Cd147靶向给药系统及其制备与应用

Cd147靶向给药系统及其制备与应用
【专利摘要】本发明属于药物制剂研发领域，具体涉及一种CD147靶向给药系统及其制备与应用。本发明所述靶向给药系统含有Anti?CD147?聚乙二醇?磷脂、药物载体粒子以及药物，所述Anti?CD147?聚乙二醇?磷脂中Anti?CD147与聚乙二醇?磷脂之间的摩尔比为1：（1~3），所述聚乙二醇与磷脂之间的摩尔比为1：1，所述Anti?CD147、与聚乙二醇之间通过硫醚键连接。在体内和体外抗肿瘤中，CD147靶向的给药系统比非靶向给药系统均具有明显优势。
【专利说明】
CD147卽向给药系统及其制备与应用
技术领域
[0001] 本发明属于药物制剂研发领域，具体设及一种CD147祀向给药系统及其制备与应 用。
【背景技术】
[0002] 原发性肝癌是我国及全世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，虽然影像学诊断及外 科手术技术得到长足的发展，但除早期患者外，原发性肝癌术后生存状况仍然不甚理想，月中 瘤单发巧cm的患者5年生存率仅37%，肿瘤多发>3个的患者5年生存率仅26%。对于没有手 术机会的患者如BCLC C期的患者，目前指南仅仅推荐使用索拉菲尼，但索拉菲尼的肿瘤控 制率仅43%，中位延长生存时间仅约3个月，而且对于索拉菲吗治疗失败或无法耐受的患 者，至今仍无有效的二线替代治疗方。因此，无论对于术后存在高危复发因素的患者还是晚 期无手术机会的患者，指南均不推荐使用系统化疗，运和一些具有有效的、完善的系统化疗 方案的肿瘤如结直肠癌、乳腺癌相比，明显制约了其临床综合治疗的效果。因此，寻找对原 发性肝癌的行之有效的化疗药物也成为许多医学科研工作者努力解决的难题。
[0003] 针对目前抗肿瘤药物对原发性肝癌治疗效果不明显的问题，研制具有免疫主动祀 向的新型纳米脂质体药物载体是当务之急。

【发明内容】

[0004] 为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种CD147祀向给药 系统及其制备与应用。
[0005] 为了实现上述目的W及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 本发明的第一方面，提供一种Anti-CD147-聚乙二醇-憐脂，所述Anti-CD147与聚 乙二醇-憐脂之间的摩尔比为1: (1~3)，所述聚乙二醇与憐脂之间的摩尔比为1:1。
[0007] 优选地，所述Anti-CD147、聚乙二醇、憐脂之间均通过共价键连接。
[000引进一步优选地，所述Ant i -CD 147、与聚乙二醇之间通过硫酸键连接。
[0009] 进一步优选地，所述聚乙二醇与憐脂之间通过酷胺键连接。
[0010] 优选地，所述Anti-CD147选用CD147单克隆抗体。
[0011] 本发明的优选实施例中，Anti-CD147选用Anti-CD147F(ab)'2。
[0012 ] 优选地，所述聚乙二醇分子量范围是200~6000化。
[0013] 在本发明的优选实施例中，所述聚乙二醇选用PEG2000。
[0014] 优选地，所述憐脂的分子量与所述聚乙二醇的分子量相当或稍小。
[0015] 本发明的优选实施例中，所述憐脂选用二硬脂酷憐脂酷乙醇胺(DSPE)。
[0016] 本发明的第二方面，提供了一种制备前述Anti-CD147-聚乙二醇-憐脂的方法，包 括W下步骤:将Anti-CD147与聚乙二醇-憐脂，通过共价键偶联反应制备即可。
[0017] 优选地，所述方法具体包括如下步骤：
[001引 （1)将Anti-CD147琉基化，制备琉基化的Anti-CD147溶液；
[0019] (2)将马来酷亚胺修饰性聚乙二醇-憐脂溶解到步骤（1)所得溶液中，反应，获得 Anti-CD147-聚乙二醇-憐脂。
[0020] 优选地，步骤（1)中，采用2-亚氨基硫烧盐酸盐（2-IT，CAS号4781-83-3)将Anti- CD147琉基化。
[0021] 优选地，步骤(2)中，所述反应具体指在室溫下反应1~2小时。
[0022] 本发明第Ξ方面，提供前述Anti-CD147-聚乙二醇-憐脂在制备祀向给药载体或祀 向给药系统中的用途。
[0023] 本发明的第四方面，提供了一种祀向给药载体，含有前述Anti-CD147-聚乙二醇- 憐脂。
[0024] 进一步地，所述祀向给药载体，含有Ant i-CD147-聚乙二醇-憐脂W及药物载体粒 子。
[00巧]优选地，所述药物载体粒子表面有Anti-CD 147。
[00%] 优选地，每个所述药物载体粒子表面有一个W上Ant i -CD 147。
[0027] 进一步优选地，Anti-CD147共价连接于所述药物载体粒子的表面。
[0028] 优选地，所述药物载体粒子选自但不限于脂质体。
[0029] 优选地，所述脂质体的组成成分选自蛋憐脂、氨化大豆憐脂酷胆碱、氨化蛋憐脂酷 胆碱、二月桂酷憐脂酷胆碱、二肉豆違酷憐脂酷胆碱、二栋桐酷憐脂酷胆碱、二硬脂酷憐脂 酷胆碱、1-肉豆違酷-2-栋桐酷憐脂酷胆碱、1-栋桐酷-2-硬脂酷憐脂酷胆碱、1-硬脂酷-2- 栋桐酷憐脂酷胆碱、1-栋桐酷-2-油酷憐脂酷胆碱、1-硬脂酷-2-亚油酷憐脂酷胆碱、二油酷 憐脂酷胆碱、氨化二栋桐酷憐脂酷胆碱、二硬脂酷憐脂酷胆碱、二肉豆違酷憐脂酸、二肉豆 違酷憐脂酸、二栋桐酷憐脂酸、二栋桐酷憐脂酸、二硬脂酷憐脂酸、二肉豆違酷憐脂酷乙醇 胺、二栋桐酷憐脂酷乙醇胺、脑憐脂酷丝氨酸、二肉豆違酷憐脂酷丝氨酸、二栋桐酷憐脂酷 丝氨酸、蛋憐脂酷甘油、二月桂酷憐脂酷甘油、二肉豆違酷憐脂酷甘油、二栋桐酷憐脂酷甘 油、二硬脂酷憐脂酷甘油、二油酷憐脂酷甘油、脑銷憐脂、二栋桐酷銷憐脂或二硬脂酷銷憐 月旨、胆固醇、二油氧基丙基Ξ甲基氯化锭(D0TAP)、二油酷氯丙基氯化Ξ甲锭(D0TMA)、双十 八烷基二甲基漠化锭化DAB)、二甲基胺乙基胺基丙酷基-胆固醇(DC-化〇1)、精胺-5-簇基氨 基乙酸二十八烷基酷胺(DOGS)、二油酷班巧酷甘油胆碱醋(D0SC)、二油酷氯精胺簇基酷胺 乙基二甲基丙基Ξ氣乙酸锭(D0SPAKMVL5中的任一种或它们的两种或两种W上的组合。
[0030] 进一步地，所述药物载体粒子还可进行其他修饰。
[0031] 本发明的第五方面，提供了前述祀向给药载体的构建方法，选自W下任一：
[0032] 方法一、包括下列步骤：
[0033] (2)将Anti-CD147-聚乙二醇-憐脂作为构建药物载体的材料之一，与其他用于构 建药物载体的材料直接混合来制备祀向给药载体；
[0034] 方法二、后插入法，包括W下步骤：
[0035] (3)先构建药物载体；
[0036] (4)将Anti-CD147-聚乙二醇-憐脂与已构建好的药物载体混合，即可。
[0037] 方法Ξ:后连接法，包括W下步骤：
[0038] (2)采用聚乙二醇-憐脂作为药物载体材料之一，构建含有聚乙二醇-憐脂的药物 载体；
[0039] (2)将Anti-CD147与步骤(1)中构建好的含有聚乙二醇-憐脂的药物载体通过共价 键偶联反应，构建所述祀向给药载体。
[0040] 本发明的第六方面，提供了前述祀向给药载体载在制备祀向给药系统中的用途。
[0041] 本发明的第屯方面，提供了一种祀向给药系统，含有前述祀向给药系统及药物。
[0042] 优选地，所述药物选自但不限于抗肿瘤药物。
[0043] 进一步地，本发明所述抗肿瘤药物可W为现有的任意种类的抑制肿瘤细胞生长、 增殖、分化、转移的药物，包括但不限于:小分子化学药、核酸分子、碳水化合物、脂类、抗体 药、多肤、蛋白或干扰慢病毒。
