，所述方法W使用标准分子生物学技术例如PCR或RT-PCR克隆和分离编码PRG4蛋白或同 种型的CDNA和mRNA开始。然后，将编码PRG4蛋白或同种型的分离的CDNA克隆到表达载体中， 并进一步在宿主细胞中转化和表达，从而产生重组PRG4蛋白。
[0052] 如本文中所用的"重组"是指体外合成的或者W其它方式操作的多核巧酸（例如 "重组多核巧酸"），是指使用重组多核巧酸在细胞或其它生物体系中产生基因产物的方法， 或者是指由重组多核巧酸编码的多肤（"重组蛋白重组"还包括将具有来自不同来源的 各种编码区或结构域或启动子序列的核酸连接成表达盒或载体，用W表达(例如，诱导型或 组成型表达)包含使用本发明的引物扩增的核酸序列和PRG4基因的活性结构域的融合蛋 白。
[0053] 在某些实施方式中，PRG4蛋白编码核酸可含有一个或多个突变、缺失或插入。在运 样的实施方式中，PRG4蛋白编码核酸与野生型PRG4蛋白编码核酸具有至少60%的同源性， 优选75%的同源性，更优选85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同源性。
[0054] 如本文所使用的术语"cDNA"包括与细胞中存在的mRNA分子互补的DNA或者可使用 酶例如逆转录酶转化为CDNA的生物体mRNA。在某些实施方式中，使用本领域中公知的RT-PCR方法从人角膜或结膜上皮细胞中表达的PRG4mRNA中分离编码PRG4蛋白的cDNA。
[0055] 如本文所使用的术语"多核巧酸"、"核酸/核巧酸"和"寡核巧酸"可互换地使用，并 且包括任何长度的聚合形式的核巧酸，脱氧核糖核巧酸或核糖核巧酸，或者其类似物。多核 巧酸可具有任何=维结构，并且可发挥任何已知或未知的功能。下列是多核巧酸的非限制 性实例:基因或基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、DNA、 cDNA、基因组DNA、重组多核巧酸、分支多核巧酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序 列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核巧酸可W是天然存在的、合成的、重组的或其任意组 厶 1=1 O
[0056] 多核巧酸可包括修饰核巧酸，例如甲基化核巧酸和核巧酸类似物。如果存在的话， 对核巧酸结构的修饰可在聚合物的装配之前或之后赋予。可用非核巧酸组分中断核巧酸的 序列。多核巧酸可在聚合后进一步修饰，如通过与标记组分接合。该术语还包括双链和单链 分子两者。除非另有说明或者需要，作为多核巧酸的本发明的任何实施方式涵盖双链形式 W及已知或预计组成双链形式的两个互补单链形式中的每一个。
[0057] 如本文所使用的术语"多核巧酸序列"是多核巧酸分子的字母表示。多核巧酸由四 种核巧酸碱基的特定序列组成:腺嚷岭(A);胞喀晚(C);鸟嚷岭(G);胸腺喀晚(T); W及代替 胸腺喀晚的尿喀晚化）（当多核巧酸为RNA，而不是DNA时）。运种字母表示可W输入到计算机 的数据库中并用于生物信息应用，例如功能基因组和同源性检索。
[0058] 如本文所使用的术语"分离的多核巧酸/cDNA"包括与天然来源的多核巧酸中存在 的其它多核巧酸分子分离的多核巧酸分子。例如，关于基因组DNA，术语"分离的"包括与基 因组DNA天然关联的染色体分离的多核巧酸分子。优选地，"分离的"多核巧酸不含天然地位 于得到所述多核巧酸的生物体的基因组DNA中的多核巧酸侧翼的序列（即，位于目标多核巧 酸的5'端和3'端的序列）。例如，在多种实施方式中，在本发明中使用的编码PRG4蛋白的分 离的多核巧酸分子可含有小于约化6、4此、3此、化6、1此、0.化6或0.化6的核巧酸序列，所述 核巧酸序列天然地位于得到所述多核巧酸的细胞的基因组DNA中多核巧酸分子的侧翼。而 且，"分离的"多核巧酸分子，例如CDNA分子，当通过重组技术产生时，可基本上不含其它细 胞材料或培养基，或者当其通过化学方式合成时，可基本上不含化学前体或其它化学品。
[0059] 如本文所使用的"基因"包括含有至少一个在转录和翻译后能够编码特定多肤或 蛋白的可读框的多核巧酸。本文中所述的任何多核巧酸序列也可用于鉴定与它们有关的基 因的较大片段或全长编码序列。分离较大片段序列的方法是本领域技术人员已知的。如本 文所使用的"天然的或天然存在的"多核巧酸分子包括例如具有天然存在的核巧酸序列(例 如，编码天然蛋白）的RNA或DNA分子。
