miR-506在制备预防或/和治疗胰腺癌的药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体设及miR-506在制备预防或/和治疗膜腺癌的药物 中的应用。
【背景技术】
[0002] 根据最新流行病学调查，膜腺癌位居欧美等发达国家恶性肿瘤死亡率第四位，全 球每年约250万人死于膜腺癌。近20年来我国膜腺癌的发病率持续增高，目前膜腺癌位居恶 性肿瘤死亡率第五位。在膜腺癌的治疗中，外科手术、化疗及放疗等手段的疗效均不尽人 意，其术后1年生存率不到20%，5年生存率仅为4%。因此，发现一种特有的、可用于早期诊 断和预后的标记物和祀向分子，对于战胜膜腺癌具有重要意义。
[0003] microRNAs(miRNAs)是近年来发现的一种长约22个核巧酸的内源性非编码RNA，可 与目的基因3'UTR结合降解mRNA和(或)抑制其翻译，在转录后调控基因表达。人类基因组中 目前已经被鉴定的miRNA数目在1000个W上，miRNA具有高度保守性，在个体生长发育W及 包括肿瘤在内的多中疾病的发生发展过程中发挥重要作用。最近的许多研究发现miRNA参 与肿瘤细胞的增殖、调亡、分化、耐药及侵袭转移，与肿瘤的发生和发展密切相关。
[0004] 研究表明，在不同的肿瘤中，miR-506的功能不尽相同。miR-506在径喜树碱耐药的 结肠癌细胞中高表达，miR-506的过表达可W下调PPARa提高癌细胞的耐药性。在黑色素瘤 中，miR-506可W启动黑色素细胞的恶性转化、促进黑色素瘤的生长。相反，在恶性转化后的 人支气管上皮细胞（16皿E-T)中miR-506低表达;过表达miR-506后可W抑制细胞增殖，诱导 G0/G1细胞周期阻滞，明显抑制细胞的错定非依赖生长W及裸鼠移植瘤模型的生长。但miR-506 在调节膜腺癌的的表达及临床相关性， W 及它所发挥的作用和分子机制仍未见报道。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供miR-506在制备预防或/和治疗膜腺癌的药 物中的应用;本发明的目的之二在于提供miR-506与吉西他滨联合用于制备预防或/和治疗 膜腺癌的药物中的应用;本发明的目的之S在于提供检测miR-506的试剂在制备诊断和预 示膜腺癌试剂盒中的应用。
[0006] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0007] l、miR-506在制备预防或/和治疗膜腺癌的药物中的应用。
[000引进一步，所述miR-506在制备抑制膜腺癌细胞增殖的药物中的应用。
[0009] 进一步，所述miR-506在制备抑制膜腺癌成瘤能力的药物中的应用。
[0010] 进一步，所述miR-506在制备诱导膜腺癌细胞细胞周期阻滞的药物中的应用。
[0011] 进一步，所述miR-506在制备诱导膜腺癌细胞调亡的药物中的应用。
[0012] 2、miR-506与吉西他滨联合用于制备预防或/和治疗膜腺癌的药物中的应用。
[OOU] 3、检测miR-506的试剂在制备诊断和预示膜腺癌试剂盒中的应用，miR-506在膜腺 癌中明显低表达。
[0014] 进一步，所述诊断和预示为评估膜腺癌预后效果，miR-506低表达的膜腺癌患者预 后差。
[0015] 本发明的有益效果在于:本发明通过对miR-506在膜腺癌、癌旁组织和正常膜腺表 达进行分析，发现在膜腺癌组织及膜腺癌细胞中miR-506明显低表达，临床分析显示miR-506 低表达的膜腺癌患者预后差，因此 miR-506 可 W 作为诊断和预示膜腺癌的标志物。进一 步探索miR-506低表达的机制，发现miR-506启动子在癌组织中高甲基化，在癌旁及正常膜 腺组织中低甲基化，并且甲基化水平和miR-506表达呈负相关;用去甲基化试剂处理膜腺癌 细胞株后发现miR-506表达上调，表明甲基化可能是miR-506低表达的主要原因，临床分析 还发现高甲基化与膜腺癌患者预后负相关。