[0044] 本发明的优选实施例中，选用阿霉素作为模型药物。
[0045] 优选地，所述祀向给药系统针对的祀细胞为肿瘤细胞。
[0046] 本发明的所述祀向给药系统可携带抗肿瘤药物并祀向作用于肿瘤细胞。
[0047] 优选地，所述肿瘤为实体肿瘤或转移性肿瘤。进一步优选地，所述肿瘤为CD147高 表达的肿瘤。
[0048] 更优选地，所述肿瘤选自但不限于肝癌。
[0049] 进一步地，所述药物载体还可进行其他修饰。
[0050] 本发明的第八方面，提供了前述祀向给药系统的构建方法，选自W下任一：
[0051 ] 方法一:包括W下步骤：
[0052] (1)将Anti-CD147-聚乙二醇-憐脂、药物W及用于构建药物载体的材料直接混合 来制备祀向给药系统；
[0053] 方法二、后插入法，包括下列步骤：
[0054] (3)构建携带药物的药物载体；
[0055] (4)将Anti-CD147-聚乙二醇-憐脂与步骤（1)构建好的携带药物的药物载体混合， 即可；
[0056] 方法Ξ、后连接法，包括W下步骤：
[0057] (3)采用聚乙二醇-憐脂作为药物载体材料之一，构建含有聚乙二醇-憐脂的携带 药物的药物载体；
[0058] (4)将Anti-CD147与步骤(1)中构建好的含有聚乙二醇-憐脂的携带药物的药物载 体通过共价键偶联反应，构建所述祀向给药系统。
[0059] 本发明的第九方面，提供了前述祀向给药系统在制备肿瘤治疗产品中的用途。
[0060] 优选地，所述肿瘤选自CD147高表达的肿瘤。更优选地，所述肿瘤选自但不限于肝 癌。
[0061] 本发明的第十方面，提供了一种治疗肿瘤的方法，包括步骤:将前述祀向给药系统 施用于患者。所用剂量，医师可根据实际情况选择。
[0062] 所述患者可W是肿瘤患者。所述肿瘤选自但不限于肝癌。
[0063] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0064] 本发明的发明人经过上述广泛而深入的研究发现，采用Anti-CD147对药物载体进 行修饰，尤其是所述Anti-CD147与聚乙二醇-憐脂之间通过硫酸键连接W及所述Anti- CD147与聚乙二醇-憐脂之间的摩尔比为1:(1~3)运些方面的因素，对于Anti-CD147-聚乙 二醇-憐脂成为高效的"祀向头"尤为关键。本发明大量的研究表明，含有Anti-CD147的祀向 给药系统，药物载体粒子表面的Anti-CD147,能够特性高效地将药物载体粒子定向地运送 到CD147高表达的肿瘤组织中，分布到祀组织中的药物载体粒子能够与肿瘤细胞表面的祀 蛋白结合，并诱导药物载体内吞或药物释放等过程，从而发挥药效。Anti-CD147修饰的祀向 给药系统对CD147高表达的肿瘤具有更强的生长抑制作用，Anti-CD147修饰的祀向给药系 统对CD147高表达的肿瘤的抑制作用是其他未经Anti-CD147修饰给药系统的3~8倍W上。 具体的，411^-〔0147修饰的祀向给药系统对〔0147高表达的肿瘤的抑制率高达95.3%，而未 经Anti-CD 147修饰的给药系统对肿瘤的抑制率仅有38.24 %。
【附图说明】
[0065] 图1:合成CD147祀向阿霉素脂质体示意图。
[0066] 图2:肝癌细胞系的CD147及CD133表达情况;A、肝癌细胞系CD147阳性率;B、肝癌细 胞CD147平均巧光强度;C、肝癌细胞CD133阳性率;D、肝癌细胞CD133平均巧光强度。
[0067] 图3:SDS-PAGE检测抗体连接的完整性及结合效率检测;4-6泳道黑箭头表示CD147 单抗与DSPE-PEG2000-MAL结合后的条带，条带越高表示分子量越大，结合DSPE-PEG2000- MAL数量越多。
[0068] 图4:A、CD147祀向阿霉素脂质体的粒径结果;BXD147祀向阿霉素脂质体的Zeta电 位结果;C、非祀向阿霉素脂质体的粒径结果;D、非祀向阿霉素脂质体的Zeta电位结果。
[0069] 图5:Ξ种药物的血药浓度-时间曲线。
[0070] 图6: Α、注射药物24小时后，裸鼠组织内阿霉素水平;Β、注射药物72小时后，裸鼠组 织内阿霉素水平，冲<0.05。
[0071 ]图7祖址-7对不同药物在体外的摄取情况。
[0072] 图8:Huh-7细胞在体外对祀向及非祀向脂质体的内吞情况;A、CD147祀向阿霉素脂 质体组未洗脱(蓝线)与洗脱后(红线）比较;B、非祀向阿霉素脂质体组未洗脱(蓝线)与洗脱 后(红线）比较;C、各组平均巧光强度的比较。
[0073] 图9:药物在体外对肝癌细胞生长的抑制作用;A、化h-7细胞解育1小时;BJuh-7细 胞解育24小时；C、HepG2细胞解育1小时;D、HepG2细胞解育24小时;E、肥C 3736细胞解育1小 时;F、肥C 3736细胞解育24小时。
[0074] 图10:药物对化h-7细胞干性的影响;A、药物对化h-7细胞CD133表达的影响;B、药 物处理后行平板克隆试验;C、平板克隆形成数量的定量比较;D、结晶紫洗脱行0D570吸光值 半定量比较。
[0075] 图11:荷瘤裸鼠注射不同药物后，肿瘤细胞内阿霉素阳性率比较，A、流式结果;B、 阳性率比较，冲<0.01。
[0076] 图12:化h-7荷瘤裸鼠的肿瘤抑制实验;A、肿瘤生长曲线；冲<0.01; B、实验终止时 各组肿瘤的示意图，自上而下分别为生理盐水组、游离阿霉素组、非祀向阿霉素脂质体+游 离抗体组、非祀向阿霉素脂质体组和CD147祀向阿霉素脂质体组;C、裸鼠体重变化曲线;冲〉 0.05 ;D、肿瘤重量的比较，冲<0.01。
[0077] 图13:A:免疫组化检测PDX模型LI-03-0005组织中CD147的表达情况;B、肿瘤生长 曲线;冲<0.05，*冲<0.01 ;B、实验终止时各组肿瘤的示意图，自上而下分别为生理盐水组、 非祀向阿霉素脂质体组和CD147祀向阿霉素脂质体组;C、裸鼠体重变化曲线;冲〉0.05;D、月中 瘤重量的比较，冲<0.05 ;E、肿瘤重量的比较。
【具体实施方式】
[0078] 本发明首先提供一种Anti-CD147-聚乙二醇-憐脂，所述Anti-CD147与聚乙二醇- 憐脂之间的摩尔比为1:(1~3)，所述聚乙二醇与憐脂之间的摩尔比为1:1。所述Anti- CD147、聚乙二醇、憐脂之间均通过共价键连接。具体的，所述Anti-CD147、与聚乙二醇之间 通过硫酸键连接。所述聚乙二醇与憐脂之间通过酷胺键连接。
[0079] 本发明所述Anti-CD147-聚乙二醇-憐脂是一种线性两亲嵌段共聚物，亲水段是聚 乙二醇，疏水段是憐脂。所述Anti-CD147-聚乙二醇-憐脂在水中能够自组装形成由亲水性 外壳和亲脂性内核组成的高分子胶束。
[0080] 本发明Anti-CD147可选用CD147单克隆抗体，可通过商购途径获得。本发明对于 CD147单克隆抗体没有特别的限制，在本发明的优选实施例中，Anti-CD147选用Anti- CD147F(ab)'2,还可采用其他的CD147单克隆抗体，并不限于实施例所列举的具体单克隆抗 体。
[0081] 本发明所述聚乙二醇，又名PEG,可通过商购途径获得。本发明对聚乙二醇的分子 量没有特别的限制，聚乙二醇分子量可优选在200~6000化。在本发明的优选实施例中，所 述聚乙二醇选用PEG2000,还可采用其他分子量的聚乙二醇，并不限于实施例所列举的具体 分子量的聚乙二醇。
[0082] 本发明所述憐脂可通过商购途径获得。本发明对于憐脂没有特别的限制，可选用 短链憐脂，分子量与聚乙二醇的分子量相当或稍小。在本发明的优选实施例中，所述憐脂 选用二硬脂酷憐脂酷乙醇胺(DSPE)，还可选用其他的憐脂，并不限于实施例所列举的具体 憐脂。
