鱼类brms1a和Ivns1a基因的应用

鱼类brms1a和Ivns1a基因的应用
【专利摘要】本发明涉及分子生物学领域，具体的说是鱼类brms1a和Ivns1a基因的应用。鱼类brms1a或Ivns1a基因用于制备抗细菌感染的制剂中的应用。所述表达鱼类brms1a和Ivns1a基因的质粒pCNbrms和pCNIvns在抗细菌感染中应用。本发明的鱼类brms1a和Ivns1a基因表达质粒注射鱼类后能够显著提高鱼类抵抗细菌感染的能力。CGMCC No.233020080109
【专利说明】
鱼类brmsl a和I vns1 a基因的应用
技术领域
[0001]本发明涉及分子生物学领域，具体的说是鱼类brmsla和Ivnsla基因的应用。
【背景技术】
[0002]Brmsla(breast cancer metastasis suppressor la)和Ivnsla(influenzavirus NSlA binding protein a)是两个已被证明在哺乳动物中具有促凋亡作用的新颖基因。Brmsla属于一类肿瘤转移抑制基因，最早在乳腺癌中被发现。Brmsla可以通过抑制骨调素(osteopontin)的表达，从而促进细胞的凋亡，阻断多种癌细胞的转移。Ivns Ia参与调节多个细胞功能，包括抑制核酸的转运，结合mRNA的poly(A)序列，抑制mRNA前体的剪切，以及诱导细胞的凋亡。目前关于Brmsla和Ivnsla的研究主要集中在哺乳动物中，其作用在鱼类中尚无报道。