[0016] 通过在膜腺癌细胞中过表达miR-506发现miR-506miR-506显著抑制膜腺癌细胞增 殖抑制裸鼠皮下成瘤能力，降低Ki-67表达，流式检测表明miR-506诱导膜腺癌细胞细胞周 期阻滞和调亡，调亡标志物cleaved-PARP和caspase-3在过表达miR-506组中明显上调，因 此miR-506可W作为预防和治疗膜腺癌的药物;通过细胞存活实验还发现miR-506增强膜腺 癌细胞对吉西他滨的敏感性，因此miR-506可W与吉西他滨联合用药，提高吉西他滨的治疗 效果。进一步对治疗或预防膜腺癌的机制进行研究发现，miR-506和SP皿1的表达在细胞株 及膜腺癌组织中呈负相关，miR-506还可W下调PI3K/AKT通路下游相关分子表达，表明miR-506通过SPHK1/PI3K/AKT信号通路抑制膜腺癌生长，促进细胞周期阻滞和调亡，为膜腺癌的 治疗提供了新的标志物，对临床膜腺癌的诊断和治疗具有重要意义。
【附图说明】
[0017] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0018] 图1为膜腺癌、癌旁组织及正常膜腺组织中miR-506表达结果(a.膜腺癌与癌旁组 织比较结果，Aj表示癌旁组织，T表示膜腺癌组织;b.正常组织与膜腺癌组织比较结果，N表 示正常组织，T表示膜腺癌组织;C.生存分析结果）。
[0019] 图2为膜腺癌、癌旁组织及正常膜腺组织中miR-506启动子甲基化检测结果(a.癌 旁组织与膜腺癌组织比较结果，Aj表示癌旁组织，T表示膜腺癌组织;b.正常组织与膜腺癌 组织比较结果，N表示正常组织，T表示膜腺癌组织;C.甲基化水平与miR-506表达分析结果； d.焦憐酸测序代表图）。
[0020] 图3为去甲基化试剂处理膜腺癌细胞株对miR-506表达的影响及临床生存分析结 果(a.去甲基化试剂处理膜腺癌细胞株与未处理细胞株miR-506表达情况;b.临床生存分析 结果）。
[0021] 图4为细胞增殖、成瘤能力和细胞周期实验结果(a和b为miR-506过表达细胞膜腺 癌细胞增殖实验结果;C和d为miR-506过表达细胞成瘤能力检测结果;e和f为流式细胞术检 ^UmiR-506过表达细胞膜腺癌细胞细胞周期结果）。
[0022] 图5为细胞调亡实验结果(a和b为流式细胞述检测miR-506诱导膜腺癌细胞调亡结 果；C和d为过表达miR-506对吉西他滨的敏感性实验；e为Western blot检测示过表达miR-506 细胞中 cleaved-PARP 和 caspase-3 表达情况 ）。
[0023] 图6为检测miR-506与SP服1作用（a.正常膜腺细胞株册C-Y5和人膜腺癌细胞株 AsPC-I ,CFPAC-I，Hs766t，PANC-l，BxPC-3的miR-506基因与SPHKl蛋白表达结果；b.miR-506 基因与SPHKl蛋白的线性关系）。
[0024]图7为双巧光素酶报告实验结果(a.野生型和突变型SP皿13'-UTR序列比对图；b. 双巧光素酶报告实验示巧光表达情况）。
[00巧]图8为Western blot检测PI3K/AKT通路下游相关分子表达情况。
【具体实施方式】
[0026] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0027] 本发明中膜腺癌及癌旁组织从第=军医大学西南医院肝胆外科取得，正常膜腺组 织从器官捐献者获取，手术取出后，组织块W生理盐水冲洗干净，迅速将组织切成小块，部 分样品放入2mL冻存管中与液氮中保存备用。
[00%] -、膜腺癌、癌旁组织及正常膜腺组织中miR-506表达情况