[0083] 本发明还进一步提供了 Anti-CD147-聚乙二醇-憐脂的制备方法，本发明对所述制 备方法没有特别的限制，只要能够成功制备获得该物质即可。在本发明的优选实施例中，采 用采用共价键偶联法制备Anti-CD147-聚乙二醇-憐脂，还可采用其他的制备方法，并不限 于实施例中所列举的具体方法。
[0084] 本发明还进一步提供了 Anti-CD147-聚乙二醇-憐脂在制备祀向给药载体或祀向 给药系统中的用途。
[0085] 所述祀向给药系统，含有Anti-CD147-聚乙二醇-憐脂。进一步地，所述祀向给药系 统含有:Anti-CD147-聚乙二醇-憐脂、药物W及药物载体。
[0086] 本发明对所述药物没有特别的限制。例如，所述药物可W是抗肿瘤药物。本发明的 优选实施例中，选用阿霉素作为模型药物，来研究本发所述祀向给药系统输送的抗肿瘤药 物的祀向能力。
[0087] 所述药物载体是指药物载体是指能改变药物进入人体的方式和在体内的分布、控 制药物的释放速度并将药物输送到祀向器官的体系。本发明对于药物载体没有特别的限 审IJ，只要能够实现成功携带所述药物即可。例如，所述药物载体可选用脂质体、阳离子脂质 纳米粒、聚合物胶束、乳剂、微囊、微球、纳米囊、纳米球中的任意一种。本发明的优选实施例 中，选用脂质体作为模型药物载体，当然还可选用其他合适的药物载体，并不限于实施例所 列举的具体药物载体。药物载体的构建方法为本领域的技术人员能够获知的内容。
[0088] 本发明对祀向给药系统的构建方法没有特殊的限制。可按照需要进行祀向给药系 统的构建，例如，可W先构建携带药物的药物载体，然后加入Anti-CD147-聚乙二醇-憐脂， 混合即可。也可W，先构建含有聚乙二醇-憐脂的携带药物的药物载体，然后加入Anti- CD147通过共价键偶联反应，构建所述祀向给药系统。再例如，还可W直接将Anti-CD147-聚 乙二醇-憐脂、药物W及用于构建药物载体的材料混合来制备祀向给药系统。
[0089] 进一步地，所述给药载体还可经其他修饰，例如，还可对所述药物载体进行单个或 多个感兴趣抗体、配体多糖的修饰等等，并不仅限于本发明的Anti-CD147修饰。
[0090] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案;还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法， 通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
[0091] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点W及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可W使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。
[0092] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领 域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及 相关领域的常规技术。运些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等 MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring Harbor LaboratoiT Press，1989and Third edition,2001;Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY John Wiley&Sons，New York,1987 and periodic updates;the series METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego；Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,Third edition'Academic Press，San Diego,1998;METH0DS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，畑romatin。.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY'Vol.119'Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
[0093] 术语解释：
[0094] Anti-CD147ILs-D0X CD147 祀向阿霉素脂质体
[00巧]Ls-DOX 阿霉素脂质体
[0096] Free D0X 游离阿霉素
[0097] 实施例1CD147祀向阿霉素脂质体的构建及其表征、药代动力学、组织分布的研究 [009引一、实验步骤
[0099] 1.流式细胞仪检测肝癌细胞系CD147及CD133的表达
[0100] 将培养中的细胞状态良好的 Huh-7、HepG2JLC/PRF/5、fep3B、WL、97H、LM3、7721 细胞WPBS洗涂，加入膜酶-EDTA于培养箱中解育3分钟，加入DMEM培养基终止消化。离屯、收 集细胞，WPBS洗涂Ξ次，用流式染色缓冲液100微升重悬，加入1微升CY5.5标记CD147流式 抗体或5微升FITC标记CD133流式抗体，4摄氏度解育15分钟。解育完毕后WPBS洗涂Ξ次，流 式染色缓冲液300微升重悬，70微米细胞滤网购过滤后，予W流式细胞仪检测。
[0101] 2.CD147祀向阿霉素脂质体(Anti-CD147ILs-D0X)的合成
[0102] (1)实验前准备:稀释CD147单克隆抗体至2mg/ml，5mg备用；用PBS配制5mg/ml2-IT ImL备用;配制含5mM邸ΤΑ的PBS溶液化，PH值7.4，放入4摄氏度冰箱预冷。
[0103] (2)〔0147单克隆抗体琉基化:取50化12111旨/111100147单抗溶液与30415111旨/11112- 口（2-;[111；[]1〇111；[013]16 117化〇(3111〇1'1(16,2-亚氨基硫烧盐酸盐，〔45号4781-83-3)混合，摇床 上低速摆动，室溫反应2小时，使CD147单克隆抗体琉基化。
[0104] (3)琉基化后清除游离的剩余2-IT:将琉基化后的液体装入一端封口的截留分子 量为1000D的透析膜中，放入1L预冷的5mM抓TA的PBS，4摄氏度透析化。更换新鲜透析液，4 摄氏度透析过夜，清除游离2-IT。
[0105] (4)合成05?6-?662000-]?31-〔0147单克隆抗体胶束：称取05?6斗662000- Mal2.5mg，溶解到1.7ml浓度为2mg/ml的琉基化的CD147单克隆抗体溶液中，摇床室溫解育 1-2小时，使得CD147单克隆抗体上的琉基与马来酷亚胺反应形成牢固的硫酸键，从而得到 DS阳-PEG2000H\fed-CD147单克隆抗体胶束。
[0106] (5)后插式法制备CD147祀向阿霉素脂质体(Anti-CD147ILs-D0X):将1.7mlDSPE- PEG2000-Mal-CD147单克隆抗体胶束与盐酸多柔比星脂质体注射液(阿霉素脂质体注射液， ILs-DOX) 5ml (2mg/ml)混合，放入60摄氏度水浴槽中，反应30分钟，然后放置于冰上5分钟， 使得DSPE-PEG2000-Mal-CD147单克隆抗体胶束的DSPE端插入到脂质体的双层憐脂膜结构 中，获得CD147祀向阿霉素脂质体溶液。
