表明间歇性低氧后痴呆小鼠空间记忆能力增 强。
[0032] 上述研究结果表明间歇性低氧两周和四周可W增强痴呆小鼠的学习和记忆能力， 提高小鼠的认知功能。说明间歇性低氧可作为改善和治疗认知功能障碍和痴呆的一种干预 措施。
[0033] 实施例3间歇性低氧减少痴呆小鼠老年斑的数量
[0034] 利用免疫组化染色观察间歇性低氧对痴呆小鼠老年斑的数量的影响，具体步骤如 下：
[0035] 1.小鼠灌流及脑组织固定:戊己比妥钢(60mg/kg，i.p.)腹腔麻醉小鼠，剪开小鼠 腹部皮肤和肋骨，打开其胸腔，可见跳动的屯、脏，将灌流用针头插入小鼠左屯、室，迅速剪开 右屯、房，先用预冷的肝素化（含0.02%肝素钢）的生理盐水灌流5分钟，待屯、脏及肝脏变白 后，再用预冷的4%多聚甲醒灌流10分钟，然后取出脑组织放在含15%薦糖的4%多聚甲醒 中浸泡24h，再换成含30 %薦糖的0.0IM PBS溶液，放在4°C备用。
[0036] 2.小鼠大脑冰冻切片：用滤纸吸干脑组织表面水分，放入包埋剂内，置于冰冻切片 机中速冻，待包埋剂变成乳白色后，调整切片厚度为20皿，进行切片，脑片分六组收集于 0.OlM PBS中，4°C保存，进行免疫组化染色。
[0037] 3.免疫组化染色:采用漂片染色法，每次取一个拷贝的海马齿状回部位的大脑切 片进行AP免疫组化染色。
[003引（1)0.01 PBS 洗脑片 3 X 5min。
[0039] (2)l%TritonX-100(0.01 M PBS)RT 30min。
[0040] (3)0.01 PBS IX5min。
[0041 ] (4)去除内源性过氧化物酶，RT 15min(现用现配）。 甲醇 4 ml 、 0. 02 M PBS 10 ml ^蒸馈水定量至20 ml
[0042] 化 1 ml TritonX-IOO 40 ^
[0043] (5)0.01 PBS 3X5min。
[0044] (6)封闭：根据一抗来源选择封闭液:Mouse(马血清），Ra化it(羊血清），本实验所 用为羊血清。5%羊血清，1%854(质量体积比），用0.1%?851'(0.011?85+化^〇诚-100)配 置，RT，30-60min。
[0045] (7)-抗:A06E1O抗体稀释倍数为1:500，用封闭液稀释抗体，4°(：过夜，次日取出， RT 放置30-60min。
[0046] (8)0.01 M PBS 3X5min。
[0047] (9)二抗:生物素标记的二抗，稀释倍数（I :1000)，RT 2-3h。
[004引（10)0.01 PBS SXlOmin(同时准备AB液，室溫解育30min。
[0049] (Il)AB液，RT化(配置方法：如2ml AB液A+化1 B，出0配置到2ml)。
[0050] (12)0.01 M PBS SXlOmin。
[0051 ] (13)DAB显色：临用前制备DAB工作液，在Iml DAB稀释液中，加入约50iil DAB浓缩 液;滴加足W覆盖组织的上述DAB工作液，镜下观察显色情况，自来水终止染色。
[0052] (14)贴片，将脑片贴在载玻片(含明胶)上，室溫惊干。
[0053] (15)苏木素复染:苏木素复染20s，自来水冲洗返蓝10min，45°C干烤过夜。
[0化4] (16)梯度酒精脱水(70%、80%、90%、100% 各 5min)，二甲苯（X2各 IOmin)透明。
[0055] (17)中性树脂封片，显微镜读片。
[0056] (18)应用Image Pro Plus软件进行老年斑数量和面积的统计。
[0057] 小鼠脑中的老年斑是由A的冗积所形成的，A06E1O抗体可W特异性识别A0，因此，可 作为指示老年斑分布的特异性抗体。我们利用免疫组化方法对脑片进行A06E1O染色，老年 斑经DAB显色后呈现栋色斑块，利用Image Pro Plus软件进行斑块数量的统计。结果显示： 间歇性低氧两周和四周后痴呆小鼠大脑皮层和海马的老年斑块数量较常氧组明显减少(如 图6所示），统计学上具有显著差异(如图7-8所示）。间歇性低氧可W显著减少痴呆小鼠皮层 和海马的老年斑数量和面积，改善认知功能障碍。
[0058] 实施例4间歇性低氧减少痴呆小鼠淀粉样蛋白AP的沉积.
