述辅料为SM缓冲液、海藻酸钢、薦糖、麦芽糖糊精、葡萄糖中的一 种或多种。
[0013] -种本发明所述的隧菌体制剂在制备防治仔猪腹泻药物中的应用。
[0014] 一种本发明所述的隧菌体制剂在杀灭环境中大肠杆菌K88和K99中的应用。
[0015] 进一步，本发明所述应用是指，将效价为lX106p化/mL的隧菌体制剂W50ml/m3喷 洒于环境中，W杀灭环境中的大肠杆菌K88和K99。
[0016] 本发明的有益效果在于：
[0017] (1)本发明所提供的隧菌体制剂一种复配型产肠毒素性大肠杆菌Κ88、Κ99的广谱 隧菌体制剂，是通过将两株裂解性产肠毒素性大肠杆菌Κ88、Κ99隧菌体与辅料复配作为有 效杀菌成分，与单一裂解性隧菌体相比，大大拓宽了其杀菌范围，增加其杀菌活性。
[0018] (2)由于本制剂中的大肠杆菌Κ88及Κ99的隧菌体均分离自养殖场环境，属于环境 中自有的物质，不会对环境或动物产生毒害，且隧菌体经过纯化后无色、无味、无刺激性， 安全环保。
[0019] (3)该隧菌体制剂对分离到的耐药性产毒素大肠杆菌Κ88和Κ99较抗生素有很好的 杀灭作用，因此作为药物应用能更有效地治疗和控制由运两种病原菌引发的仔猪腹泻。
【附图说明】
[0020] 图1产肠毒素性大肠杆菌K88隧菌体的透射电镜照片。
[0021] 图2为实施例隧菌体制剂JS-15的杀菌效果实验结果示意图。
【具体实施方式】
[0022] 实施例中SM缓冲液的配制方法为:NaCl 5.8g，MgS〇4 · 7此0 2g，lmol/L的Tris · 肥 1 50ML(抑=7.0)，5mL 2%gelatin，加入纯净水补足至lOOOML。
[0023] 实施例1产肠毒素性大肠杆菌K88隧菌体分离、扩增及纯化
[0024] 隧菌体分离：W购自中国兽医微生物菌种保藏管理中屯、的CVCC 1502(血清型为 09 : K88ac)为宿主分离隧菌体。将买回来细菌、分别复苏培养，挑取LB平板上的单个K88菌 落，将其接种于5mL LB培养基中，37°C，150rpm震荡过夜，制备过夜细菌溶液。采集养猪场粪 尿污水样品（江苏某猪场），将其经双层滤纸过滤，12000 X g离屯、20min，再分别用0.45WI1和 0.2化m滤膜过滤上清液；取lOmL过滤液，加入0.5mL过夜培养的宿主菌（含菌量为10 9c化/ mL)，再加入20mL 4XLB培养基，放置于37°C培养12~16h，次日，取上述培养物Wl2000Xg 离屯、lOmin，取上清并加入占上清体积0.3%的氯仿备用；W点样试验，鉴定该上清是否含有 大肠杆菌K88隧菌体，如果点样试验形成透亮裂菌斑，再进行双层平板法检测隧菌体效价。
[0025] 扩增:将获得的大肠杆菌K8別蘆菌体与宿主菌按数量比1:1混合，加入lOOmL LB液 体培养基，再加入CaCb至终浓度lmM，37°C摇振培养12-16}1，12000巧111，4°(3，离屯、10111111，取 上清，扩增得到大肠杆菌K88隧菌体裂解液。
[0026] 纯化：在获得的lOOmL大肠杆菌K8別蘆菌体裂解液中加入RNase A至化g/mU加入 面asel至化g/mL，37°C溫育30min后，加 lO.Og阳G 8000,5.84g化C1，摇匀至溶解，冰浴化 (实际操作中，也可W4°C过夜），再于4°C离屯、1