[0107] (6)清除游离抗体胶束:将得到的CD147祀向阿霉素脂质体溶液放入一端封口的截 留分子量为300KD的透析膜中，放入1L浓度为lOmM的皿PES缓冲液(PH值7.4)，透析8小时，更 换新鲜肥PES缓冲液，透析过夜，清除多余的游离抗体胶束。
[0108] 该步骤实验流程示意图可参见图1。
[0109] 3.SDS-聚丙締酷胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定抗体的完整性及结合效率
[0110] 由于CD147单克隆抗体分子量在110KD左右，故选择6 % SDS-PAGE分离胶进行电泳 测试，分离胶具体配置方案为:30 %丙締酷胺溶液2ml，1.5mo 1/L TriS(PH 8.8)2.5ml，10% SDS 0.1ml，TEMED 0.008ml，孤水稀释至10ml。安装夹屯、式垂直板电泳槽，将配置完的分离 胶注入板间缝隙，异丙醇封闭。待分离胶完全凝固后，弃去上层异丙醇，加入浓缩胶，并安 装15孔齿梳。待浓缩胶完全凝固后，拔去齿梳，注入DD水驱赶气泡，安装入电泳槽，电泳液没 过上端。最左侧加入蛋白标记，将未处理的游离CD147单抗W化g、化g、0.化g的抗体含量分 别加入1到3泳道;将琉基化后的CD147单克隆抗体W化g、化g、0.扣g的抗体含量分别加入4 至化泳道;将插入脂质体后形成CD147祀向脂质体，但未经透析的样品W约化g、化g、0.扣g的 抗体含量分别加入7到9泳道;将插入脂质体并透析清除多余抗体的CD147祀向脂质体W约2 yg、lyg、0.5yg的抗体含量分别加入10到12泳道。所有检测的样品均为与不含DTT或琉基乙 醇的Loading Buffer稀释、加热后上样。打开电泳槽电源，将电压调至80V，当条带进入分离 胶后，将电压调至120V。电泳结束后将凝胶取出，剔除浓缩胶，放入考马斯亮蓝中染色，摇床 过夜。第二天将凝胶小屯、取出，放入考马斯亮蓝脱色液中脱色，若脱色液深染可更换。彻底 脱色后，用单反相机拍照，分析。
[0111] 4. CD147祀向阿霉素脂质体表征测定
[0112] 将合成的CD147祀向阿霉素脂质体（（Anti-CD147ILs-D0X))与合成前的非祀向阿 霉素脂质体(ILs-DOX)在马尔文粒径仪(Zetasizer化no S)上进行上样检测，得出粒径、多 分散性指数(PDI)、和Ze化电位。
[0113] 5.药代动力学试验
[0114] 我们将成熟SD大鼠随机分为Ξ组，每组Ξ只，分别注射CD147祀向阿霉素脂质体 (Anti-CD147ILs-D0X)、非祀向阿霉素脂质体(ILs-DOX)与游离阿霉素(DOX)S种药物。在注 射后1分钟、15分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时、48小时分别进行尾静脉取血，所采 集的血液通过Ξ重四极杆质谱仪LCMS-8030予W上样，检测阿霉素浓度，绘制成血药浓度- 时间曲线，并根据该曲线由Phoenix WinNonlin软件计算半衰期（ti/2)、药物浓度-时间曲线 下面积(AUC)、表观分布体积(Vd)、廓清率(CU、平均滞留时间(MRT)。
[0115] 6.药物组织分布检测
[0116] 我们将处于对数生长期的化h-7细胞用PBS洗涂，加入膜酶-邸TA于培养箱中解育3 分钟，加入DMM培养基终止消化。离屯、收集细胞，WPBS重悬，显微镜下细胞计数，将5X10? 个化h-7细胞注射到5周龄裸鼠右背部皮下。待裸鼠背部肿瘤移植模型成功建立后，对肿瘤 大小进行监测，肿瘤体积计算公式:体积=(长径X短径2)/2。当肿瘤长至500mm3时，挑选裸 鼠体重、肿瘤体积较为均一的18只，随机分为3组，每组6只，分别经尾静脉注射CD147祀向阿 霉素脂质体、非祀向阿霉素脂质体与游离阿霉素 Ξ种药物，剂量为5mg阿霉素/公斤体重。24 小时后，每组随机挑选3只予W安乐死后，切除裸鼠肿瘤、肝脏、屯、脏、脾脏、肺W及肾脏，在 PBS中充分洗涂，用吸水纸吸净液体后W锡锥纸包裹，放入液氮中30分钟。后取出放入-80摄 氏度冰箱保存。通过Ξ重四极杆质谱仪LCMS-8030对组织中的阿霉素浓度予W测量。
[0117] 二、实验结果
[0118] 1.肝癌细胞系CD147及CD133的表达
[0119] 通过流式检测，我们发现目前常用的肝癌细胞系的CD147都呈现明显的高表达（图 2A)，所有细胞系都超过90%的细胞为CD147阳性细胞。而CD133的检测中，化h-7和化p3B细 胞的表达量较高（图2C)，分别为85.8 ± 0.32 %和97.6 ±0.57 %，同时运两组细胞的平均巧 光强度也较强（图2D)，分别为1420.3 ±17.6和3657.7 ±57.1。于是我们在仅有的两个 CD147XD133双阳性的细胞系中，选取CD147平均巧光强度较高（27033±251.7vs 11800± 360.6)而00133表达量略低的化11-7细胞系，从便于第二部分研究药物对细胞〔0133比例的 影响。故本研究中余下实验的细胞系选择基本为化h-7细胞系。
[0120] 2.SDS-聚丙締酷胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定抗体的完整性及结合效率
[0121] 如图3所示，1到3泳道上游离CD147单克隆抗体位于110KD条带的位置，而之后的泳 道上并未出现低于110KD的条带，故抗体完整性较好，未出现被水解的情况。4到6泳道上 110KD条带上方有Ξ条分子量更高的条带（黑箭头），代表与DS阳-PEG2000-MAL结合的CD147 单克隆抗体，位置高一截，110KD条带上方第一个黑箭头所指向的条带代表一个Anti-CD147 单抗结合了 1个DS阳-PEG-MAL，110KD条带上方第二个黑箭头所指向的条带代表一个Anti- CD147单抗结合了 2个DS阳-PEG-MAL，110KD条带上方第Ξ个黑箭头所指向的条带代表一个 Anti-CD147单抗结合了3个DS阳-PEG-MAL，白色箭头表示未结合的游离CD147单克隆抗体。7 到9泳道上黑色箭头表示插入到脂质体表面的DS阳-PEG2000-MAL-CD147单克隆抗体，白色 箭头表示未结合的游离CD147单克隆抗体。而在10-12泳道上，之前白色箭头所示110邸位置 已无明细条带，表示游离抗体已经被透析清楚，上方黑色箭头所示条带便是结合到CD147祀 向阿霉素脂质体上的CD147单克隆抗体。
[0122] 经过Image J软件对灰度值进行计算，4到9泳道的抗体连接效率(黑色箭头条带灰 度值之和/所有条带灰度值之和）依次为83.5%、77.9%、61.5%、87.5%、84.9%、80.5% (图 3B)。
[0123] 3.脂质体的表征测定
[0124] 如图4、表1-1所示，经过合成的CD147祀向阿霉素脂质体与非祀向阿霉素脂质体相 1：1：，其粒径更小（90.97±0.91￥3 109.4±2.34顧1)，而2日1日电位绝对值更大（-17.1± 0.35VS-8.92 ±0.04mv)，PDI都控制的比较低(0.098 ±0.007VS 0.078 ±0.002)，较为理想。
[0125] 表1-1CD147祀向阿霉素脂质体与非祀向阿霉素脂质体的表征参数。Table 1-1: Characterization of liposomes.D曰t曰曰re expressed 曰s me3n±SD(n = 3)from three independent samples.