[0060] 如本文所使用的术语"多肤"或"蛋白"是可互换的，并且包括两个或更多个亚基氨 基酸、氨基酸类似物或肤模拟物(peptidomimetic)的化合物。所述亚基可通过肤键连接。在 另一实施方式中，所述亚基可通过其它键，例如醋、酸等连接。如本文所使用的术语"氨基 酸"包括天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D或L旋光异构体两者，W及氨基 酸类似物和肤模拟物。立个或更多个氨基酸的肤通常称作寡肤。超过=个或更多个氨基酸 的肤链称作多肤或蛋白。
[0061] 在某些实施方式中，如本文所使用的PRG4蛋白是指在人或其它宿主细胞中天然或 重组表达的PRG4蛋白或其各种同源物或同种型。如本文所使用的"表达(express)"或"表达 (e邱ression)"包括多核巧酸转录为RNA和/或翻译为多肤的过程。如果多核巧酸是源自基 因组DNA的，当选择合适的真核宿主时，表达可包括RNA的剪接。表达所需的调节元件包括结 合RNA聚合酶的启动子序列和用于核糖体结合的转录起始序列。例如，细菌表达载体包括启 动子例如Iac启动子W及用于转录起始的化ine寸algarno序列和起始密码子AUG。类似地， 真核表达载体包括RNA聚合酶II的异源或同源启动子、下游聚腺巧酸化信号、起始密码子 AUG和用于核糖体脱离的终止密码子。运样的载体可商购获得或者通过本领域公知的方法 例如W下所述通常用于构建载体的方法中所述序列进行装配而获得。如本文所使用的术语 "载体"包括将插入的多核巧酸转移到宿主细胞中和/或在宿主细胞之间转移的自我复制的 核酸分子。该术语意在包括主要功能是将核酸分子插入到细胞中的载体、主要功能是复制 核酸的复制载体、W及功能是转录和/或翻译DNA或RNA的表达载体。该术语还意在包括提供 多于一种的W上功能的载体。
[0062] 如本文所使用的"宿主细胞"意在包括任何个体细胞或细胞培养物，其可W是或者 已经是载体用受体或者用于引入外源多核巧酸和/或多肤的受体。其还意在包括单个细胞 的后代。由于天然的、偶然的或故意的突变，后代可不必与原始亲代细胞完全相同（在形态 学或者基因组或总DNA互补体方面）。细胞可W是原核的或真核的，包括但不限于细菌细胞、 酵母细胞、昆虫细胞、动物细胞和哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包括但不限于鼠类、大 鼠、猿猴或人细胞。如本文所使用的"宿主细胞"还包括遗传修饰细胞。术语"遗传修饰细胞" 包括含有和/或表达外来或外源基因或多核巧酸序列的细胞，而所述外来或外源基因或多 核巧酸序列又改变细胞或其后代的基因型或表型。"遗传修饰"还包括含有或表达已经被引 入到细胞中的基因或多核巧酸序列的细胞。例如，在该实施方式中，遗传修饰细胞已经引入 有对该细胞而言也是内源性的基因。术语"遗传修饰"还包括对细胞的内源核巧酸的任何添 加、缺失或破坏。如本文所使用的"宿主细胞"可为表达人PRG4蛋白的任何细胞。
[0063] 如本文所使用的"同源物"在本文中定义为分别具有类似的或基本上相同的核酸 或氨基酸序列的两个核酸或肤。术语"同源物"还涵盖由于遗传密码的简并性而不同于核巧 酸序列之一而编码相同的氨基酸序列的核酸分子。在一个优选的实施方式中，同源物包括 编码PRG4蛋白的核酸（例如，SEQ ID NO: 1)的等位基因变体、直向同源物、横向同源物 (paralog)、激动剂W及括抗剂。
[0064] 如本文所使用的术语"直向同源物"是指来源于不同的物种但由共同的祖先基因 通过物种形成进化而来的两个核酸。通常，直向同源物编码具有相同或类似功能的肤。具体 地说，本发明的直向同源物与任何已知的PRG4蛋白（例如，SEQ ID N0:1)、其同种型或类似 物的所有或部分的氨基酸序列通常呈现出至少80~85%，更优选85~90%或90~95%，且 最优选95 %、96 %、97 %、98 %或甚至99 %的同一性，或100 %的序列同一性，并且呈现出与 运些肤类似的功能。
[0065] 为了确定两个氨基酸序列的百分序列同一性，W进行最佳比较为目的进行序列比 对(例如，为了与其它多肤或核酸进行最佳比对，可在一个多肤的序列中引入缺口）。然后比 较相应氨基酸位置处的氨基酸残基。当一个序列中的位置被与另一序列中相应位置处的相 同的氨基酸残基占据时，则分子在该位置处是相同的。在两个核酸序列之间可W进行相同 类型的比较。两个序列之间的百分序列同一性是所述序列共享的相同位置数的函数（即，百 分序列同一性=相同位置数/位置总数X 100)。优选地，本发明中包括的分离的氨基酸同源 物与任何已知PRG4蛋白的整个氨基酸序列（例如，SEQ ID NO: 1)是至少约50~60%，优选至 少约60~70%，且更优选至少约70~75%、75~80%、80~85%、85~90%或90~95%，且最 优选至少约96%、97%、98%、99%或更高相同的。