[0059] 利用ELISA方法检测间歇性低氧处理后APP/PS1小鼠大脑皮层和海马组织中A&-42 的含量。具体步骤如下：
[0060] 1.可溶性A如勺提取取小鼠皮层和海马组织，放入EP管中，加入相当8倍小鼠脑体积 的裂解液A(5M盐酸脈巧OmM Tris肥1)，匀浆器研磨充分后，室溫放置地，取组织匀浆液并 加入4倍体积的BSAT-DPBS缓冲液（含cocktail抑制剂，1:50稀释），12000rpm，4°C离屯、 20min，吸取上清，分装后储存于-80°C冰箱，各取化1样本进行蛋白浓度的测定。
[0061 ] 2. ELISA检测A执-42含量参照试剂盒说明书进行操作，步骤为：
[006^ (1)向每孔加入IOOiil标准稀释液谊白孔勿加。
[0063] (2)准备合适稀释度的样品（上步骤制备的样品稀释2倍)和标准品（稀释终浓度 为），向各孔加入10化1的A削太标准品和样本，空白孔勿加。
[0064] (3)每孔中加入AM2 Detection Antibody溶液，空白孔勿加，室溫解育化。
[0065] (4)弃去孔中溶液，清洗液洗板4次。
[0066] (5)每孔中加入10化1 HRP标记的抗兔IgG工作液，空白孔勿加，室溫解育30min。
[0067] (6)弃去孔中溶液，清洗液洗板4次。
[0068] (7)每孔中加入10化1稳定型色原体，室溫避光解育30min。
[0069] (8)每孔加入10化1终止液，轻轻混匀，溶液颜色由蓝变黄。
[0070] (9)应用酶标仪检测其在450nm处的吸光值，应在加入终止液30min内完成检测。
[0071] (10)根据标准品的吸光度值绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品中的AP浓度。
[0072] 结果显示：间歇性低氧处理两周和四周后，痴呆小鼠大脑皮层组织和海马组织中 的A&-4洽量均明显降低。
[0073] 综上，间歇性低氧降低痴呆小鼠大脑皮层组织和海马组织中A&-42的含量，减少痴 呆小鼠脑内老年斑的数量和面积，进而提高痴呆小鼠的学习记忆能力，有效地改善认知功 能障碍，有望成为一种治疗认知功能障碍和痴呆的干预措施。
【主权项】
1. 一种间歇性低氧方法，其特征在于，在低氧舱中，以低氧-常氧交替的方式给予哺乳 动物氧气，低氧的时间为2-6小时，氧分压为:70.8-141.2mmHg;常氧的时间为18-22小时，氧 分压为：140.8-181.2mmHg。2. 根据权利要求1所述的间歇性低氧方法，其特征在于，所述哺乳动物为人，鼠，马，牛， 羊，狗，兔，猪或猴。3. 权利要求1所述的间歇性低氧方法在提高动物认知方面的用途，其特征在于，将哺乳 动物在低氧舱以低氧-常氧交替的方式进行处理，在低氧环境中生活2-6小时，其余18-22小 时置于常氧环境；所述的低氧为氧分压为：70.8-141.2mmHg,常氧氧分压为：140.8-181.2mmHg;连续处理7-42天。4. 权利要求1所述的间歇性低氧方法在治疗哺乳动物认知功能障碍、老年痴呆方面的 用途，其特征在于，将认知功能障碍或老年痴呆的哺乳动物在低氧舱以低氧-常氧交替的方 式进行处理，在低氧环境中生活2-6小时，其余18-22小时置于常氧环境;所述的低氧为氧分 压为:70.8-141.2mmHg，常氧氧分压为：140.8-181.2mmHg;连续处理7-42天。
【专利摘要】本发明公开了间歇性低氧在提高认知功能方面的用途。间歇性低氧是以低氧-常氧交替的方式给予氧气，低氧的时间为2-6小时，氧分压为：70.8-141.2mmHg；常氧的时间为18-22小时，氧分压为：140.8-181.2mmHg；连续处理7-42天。本发明的间歇性低氧方案可用于提高哺乳动物的认知功能，提高学习记忆能力，治疗哺乳动物认知功能障碍和老年痴呆。
【IPC分类】A61K33/00, A61P25/28, A61G10/02
【公开号】CN105662753
【申请号】CN201610018510
【发明人】黄欣, 乔萌, 周延召, 赵彤, 吴丽颖, 朱玲玲, 范明
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年1月12日