[0126]
[0127] 4.药代动力学检测
[0128] 通过绘制血药浓度-时间曲线（图5)可直观的看出CD147祀向阿霉素脂质体的分布 相曲率更大，而消除相更为平缓，呈现出典型的血管内给药的二室分布模型，运提示体内可 能存在祀向蓄积作用。而与两种脂质体药物相比，游离阿霉素的血药浓度几乎可W忽略不 计。
[0129] 根据血药浓度-时间曲线计算如表1-2所示，CD147祀向阿霉素脂质体与非祀向阿 霉素脂质体在半衰期、平均滞留时间运两个参数上基本一致，CD147祀向阿霉素脂质体表观 分布容积(374.1±60.3￥3 157.3±5.71111/1^)和廓清率（16.5±1.8￥8 7.4±0.61111/11/1^) 较高，而药物浓度-时间曲线下面积明显较低（240963.7 ±25056.4vs 569292.9 ± :34558.：3ng h/ml)。
[0130] 表1-2: Ξ种药物的药代动力学参数
[0131]
[0132] 5.组织分布检测
[0133] 组织分布结果明确显示（图6)，在注射药物24小时时，CD147祀向阿霉素脂质体在 动物体内最主要的蓄积位置在肝脏（14562.73 ± 5895.6ng/g)，其次是脾脏（3898.7 ± 1569.5ng/g)和肿瘤(3148±596.化g/g)，在运Ξ个部位其阿霉素浓度均显著高于非祀向组 (P<0.05);具体的，尾静脉注射24h时，CD147祀向阿霉素脂质体组在肿瘤内的平均浓度是非 祀向组的大概1.96倍W上。虽然在注射CD147祀向阿霉素脂质体72小时后，肿瘤内阿霉素水 平较之前有所下降（1113.26±542.化g/g)，但其在肿瘤、肝脏、脾脏的水平仍显著高于非祀 向组(P<0.05);具体的，尾静脉注射7化时，CD147祀向阿霉素脂质体组在肿瘤内的平均浓度 是非祀向组的大概2.94倍W上。
[0134] 实施例2CD147祀向阿霉素脂质体在体外细胞摄取、细胞杀伤W及对肿瘤干性影响 的研究
[0135] -、实验步骤
[0136] 1 .PDC细胞的建立及流式细胞仪检测其CD147的表达
[0137] (l)PDC模型取自一 56岁的男性原发性肝癌患者。该患者进行了右肝肿瘤切除术， 术后病理诊断为肝细胞性肝癌。患者术中切除肿瘤时，在无菌环境下切开肿瘤标本，W手术 刀片切取小块新鲜未坏死的肿瘤组织，放入HTK器官保护液中，冰上运输。至超净台中，将组 织倒入培养皿中，W无菌剪刀剪成小块状，倒入含有IV型胶原酶（0.1 %w/v)和DNA酶I (0.003%)的消化液中，37摄氏度培养箱消化1小时。后收集消化液经70微米细胞滤网过滤 后，离屯、收集细胞，加入1ml红细胞裂解液，轻柔吹打，静置5分钟后，离屯、，收集细胞，放于常 规DMEM培养液中培养过夜。第二天弃去上清，更换新鲜培养液，等待细胞贴壁、生长。得到的 可传代的细胞系命名为HCC3736。实验中所用到的HCC3736为原代培养后不超过5代的细胞。 患者肿瘤取材是经过患者书面同意后实施的。
[0138] (2)将生长状态良好的HCC 3736细胞WPBS洗涂，加入膜酶-EDTA于培养箱中解育3 分钟，加入DMEM培养基终止消化。离屯、（lOOOrpm，5分钟）收集细胞，W 100μΙ stainingbuffer重悬与ΕΡ管，每管加入1微升CY5.5标记CD147流式抗体，4摄氏度解育15分 钟。解育完毕后WPBS洗涂Ξ次，流式染色缓冲液300微升重悬，70微米细胞滤网购过滤后， 予W流式细胞仪检测。
[0139] 2.肝癌细胞系在体外对CD147祀向阿霉素脂质体的摄取
[0140] 将生长状态良好的化h-7细胞WPBS洗涂，加入膜酶-EDTA于培养箱中解育3分钟， 加入DMEM培养基终止消化。离屯、（100化pm，5分钟）收集细胞，WPBS重悬，显微镜下细胞计 数，将2 X105个化h-7细胞铺板于30mm玻璃底共聚焦专用培养皿中，贴壁过夜。第二天弃去 上清，将CD147祀向阿霉素脂质体、非祀向阿霉素脂质体、非祀向阿霉素脂质体+游离CD147 单抗、游离阿霉素 W20化g/ml的浓度阿霉素计算)37摄氏度培养箱解育1小时，后弃去上 清，WPBS洗涂Ξ次后，加入4%多聚甲醒固定15分钟。再WPBS洗涂Ξ次后加入DAPI染色Ξ 分钟，后WPBS洗涂Ξ次，用激光共聚焦显微镜观察。
[0141] 3.肝癌细胞系在体外对CD147祀向阿霉素脂质体的内吞
[0142] 细胞对纳米载药的摄取有结合和内吞两种，前者仅仅是结合在细胞膜表面，后者 是内吞如胞浆或进入细胞核，因此只有后者才能真正起到肿瘤细胞杀伤的作用。因此，我们 根据之前的文献报道，用Pronase作为脂质体的洗脱剂。
[0143] 具体步骤:首先将将生长状态良好的化h-7细胞铺入六孔板中过夜培养。第二天弃 去上清，将CD147祀向阿霉素脂质体、非祀向阿霉素脂质体W2(K)μg/ml的浓度阿霉素计 算)37摄氏度培养箱解育1小时，后弃去上清，PBS洗涂，加入膜酶-EDTA于培养箱中解育3分 钟，加入DMEM培养基终止消化。离屯、（10(K)rpm，5分钟）收集细胞。此时将两个处理组的细胞 各分为两份，一份W2mg/ml Pronase 4摄氏度解育30分钟，一份WPBS重悬30分钟。分别离 屯、、洗涂各组细胞，Wstaining buffer重悬后，过70微米细胞滤网，上流式细胞仪检测阿霉 素巧光强度。
[0144] 4.CD147祀向阿霉素脂质体对肝癌细胞系的体外杀伤作用
[0145] (1)将状态良好的血h-7细胞铺板于2块96孔板中，每孔约3 X103个细胞，贴壁过 夜。
[0146] (2)第二天弃去培养基，分别至上而下加入300μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、3化邑/ ml、1 lμg/ml、3.7μg/ml、1.2μg/ml浓度的CD147祀向阿霉素脂质体m阿霉素含量计算浓度， W培养基稀释），每个浓度做Ξ个副孔，同样方法在同一块96孔板中加入相应浓度的非祀向 阿霉素脂质体、非祀向阿霉素脂质体+游离CD147单抗、游离阿霉素。37摄氏度培养箱解育1 小时，弃去上清，每孔WPBS洗涂后，加入新鲜DMEM培养基继续培养47小时。另一块96孔板W 同样方法药物解育24小时。PBS洗涂后加入新鲜DMEM培养基，继续培养24小时。
[0147] (3)每块96孔板还额外设置阳性对照：不做任何处理的细胞Ξ个孔，W及本底对 照:板孔内无任何细胞Ξ个副孔。
[0148] (4)培养时间结束后，弃去培养基，加入1 %浓度的CCK-8试剂，继续37摄氏度培养 箱解育1.5小时。
[0149] (5)将充分反应的两块96孔板放入Anthos Zenyth 3100酶标仪，在450皿处测定吸 光度。最后计算细胞活力值公式为：（〇化-0的破)/(0化瞄-0时S)%。公式中ODx为某孔的吸光 度;0的液为不加细胞，但加入CCK-8试剂的本底对照组平均吸光度;0邱胞为阳性对照组不加 药物处理正常生长的细胞所得的平均吸光度。
[01加](6) WGraphpad Prism软件计算每组药物的IC50值。
[0151] (7)相同的实验方案在化pG2和肥C 3736细胞上重复验证。
[0152] 5.在体外环境下，药物对肝癌细胞系干性的影响
[0153] (1)将生长状态良好的化h-7细胞消化后铺于六孔板中培养，贴壁过夜后，弃去培 养基，分别加入50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml的CD 147祀向阿霉素脂质体，37摄 氏度培养箱解育36小时。后弃去上清，PBS洗涂，加入膜酶-EDTA于培养箱中解育3分钟，加入 DMEM培养基终止消化。离屯、（100化pm，5分钟）收集细胞，W10化1 staining buffer重悬与 EP管，每管加入5微升FITC标记CD133流式抗体，4摄氏度解育15分钟。解育完毕后WPBS洗涂 Ξ次，流式染色缓冲液300微升重悬，70微米细胞滤网购过滤后，予W流式细胞仪检测。同样 方法检测非祀向阿霉素脂质体、非祀向阿霉素脂质体+游离CD147单抗、游离阿霉素对化h-7 细胞系CD133表达的影响。