【发明内容】

[0003]本发明目的在于提供鱼类brmsla和Ivnsla基因的应用。
[0004]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0005]一种鱼类的brmsla和Ivns Ia基因的应用，鱼类brmsla或Ivns Ia基因用于制备抗细菌感染的制剂中的应用。
[0006]所述含鱼类brmsla或Ivnsla基因的表达质粒pCNbrms或pCNIvns在制备抗鱼类细菌感染制剂中的应用。
[0007]所述含鱼类brmsla或Ivnsla基因的表达质粒pCNbrms或pCNIvns在制备抗迟缓爱德华氏菌感染制剂中的应用。
[0008]所述鱼类brms Ia或I vns Ia基因以半滑舌鳎cDNA为模板，分别用引物Fl /Rl或F2/R2进行PCR扩增，扩增产物分别与载体pCN3连接，即获得brmsla基因质粒pCNbrms或Ivnsla基因质粒pCNIvns ；所述Fl 为5，-GATATCGCCACCATGCCAGTGCACTCGAGAGAA-3，； Rl 为5，-GATATCGGCATGTTTTACGGTGTATTTGC-3’；F2为5 ’-GATATCGCCACCATGATTCCCAACGGATATTTGAT-3’；R2为5’-GATATCTTGAGAAAAAACTCCAAACGCTA-3’。
[0009]本发明具有如下优点:本发明的鱼类brmsla和Ivnsla基因表达质粒注射后能够显著提高鱼类的抗细菌能力。
【具体实施方式】
[0010]下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
[0011 ]在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法:
[0012]1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技(^匕京)有限公司”的相应试剂盒。
[0013]2.大肠杆菌用Hanahan方法(Sambrook and Russell:Molecular Cloning: ALaboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)0
[0014]3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。
[0015]实施例1
[0016]鱼类brmsla和Ivnsla基因表达质粒pCNbrms和pCNIvns的构建:
[0017]鱼类brmsla和Ivnsla基因的序列已被报道(GenBankaccess1n number:EU519228和00535486)40^^18的构建如下:以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增brmsla基因。PCR条件为:94°C 60s预变性模板DNA，然后94°C 40s,60°C 60s,72°C608，5个循环后改为941: 40s,64°C 60s,72°C 60s,30个循环。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)于室温连接2 — 4小时，连接混合液转化到大肠杆菌DH5a后在含有lOOyg/ml安卡青霉素(Ap)、40yg/ml5_漠_4_氣_3_卩引噪-β-D-乳糖昔和24yg/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖昔的LB固体培养基上培养18 — 24小时，挑出白色转化子，提取质粒，命名为质粒pBSbrms。将表达载体pCN3(构建过程参见Jiao XD,Zhang M,Hu YH,Sun L.Construct1n and evaluat1n of DNA vaccinesencoding Edwardsiella tarda antigens.Vaccine2009;27:5195_202.)用限制性内切酉每EcoRV酶切后回收5.4kb片段，同时将pBSbrms用EcoRV酶切回收brms Ia片段。将上述回收的两片段用T4DNA连接酶于室温连接2 — 4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5a，在氨苄青霉素(100ug/ml)的LB培养基培养18 — 24小时，筛选转化子提取质粒，命名为pCNbrms。通过DNA测序分析证明了pCNbrms为含有brmsla基因序列的表达质粒。
[0018]pCNIvns的构建如下:以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物F2和R2进行PCR扩增Ivnsla基因。PCR条件为:94°C 60s预变性模板DNA，然后94°C 40s,57°C 60s,72°C 60s，5个循环后改为94°C 40s，61°C60s，72°C 60s，30个循环。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T(同上)于室温连接2 — 4小时，连接混合液转化到大肠杆菌DH5a后在含有100yg/ml安卡青霉素、40yg/ml 5-漠-4-氣-3-卩引噪-β-D-乳糖昔和24yg/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB固体培养基上培养18 — 24小时，挑出白色转化子，提取质粒，命名为质粒pBSIvnslao将表达载体pCN3(同上)用限制性内切酶EcoRV酶切后回收5.4kb片段，同时将pBSIvnsla用EcoRV酶切回收Ivnsla片段。将上述回收的两片段用T4DNA连接酶于室温连接2 — 4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5a，在含氨苄青霉素(100ug/ml)的LB培养基上培养18 — 24小时，筛选转化子提取质粒，命名为pCNIvns。通过DNA测序分析证明了pCNIvns为含有Ivnsla基因序列的表达质粒。
[0019]所述LB组成成分按重量百分比计:1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化钠，97.5% 蒸馏水。所述Fl 为5 ’ -GATATCGCCACCATGCCAGTGCACTCGAGAGAA-3，； Rl 为5，-GATATCGGCATGTTTTACGGTGTATTTGC-3’；F2为5 ’-GATATCGCCACCATGATTCCCAACGGATATTTGAT-3’；R2为5’-GATATCTTGAGAAAAAACTCCAAACGCTA-3’。
[0020]实施例2
[0021 ] 鱼类brmsla和Ivnsla基因表达质粒pCNbrms和pCNIvns的应用
[0022]步骤I)质粒注射
[0023]将上述实施例1的pCNbrms和pCNIvns在PBS中稀释至100ug/ml，即为pCNbrms和pCNIvns稀释液。将30条斑马鱼(重约3.2g)随机分为3组，每组10条。将这3组分别命名为A，B和C。将A组的每条鱼分别注射10ul pCNbrms稀释液，将B组的每条鱼分别注射10ulpCNIvns稀释液，将C组(对照组)的每条鱼分别注射10ul PBS。
[0024]所述PBS组成成分按重量百分比计:0.8% Na Cl，0.02%KC1 ,0.358%Na2HPO4.12H20,0.024%NaH2PO4，余量为水。
[0025]步骤2)细菌悬液制备:在LB培养基中培养迟缓爱德华氏菌TXl至OD6qq为I，然后离心(5000g，4°C)10min。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为lxl06cfu/ml。
[0026]所述菌株TXl保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为= CGMCC N0.2330，保藏日期2008.1.9，分类命名为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)，地址:北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所。
[0027]步骤3)攻毒感染
[0028]在上述步骤I)注射后第3天，将A，B和C三组的每条鱼注射10ul上述步骤2)的细菌悬液。在感染后48h，取鱼肾脏和脾脏组织，在Iml PBS中匀浆，将10ul匀浆液涂布于LB平板。将平板置于30°C培养48h，计算出现的菌落数。结果表明，A组鱼肾脏和脾脏的细菌数为66和77，B组鱼肾脏和脾脏的细菌数为65和74，C组鱼肾脏和脾脏的细菌数为100和108。统计学分析表明，A组和B组鱼肾脏和脾脏的细菌数皆显著(P〈0.01)低于C组鱼。
[0029]这些结果表明，表达鱼类brms Ia和I vns Ia基因的质粒pCNbrms和pCNIvns能够显著增强鱼类抵抗细菌的侵染。
【主权项】
1.一种鱼类的brmsla和Ivnsla基因的应用，其特征在于:鱼类brmsla或Ivnsla基因用 于制备抗细菌感染的制剂中的应用。2.按权利要求1所述的鱼类brmsla和Ivnsla基因的应用，其特征在于:所述含鱼类 brmsla或Ivnsla基因的表达质粒pCNbrms或pCNIvns在制备鱼类抗细菌感染制剂中的应用。3.按权利要求2所述的鱼类brmsla和Ivnsla基因的应用，其特征在于:所述鱼类brmsla 或Ivns la基因以半滑舌鳎cDNA为模板，分别用引物F1/R1或F2/R2进行PCR扩增，扩增产物分 别与载体pCN3连接，即获得brmsla基因质粒pCNbrms或Ivnsla基因质粒pCNIvns;所述F1为 5 ’-GATATCGCCACCATGCCAGTGCACTCGAGAGAA-3 ’；R1为5 ’-GATATCGGCATGTTTTACGGTGTATTTGC-3' ;F2为5,-GATATCGCCACCATGATTCCCAACGGATATTTGAT-3, ;R2为5、 GATATCTTGAGAAAAAACTCCAAACGCTA-3，。
【文档编号】A61P31/04GK105999300SQ201610305059
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月9日
【发明人】孙黎, 周泽军
【申请人】中国科学院海洋研究所