[0029] 首先根据miR-506基因序列：71-uaaggcacc州ucugaguaga-91(SEQ ID NO. 1)，设计 检测miR-506的引物，具体引物序列如下：5'-taaggcacccttctgagtaga-3'（SEQ ID N0.2)， 然后分别取膜腺癌、癌旁组织及正常膜腺组织，提取总RNA，反转为cDNA后获得的cDNA为模 板，SEQ ID NO.2所示引物为模板进行RT-qPCR检测miR-506表达情况，结果如图1所示。结果 显示，与癌旁组织相比，miR-506在膜腺癌中低表达（图1中a);与正常膜腺癌组织相比，miR-506 在膜腺癌中低表达(n=84)( 图1 中b);进一步临床生存分析表明miR-506 低表达患者较 miR-506高表达患者预后差（图1中C)。上述结果表明miR-506可W作为区分膜腺癌与正常膜 腺组织W及膜腺癌患者预后标志物。
[0030] 其中提取总RNA方法如下：取约IOOmg组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml的化izol (I^KaRa，大连)溶液，研磨组织后，倒1.5m化P管中，再在研磨器内加入0.8ml的化iZOl溶液 洗，后全部再倒入EP管中；颠倒混匀10下，室溫（18~25°C)静置5分钟。分离阶段：每1ml 化izol中加0.2ml氯仿，盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒，使其充分混匀，室溫（18~ 25°C)静置5分钟后12000rmp离屯、15分钟；然后将上层水相转入新的1.5mlEP管中（约400-SOOjil)，加入0.5ml异丙醇，混匀后放于室溫（18~25°C)3分钟后ISOOOrmp离屯、10分钟；小屯、 倒掉上清，留取沉淀，加 Iml现配的75%的乙醇(预冷)振荡洗涂RNA沉淀一次，后7500rmp离 屯、5分钟，小屯、倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干（约20分钟，此时RNA沉淀变透 明）；操作时不能让RNA沉淀完全干燥(会极大地降低它地可溶性），再在管中加20iU的DEPC 水溶解，在55-60°C下解育10分钟助溶。RNA的保存提取的RNA保存于-70°C超低溫冰箱中，或 立即用于逆转录。
[0031 ] RT-qPCR检测方法如下：miRNA反转录应用PrimeScript RT reagent kit (hKaRa)，WcDNA为模板，使用miR-506特定的引物及SYBR Premix Ex hq II(TaKaRa)试 剂盒的PCR体系，在Stratagene Mx3000P PCR仪（Agilent Technologies,San1:a Clara,CA, USA)上进行扩增，反应条件为:95°C30s;95°C5s、60°C30s，共40个循环，并WU6作内参，正向 引物序列：5'-。1:。邑。1:1:。邑邑。曰邑。曰。曰-3'（56〇10^.6);反向弓|物序列：5'-aacgcttcacgaatttgcgt-3'（沈Q ID N0.7)。
[0032] 二、检测miR-506启动子区CpG岛的甲基化状态
[0033] 为探索了miR-506低表达的机制，采用亚硫酸氨盐转化焦憐酸测序的方法检测膜 腺癌、癌旁组织及正常膜腺组织中miR-506启动子区CpG岛的甲基化状态。焦憐酸测序按上 海生工生物技术有限公司试验方法参照说明书进行，基本流程通过亚硫酸氨盐处理基因组 DNA，使其中未甲基化的C转变成T后，运用特异性引物扩增目的区段，然后用焦憐酸测序技 术测定目标位点中C/T的比率，W此判断目标位点的甲基化程度。其中扩增引物如下：正向 5'一t曰邑t曰t邑邑11邑曰t邑邑t邑邑t邑邑t曰一3'（SEQ ID NO.3)，& S 5'一biOtin- actcaataataaatcaactcatacaacc-3'（SEQ ID 則.4);测]序弓|物：5'-gtggtggtattgattattt1:aat-3'（沈Q ID N0.5)，检测结果如图2所示。由图2可知，miR-506启 动子在癌组织中高甲基化，在癌旁及正常膜腺组织中低甲基化（图2中a和b);然后分析甲基 化与甲基化的相关性，显示甲基化水平和miR-506表达呈负相关（图2中C和d)。