[0154] (2)我们将Η址-7细胞分别培养于50μg/ml浓度的CD147祀向阿霉素脂质体、非祀向 阿霉素脂质体、非祀向阿霉素脂质体+游离CD147单抗、游离阿霉素中，解育36小时，后弃去 上清，PBS洗涂，加入膜酶-EDTA于培养箱中解育3分钟，加入DMEM培养基终止消化。离屯、 (10(K)rpm，5分钟川欠集细胞，PBS重悬后取10μ1样品与细胞计数板上，台吩蓝染色，计算细胞 悬液中活细胞密度。取6孔板，每孔放入1000个经不同药物处理过的活细胞，常规培养 基培养14天。弃去上清，PBS洗涂3次，加入4%多聚甲醒固定15分钟。再WPBS洗涂Ξ次后加 入0.2%结晶紫溶液常溫解育30分钟，再WPBS充分洗涂，惊干后单反相机拍照并计数。 [0Κ5] (3)配置含50%乙醇、0.1%乙酸的脱色液，每孔加入1毫升，摇床上充分溶解结晶 紫后，放入Anthos Zenyth 3100酶标仪，在57〇111]1处得到吸光值。
[0156] 二、实验结果
[0157] 1.肥C 3736细胞的CD147表达
[0158] 通过流式细胞仪检测，我们新建立的PDC模型，肥C 3736细胞也同普通肝癌细胞系 一样，是CD147高表达的（阳性率:99.9 ±0.1 %，MFI: 11366.7 ± 57.7)。结果显示在第一部分 图2A、B。
[0159] 2.肝癌细胞系在体外对药物的摄取情况
[0160] 如图7所示，通过2(K)μg/ml解育1小时后，不同药物在共聚焦显微镜下的成像比较， 我们发现CD147祀向阿霉素脂质体处理过的细胞在细胞内红色巧光（阿霉素自发巧光为红 色）与非祀向阿霉素脂质体组相比，明显较强。而游离阿霉素组的结果显示，阿霉素 W绝大 部分进入细胞核，与DAPI染色部位重叠，且巧光强度较强。
[0161] 3.肝癌细胞系在体外对药物内吞的情况
[0162] 如图8所示为祀向与非祀向脂质体两组药物分别W相同方式处理化h-7细胞后，经 Pronase与不经Pronase洗脱后的流式检测结果。黑线为未药物处理的空白对照组，A图蓝线 代表未洗脱的祀向组所在巧光区域，红线代表的洗脱后祀向组所在巧光区域，对比蓝线稍 有左移。B图蓝线代表未洗脱的非祀向组巧光区域，红线代表洗脱后的祀向组所在巧光区 域，较蓝线有大幅的左移。未洗脱的祀向组MFI值为:713±29.9,显著高于未洗脱的非祀向 组MFI值：647.7±21.5。= 0.008)，也显著高于洗脱后的祀向组1。1值：602±23.9。< 0.001)，未洗脱的非祀向组MFI值也显著高于洗脱后的非祀向组MFI值：325.67±11.1(P< 0.001)。可见非祀向的阿霉素脂质体更容易被Pronase洗脱，故CD147祀向阿霉素脂质体更 容易介导阿霉素被细胞内吞。
[0163] 4. CCK-8检测各药物对肝癌细胞的体外杀伤作用
[0164] 图9为不同浓度CD147祀向阿霉素脂质体、非祀向阿霉素脂质体、非祀向阿霉素脂 质体+游离抗体、游离阿霉素分别作用于化h-7、化pG2、肥C3736细胞1小时、24小时的细胞活 力曲线图；根据该曲线计算得出各药物对不同细胞系作用1、24小时的IC50(表2-1);我们可 W看出CD147祀向阿霉素脂质体在1小时的IC50最具有优势，在Huh-7细胞中，祀向脂质体的 IC50与两组非祀向脂质体分别相差4.2倍和5.6倍，在化pG2细胞中，则达到8倍和11.4倍，在 HCC 3736中分别为7.2和8.9倍;但祀向脂质体在24小时的IC50与非祀向脂质体相比则不具 有优势;值得一体的是，在体外游离阿霉素抑制肝癌细胞生长的效果最为明显，在任意时间 点对任何细胞的IC50值均最小。
[01化]表2-1药物对化h-7,化pG2W及肥C 3736细胞的细胞毒性作用 [0166]
[0167]
[0168] 5.药物在体外对肝癌细胞系干性的影响
[0169] 与不同浓度的CD147祀向阿霉素脂质体、非祀向阿霉素脂质体、非祀向阿霉素脂质 体+游离抗体、游离阿霉素解育36小时后，对化h-7细胞系的CD133表达检测发现CD147祀向 阿霉素脂质体对于化h-7细胞CD133的表达有最为明显的下调趋势（图10A)，与两组非祀向 脂质体处理相比有显著差异(P = 〇. 035，0.041)，而游离阿霉素对于化h-7细胞CD133的表达 有轻微上调趋势。
[0170] 将药物处理过的细胞行平板克隆试验，发现CD147祀向阿霉素脂质体对化h-7细胞 克隆形成的抑制最为明显（图10B)，经其处理的细胞形成的克隆数量显著小于非祀向阿霉 素脂质体(P = 〇.033)和非祀向阿霉素脂质体+游离抗体组(P = 0.039)，而游离阿霉素组的 克隆数量与未处理对照组(肥G)基本相当（图10C)。将平板克隆形成后的结晶紫洗脱并半定 量测定0D570吸光值所得的结论与平板克隆基本一致（图10D)，祀向阿霉素组的0D570吸光 值显著小于两组非祀向的吸光值(P = 〇.026,0.016)，而游离阿霉素组的0D570与对照组基 本一致。
[0171] 实施例3CD147祀向阿霉素脂质体的体内祀向及抗肿瘤效果研究
[0172] -、实验步骤
[0173] 1.检测体内肿瘤对药物的摄取情况
[0174] (1)我们将处于对数生长期的化h-7细胞用PBS洗涂，加入膜酶-EDTA于培养箱中解 育3分钟，加入培养基终止消化。离屯、收集细胞，WPBS重悬，显微镜下细胞计数，将5 X 106个化h-7细胞注射到5周龄裸鼠右背部皮下。待裸鼠背部肿瘤移植模型成功建立后，对肿 瘤大小进行监测，肿瘤体积计算公式:体积=(长径X短径2)/2。当肿瘤长至500mm3时，挑选 裸鼠体重、肿瘤体积较为均一的9只，随机分为3组，每组3只，分别经尾静脉注射CD147祀向 阿霉素脂质体、非祀向阿霉素脂质体W及游离阿霉素，剂量为5mg阿霉素/公斤体重，另设一 只荷瘤鼠注射生理盐水做空白对照。
[0175] (2)24小时后，裸鼠予W安乐死，切除裸鼠肿瘤。至超净台中，将肿瘤组织放入培养 皿中，W无菌手术剪刀剪成小块状，倒入含有IV型胶原酶(0.1 %w/v)和DNA酶1(0.003%)的 消化液中，37摄氏度培养箱消化1小时。后收集消化液经70微米细胞滤网过滤后，离屯、收集 细胞，加入1ml红细胞裂解液，轻柔吹打，静置5分钟后，离屯、收集细胞，W30化Istainning buffer重悬后，过70微米细胞滤网，上流式细胞仪检测阿霉素巧光。
[0176] 2.体内肿瘤抑制实验
[0177] (1)我们将处于对数生长期的化h-7细胞用PBS洗涂，加入膜酶-EDTA于培养箱中解 育3分钟，加入培养基终止消化。离屯、收集细胞，WPBS重悬，显微镜下细胞计数，将5 X 106个化h-7细胞注射到5周龄裸鼠右背部皮下。对肿瘤大小进行监测，肿瘤体积计算公式： 体积=(长径X短径2)/2。
[0178] (2)待裸鼠背部肿瘤移植模型成功建立后，挑选肿瘤体积在100-200mm3且裸鼠体 重较为均一的50只，随机分为5组，每组10只，分别经尾静脉注射CD147祀向阿霉素脂质体、 非祀向阿霉素脂质体、非祀向阿霉素脂质体+游离抗体、与游离阿霉素四种药物，剂量为5mg 阿霉素/公斤体重，另一组注射相同体积生理盐水为对照组。药物每7天注射一次，共注射四 次。
[0179] (3)用药后，每Ξ天记录一次肿瘤体积和裸鼠体重。直至治疗组出现裸鼠死亡，终 止实验。将裸鼠安乐死后，切除皮下肿瘤，拍照记录。将每组皮下肿瘤称重记录。
[0180] 3.PDX模型的建立
[0181] (l)PDX模型取自一 56岁的男性原发性肝癌患者。该患者进行了右肝肿瘤切除+胆 囊切除术，术后病理诊断为肝细胞性肝癌。患者术中切除肿瘤时，在无菌环境下切开肿瘤标 本，W手术刀片切取小块新鲜未坏死的肿瘤组织，放入HTK器官保护液中，冰上运输。