[0066] 在某些实施方式中，编码PRG4蛋白的分离的核酸同源物包括与编码运种PRG4蛋白 的氨基酸序列的核巧酸序列（例如，SEQ ID NO: 1)至少约40~60%，优选至少约60~70%， 更优选至少约70~75 %、75~80 %、80~85 %、85~90 %或90~95 %，甚至更优选至少约 95%、96%、97%、98%、99%或更高相同的核巧酸序列。
[0067] 两个核酸或肤序列之间百分序列同一性的确定是本领域中公知的。例如，可使用 Vector NTI 6.0(PC)软件包（InforMax,Bethesda,MD)来确定两个核酸或肤序列之间的百 分序列同一'性。在该方法中，使用15的缺口开放罚分(gap opening penalty)和6.66的缺口 延伸罚分(gap extension penalty)来确定两个核酸之间的百分同一'性。使用10的缺口开 放罚分和0.1的缺口延伸罚分来确定两个多肤的百分同一性。所有其它参数设定为默认设 置。为了进行多重比对(Clustal W算法），使用blosum 62矩阵，缺口开放罚分为10,而缺口 延伸罚分为0.05。应理解，当比较DNA序列和RNA序列时，为了确定序列同一性，胸腺喀晚核 巧酸相当于尿喀晚核巧酸。
[0068] 而且，本文所使用的PRG4蛋白包括由与编码PRG4蛋白的多核巧酸在严格条件下杂 交的多核巧酸编码的PRG4蛋白。如本文所使用的"杂交"包括其中一种或多种多核巧酸反应 W形成通过核巧酸残基的碱基之间的氨键键合而稳定化的复合物的反应。所述氨键键合可 通过Watson-化ick碱基配对、Hoogstein结合或W任何其它序列特异性方式发生。所述复合 物可包含两条形成双链体结构的链、=条或更多条形成多链复合物的链、单独的自杂交链、 或运些的任意组合。杂交反应可构成更广泛的过程中的一个步骤，例如PCR反应的起始，或 核糖体对多核巧酸的酶切割。
[0069] 杂交反应可在不同的严格条件下进行。本发明包括能够在降低的严格条件下、更 优选在严格条件下、且最优选在高度严格条件下与编码本文所述PRG4蛋白的多核巧酸杂交 的多核巧酸。如本文所使用的术语"严格条件"是指在IOx Denhad溶液，6xSSC、0.5%SDS和 lOOmg/ml变性娃精DNA中，在60°C过夜的杂交。印记在62°C依次在下述中各洗涂30分钟： SxSSC/0.1 %SDS，然后是lxSSC/0.1 %SDS，最后为0. lxSSC/0.1 %SDS。在某些实施方式中， 如本文所使用的短语"严格条件"还指在6xSSC溶液中在65°C的杂交。在其它实施方式中， "高度严格条件"是指在IOx Denhad溶液，6xSSC、0.5%SDS和lOOmg/ml变性娃精DNA中在65 °C过夜的杂交。印记在65°C依次在下述中各洗涂30分钟：3义55(：/0.1%505，然后是1技5(：/ 0.1 %SDS，最后为0. lxSSC/0.1 %SDS。核酸杂交的方法在本领域是公知的。因此，由本文使 用的核酸编码的PRG4蛋白包括与编码人PRG4蛋白的多核巧酸序列（例如，SEQ ID NO: 1)或 其特异性同种型或同源物具有至少60%同源性，优选75%同源性，更优选85%，更优选 90%，最优选95%、96%、97%、98%、99%同源性的核酸。
[0070] 而且，本文使用的PRG4蛋白还可W是嵌合蛋白或融合蛋白。如本文所使用的"嵌合 蛋白"或"融合蛋白"包括可操作地与第二多肤连接的第一多肤。嵌合蛋白可任选地包括可 操作地与第一或第二多肤连接的第=、第四或第五或其它多肤。嵌合蛋白可包含两个或更 多个不同的多肤。嵌合蛋白可包含相同多肤的多个拷贝。嵌合蛋白还可在一个或多个多肤 中包含一个或多个突变。产生嵌合蛋白的方法在本领域是公知的。在本发明某些实施方式 中，嵌合蛋白是PRG4蛋白与其它PRG4蛋白同种型的嵌合体。
[0071] 如本文所使用的"分离的"或"纯化的"蛋白、多核巧酸或分子意为从它们天然存在 的环境中移出；或基本上不含细胞物质，如来自得到所述蛋白多核巧酸或分子的细胞或组 织源的其它污染蛋白；或化学合成时，基本上不含化学前体或其它化学品。表述"基本上不 含细胞物质"包括从由其分离或重组产生或合成的细胞的细胞组分中分离的制备物 (Pr邱aration)。在某些实施方式中，表述"基本上不含细胞物质"包括具有少于约30% (按 干重计）的其它蛋白（在本文中也称为"污染蛋白"），更优选少于约20%、还更优选少于约 10%、W及最优选少于约5%的其它蛋