[0182] (2)至超净台中，取出组织，置于10cm的培养皿中，快速转移到含双抗的PBS中，并 清洗2遍，剔除坏死组织，记录组织的坏死程度。尽可能确保坏死部分不会用于接种。将组织 转入含1 %青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基中（无血清），W无菌消毒手术剪将组织剪成小 块(30-50mm3)。在基质胶中浸润一下，从针头处塞入18号套管针。用左手抓住裸鼠左侧的皮 肤使其右侧皮肤細紧，便于穿刺，用75%的酒精对裸鼠的背部皮肤进行消毒，并在要穿刺的 部位涂局麻药利多卡因（0.5%溶液），然后用18号穿刺针从右背侧的中间位置穿透皮肤，向 上进针至肩肿骨处，用套管针前端在皮下剥离形成一个小囊，将肿瘤推出种植于此处，若肿 瘤块随针头撤出而移位，可用套管针根部将其复位，每只动物接种1个点。
[0183] (3)组织的冻存、传代:P0-P3代可W根据肿瘤有无生长迹象，挑选有生长迹象的每 周(对生长较快的肿瘤)或每2周(对生长较慢的肿瘤)测量1次肿瘤大小，对达到一定大小的 肿瘤及时传代，接种120天后，若肿瘤无生长迹象，则将裸鼠安乐死。P0-P3代肿瘤生长至 500-800mm3，可W取下瘤块，挑选无坏死的部位，一部分WBambanker冻存液-80摄氏度冻 存，一部分按上述流程继续接种于其他裸鼠。我们所建立的PDX模型命名为LI-03-0005。
[0184] 患者肿瘤取材是经过患者书面同意后实施的。
[01化]4.免疫组化验证LI-03-0005组织CD147表达
[0186] (1)蜡块制作:挑选肿瘤大小约500mm3的裸鼠予W安乐死，完整取下肿瘤4%多聚 甲醒固定48小时。放入75 %乙醇过夜，后分别放入85 %乙醇2小时、95%乙醇2次各1.5小时、 无水乙醇3次各15分钟，充分脱水。后放入二甲苯两次各10分钟，放入石蜡包埋机液态石蜡 中2小时，后石蜡包埋，冷却后制成蜡块。
[0187] (2)组织切片:将蜡块-20摄氏度过夜后，切片机切片，将组织片拱至载玻片上，烘 片机60摄氏度烘烤1小时。
[0188] (3)脱蜡、水化:二甲苯Ξ瓶各浸泡10分钟，无水乙醇、85%乙醇、75%乙醇各浸泡5 分钟。孤水浸泡5分钟。
[0189] (4)细胞通透、封闭内源性过氧化物酶:配置3%过氧化氨-甲醇溶液，浸泡20分钟。 DD水洗Ξ次。
[0190] (5)抗原修复暴露抗原决定簇:配置巧樣酸钢抗原修复液(含巧樣酸Ξ钢1.8g+巧 樣酸1.05g)1500ml放置于高压锅煮沸，放入切片，盖锅冒气后持续2分钟，放空蒸汽，开盖自 然冷却。
[0191] (6)封闭非特异性蛋白：PBS浸泡5分钟，1%BSA室溫封闭30分钟。
[0192] (7)-抗过夜:将Anti-CD147抗体[MEM-M6/1]稀释至1:500,覆盖于组织上，放入湿 盒，4摄氏度过夜。
[0193] (8)二抗解育：将一抗倒掉并用PBS洗5分钟，重复3次。用滤纸将圆圈周围的水吸 去，加入1滴已稀释的二抗后放入37摄氏度恒溫烤箱中30分钟。后用PBS洗5分钟，重复3次。
[0194] (9)显色：加入DAB显色液，显色时间控制在1分40秒左右，由镜下观察颜色控制时 间。甩去DAB，放入水中可终止显色。孤水浸泡5分钟，洗涂两次。
[01M] (10)复染:将载玻片放入用滤纸过滤过的苏木素中，复染10分钟，自来水彻底冲 洗。
[0196] (11)分化：将载玻片放入配置好的盐酸酒精（5ml盐酸W75%酒精稀释至400ml) 中，分化2下。孤水冲洗，反蓝。
[0197] (12)脱水:依次放入7 5 %乙醇、85 %乙醇、无水乙醇各30秒。
[0198] (13)封片:载玻片上滴少量中性树脂，彻底清洁盖玻片，轻轻盖住树脂。
[0199] 5.PDX模型验证药物体内抑瘤效果
[0200] 将一只接种了 LI-03-0005组织并成功成瘤至800mm3的裸鼠行安乐死，将皮下肿瘤 剥除，放入盛有含双抗PBS的培养皿中，剔除坏死组织，转移至含双抗的DMEM培养基中，W无 菌手术剪将组织剪成小块(30-50mm3)，基质胶中浸润后由18号套管针送入裸鼠皮下。密切 观察约30天后，裸鼠皮下开始形成肿瘤，挑选肿瘤大小较为均一，约50-150mm3之间的裸鼠 15只，随机分为Ξ组，每组5只，分别注射CD147祀向阿霉素脂质体和非祀向阿霉素脂质体， 剂量为5mg阿霉素/公斤体重，另一组注射相同体积生理盐水为对照组。药物每7天注射一 次，共注射四次。用药后，每Ξ天记录一次肿瘤体积和裸鼠体重。终止实验，将裸鼠安乐死 后，切除皮下肿瘤，拍照记录。将每组皮下肿瘤称重记录。
[020。 二、实验结果
[0202] 1.体内环境下肿瘤对药物的摄取情况
[0203] 通过流式检测，我们发现注射CD147祀向阿霉素脂质体后的肿瘤组织细胞摄取阿 霉素的阳性率高于非祀向组，游离阿霉素组最低（图11A)。祀向组的平均阳性率30.77± 4.4% (图11B)，显著高于非祀向组7.54%±2。<0.01)。而游离阿霉素组阳性率仅仅1± 0.32%。
[0204] 2.Η址-7荷瘤裸鼠体内抑瘤实验
[02化]经过四次药物注射，Anti-CD147ILs-D0X治疗组的裸鼠肿瘤生长被明显抑制，其效 果显著好于Ls-DOX 及Ls-D0X+Anti-CD147 治疗组(P<0.01)，而Ls-DOX 及Ls-D0X+Anti-CD147 治疗组的疗效好于游离阿霉素组（图12A，B)。终止实验后，我们将裸鼠皮下的肿瘤取出，精 密称重，发现CD147祀向阿霉素脂质体治疗后的肿瘤重量最小(0.156±0.09g)，与其他各组 相比均有统计学差异(P<0.01，图12D)。具体的，最后一个时间点，Anti-CD147ILs-D0X治疗 组的裸鼠肿瘤的平均体积是:217.33±67.67mm3;Ls-D0X治疗组的裸鼠肿瘤的平均体积是： 903.13± 2461111113;1^3-0(^+411^-〔0147治疗组的裸鼠肿瘤的平均体积是：834.69± 223.81mm3;打ee D0X治疗组的裸鼠肿瘤的平均体积是：1867.54±473.21mm3。
[0206]由此可见，Anti-CD147ILs-D0X治疗组的裸鼠肿瘤的平均体积是最小的，而Ls-DOX +Anti-CD147治疗后裸鼠肿瘤的平均体积是Anti-CD147ILs-D0X治疗组的3.84倍，Ls-D0X 治疗后裸鼠肿瘤的平均体积是Anti-CD147ILs-D0X治疗组的4.15倍，Free D0X治疗后裸鼠 肿瘤平均体积是Anti-CD147ILs-D0X治疗组的8.59倍。
[0207]同时我们也对裸鼠的体重进行监测，发现用药后，虽然祀向组的体重偏高（图 12C)，但统计检验结果显示各组间无明显差异(P〉0.05)。
[020引 3. PDX模型组织内CD 147的表达测定
[0209] 图13A为我们建立的PDX模型LI-03-0005组织中CD147的表达情况。我们发现即使 在使用了比说明书浓度更低的一抗浓度（1:500)时，我们依然得到了一张强阳性的免疫组 化照片，而且通过组化我们清楚的发现CD147表达于肿瘤细胞的细胞膜。
[0210] 4.PDX模型LI-03-0005的体内抑瘤实验
[0211 ]通过与化h-7裸鼠荷瘤模型相同的给药方案，在PDX模型上我们得到了较为相似的 结果。图13B为LI-03-0005模型的肿瘤生长曲线，我们可W看出CD147祀向阿霉素脂质体对 于PDX模型移植瘤具有良好的抑制效果，Anti-CD147ILs-D0X治疗组对肿瘤的抑制率高达 95.3 %，非祀向脂质体效果次之，抑制率仅有38.24 %。经过统计检验，注射CD147祀向阿霉 素脂质体的裸鼠肿瘤显著小于非祀向组(P = 〇.047)。实验结束时，将裸鼠安乐死，取出肿瘤 拍照（图13C)并称得重量。CD147祀向阿霉素脂质体治疗的肿瘤平均重量为0.056±0.01g， 显著小于非祀向阿霉素脂质体组(0.244±0.19g，P = 0.044)。
[0212] 对实验期间裸鼠的体重进行监测（图12C)，发现组间没有显著差异(P〉0.05)。
[0213] 综上所述，本发明选用阿霉素作为药物模型，阿霉素脂质体作为药物载体模型，通 过Anti-CD147-聚乙二醇-憐脂将Anti-CD147连接至药物载体上，构建了能够祀向于CD147 高表达肿瘤细胞的祀向给药载体。首先我们对CD147祀向阿霉素脂质体的合成是成功的，通 过SDS-PAGE验证了抗体的完整性，并初步探测其结合效率。同时运也是第一次有祀向脂质 体在肝细胞癌中的研究。药代动力学提示CD147祀向阿霉素脂质体具有明显的二室分布特 点，具有较长的半衰期、表观分布容积和清除率。组织分布显示药物在肝脏、脾脏和肿瘤部 位有蓄积。体外实验显示肝癌细胞系对CD147祀向阿霉素脂质体的体外摄取明显强于非祀 向脂质体，其IC50在短期解育时对非祀向组有明显优势。内吞实验证明CD147祀向阿霉素脂 质体更容易介导细胞对化疗药物的内吞。此外，我们还发现CD147祀向阿霉素脂质体在体外 能明显降低肝癌细胞的干性标志CD133的表达量，并影响其干性。体内实验显示CD147祀向 阿霉素脂质体对裸鼠荷瘤有更强的抑制效果，肿瘤在体内对CD147祀向阿霉素脂质体的摄 取也相对更高。注射期间并没有裸鼠出现明显的体重下降等不良反应。目前肿瘤治疗的市 场上，只有阿霉素脂质体被批准上市，在我国仅仅被批准用于卡波西肉瘤等肿瘤治疗中。同 时，我们的药物在粒径、Zeta电位等表征参数上，比已上市的多美素(盐酸多柔比星脂质体 注射液)相比具有一定的优势。且我们的研究进一步证明在体内和体外抗肿瘤中，CD147祀 向的阿霉素脂质体比非祀向阿霉素脂质体均具有明显优势。
[0214] 由此可见，采用Anti-CD147对药物载体进行修饰，尤其是所述Anti-CD147与聚乙 二醇-憐脂之间通过硫酸键连接W及所述Anti-CD147与聚乙二醇-憐脂之间的摩尔比为1: (1~3)运些方面的因素，对于Anti-CD147-聚乙二醇-憐脂成为高效的"祀向头"尤为关键。 本发明大量的研究表明，含有Anti-CD147的祀向给药系统，药物载体粒子表面的Anti- CD147,能够特性高效地将药物载体粒子定向地运送到CD147高表达的肿瘤组织中，分布到 祀组织中的药物载体粒子能够与肿瘤细胞表面的祀蛋白结合，并诱导药物载体内吞或药物 释放等过程，从而发挥药效。Anti-CD147修饰的祀向给药系统对CD147高表达的肿瘤具有更 强的生长抑制作用，Anti-CD147修饰的祀向给药系统对CD147高表达的肿瘤的抑制作用是 其他未经An t i -CD 147修饰给药系统的3~8倍W上。具体的，Ant i -CD 147修饰的祀向给药系 统对肿瘤的抑制率高达95.3%，而未经Anti-CD147修饰的给药系统对肿瘤的抑制率仅有 38.24%。而对于Anti-CD147-聚乙二醇-憐脂中的其他憐脂、祀向给药系统中的其他药物载 体粒子W及其他药物，本发明不再一一寶述。
[0215] W上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制， 应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可W做出 若干改进和补充，运些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员， 在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用W上所掲示的技术内容而做出的些许更 动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对 上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围 内。
【主权项】
1. 一种Anti-CD147-聚乙二醇-磷脂，所述Anti-CD147与聚乙二醇-磷脂之间的摩尔比 为1: (1~3)，所述聚乙二醇与磷脂之间的摩尔比为1:1。2. 根据权利要求1所述的4]11:;[-00147-聚乙二醇-磷脂，其特征在于，所述4111:;[-00147、 聚乙二醇、磷脂之间均通过共价键连接。3. 根据权利要求1所述的4]11:;[-00147-聚乙二醇-磷脂，其特征在于，所述4111:;[-00147、 与聚乙二醇之间通过硫醚键连接。4. 根据权利要求1所述的Anti-CD147-聚乙二醇-磷脂，其特征在于，所述聚乙二醇与磷 脂之间通过酰胺键连接。5. 根据权利要求1所述的Anti-CD147-聚乙二醇-磷脂，其特征在于，所述Anti-CD147选 用CD147单克隆抗体。6. 根据权利要求1所述的Anti-CD147-聚乙二醇-磷脂，其特征在于，所述聚乙二醇分子 量范围是200~6000Da。7. 根据权利要求1所述的Anti-CD147-聚乙二醇-磷脂，其特征在于，所述磷脂选用二硬 脂酰磷脂酰乙醇胺。8. -种制备如权利要求1~7任一权利要求所述Anti-CD147-聚乙二醇-磷脂的方法，包 括以下步骤:将Ant i -⑶147与聚乙二醇-磷脂，通过共价键偶联反应制备即可。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤： (1) 将Anti-⑶147巯基化，制备巯基化的Anti-⑶147溶液； (2) 将马来酰亚胺修饰性聚乙二醇-磷脂溶解到步骤（1)所得溶液中，反应，获得Anti-CD147-聚乙二醇-憐脂。10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤（1)中，采用2-亚氨基硫烷盐酸盐将 Anti-CD 147 巯基化。11. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述反应具体指在室温下反 应1~2小时。12. 如权利要求1~7任一权利要求所述Anti-CD147-聚乙二醇-磷脂在制备靶向给药载 体或靶向给药系统中的用途。13. -种靶向给药载体，含有如权利要求1~7任一权利要求所述Anti-CD147-聚乙二 醇-磷脂。14. 根据权利要求13所述的靶向给药载体，其特征在于，所述靶向给药载体，含有Anti-⑶147-聚乙二醇-磷脂以及药物载体粒子。15. 根据权利要求14所述的靶向给药载体，其特征在于，每个所述药物载体粒子表面有 一个以上 Anti-CD147。16. 根据权利要求14所述的祀向给药载体，其特征在于，所述药物载体粒子选自脂质 体。17. 如权利要求13~16任一权利要求所述革E1向给药载体的构建方法，选自以下任一： 方法一、包括下列步骤： (1)将Anti-CD147-聚乙二醇-磷脂作为构建药物载体的材料之一，与其他用于构建药 物载体的材料直接混合来制备靶向给药载体； 方法二、后插入法，包括以下步骤： (1) 先构建药物载体； (2) 将Anti-⑶147-聚乙二醇-磷脂与已构建好的药物载体混合，即可。 方法三:后连接法，包括以下步骤： (1) 采用聚乙二醇-磷脂作为药物载体材料之一，构建含有聚乙二醇-磷脂的药物载体； (2) 将Anti-CD147与步骤（1)中构建好的含有聚乙二醇-磷脂的药物载体通过共价键偶 联反应，构建所述靶向给药载体。18. 如权利要求13~16任一权利要求所述革E1向给药载体载在制备革E1向给药系统中的用 途。19. 一种靶向给药系统，含有如权利要求13~16任一权利要求所述靶向给药载体及药 物。20. 根据权利要求19所述的靶向给药系统，所述药物选自抗肿瘤药物。21. 如权利要求19~20任一权利要求所述革E1向给药系统的构建方法，选自以下任一： 方法一:包括以下步骤： (1)将Ant i-CD 147-聚乙二醇-磷脂、药物以及用于构建药物载体的材料直接混合来制 备靶向给药系统； 方法二、后插入法，包括下列步骤： (1) 构建携带药物的药物载体； (2) 将Anti-CD147-聚乙二醇-磷脂与步骤（1)构建好的携带药物的药物载体混合，即 可； 方法三、后连接法，包括以下步骤： (1) 采用聚乙二醇-磷脂作为药物载体材料之一，构建含有聚乙二醇-磷脂的携带药物 的药物载体； (2) 将Anti-CD147与步骤（1)中构建好的含有聚乙二醇-磷脂的携带药物的药物载体通 过共价键偶联反应，构建所述靶向给药系统。22. 如权利要求19~20任一权利要求所述靶向给药系统在制备肿瘤治疗产品中的用 途。
【文档编号】A61K47/48GK105999294SQ201610316174
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月12日
【发明人】王剑, 杨 远, 周伟平
【申请人】上海柏运医疗器材有限公司, 王剑, 杨 远, 周伟平