一种磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的制作方法

一种磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒，以生物内源性磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)作为膜材，对抗炎药物姜黄素进行包载，制备PS修饰的姜黄素纳米粒靶向递药系统；其能够通过模拟凋亡细胞，被巨噬细胞表面的特异性受体识别，借助受体介导的巨噬细胞主动靶向作用，增强巨噬细胞摄取；药物姜黄素进入巨噬细胞后，发挥其抗炎作用，同时PS载体被摄取后还会诱导巨噬细胞产生抗炎反应，即致炎细胞因子释放减少，抗炎因子分泌增加，达到药物和载体协同抗炎的效果；该磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒可用于治疗巨噬细胞介导的相关疾病的药物应用。
【专利说明】
-种磯脂醜竺氨酸修饰的姜黄素纳米粒
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体设及一种憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米 粒，能够特异性祀向到巨隧细胞，并发挥药物与载体的协同抗炎疗效，用W治疗巨隧细胞介 导的相关疾病。
【背景技术】
[0002] 目前研究发现，众多疾病均与炎症反应相关，如动脉粥样硬化、癌症、糖尿病、风湿 性关节炎等，需要应用抗炎药物进行治疗。巨隧细胞作为机体的主要免疫细胞，在运些炎症 疾病中发挥着重要的作用，可促进致病性炎症反应，是很多抗炎药物的祀细胞。采用新型的 祀向递药系统将抗炎药物祀向至巨隧细胞，能够提高抗炎药物的疗效并降低其毒副作用。 因此，开发一种可特异性祀向巨隧细胞的抗炎药物制剂具有较高的应用价值。
[0003] 姜黄素是从姜科植物姜黄根茎中提取出的一种天然多酪类物质，具有抗炎、抗氧 化、抗肿瘤、降血脂、预防和缓解糖尿病并发症等多种药理活性，但其溶解性差、易光解、体 内代谢快等缺点大大限制了其临床应用。憐脂酷丝氨酸(phosphatidyl serine，PS)是一种 带负电荷的阴性憐脂，大量存在于调亡细胞的外膜，能高效识别巨隧细胞上的受体而实现 巨隧细胞祀向性，调亡细胞可被巨隧细胞快速有效清除，抑制炎症和自身免疫反应的发生。 基于生物内源性的PS对巨隧细胞的祀向作用，有望开发一种W其为膜材包载药物的递送系 统，实现巨隧细胞祀向递药。此外，研究发现PS载体本身也有抗炎作用，原因可能是其能模 仿调亡的细胞，被巨隧细胞摄取后会诱导巨隧细胞产生抗炎反应。
[0004] 目前中国专利CN104771764A公开了一种甘露糖修饰的精蛋白巨隧细胞祀向载体 的合成及基因递送系统的制备方法。中国专利CN103120795B公开了一种祀向巨隧细胞的制 剂，该制剂由囊状的酵母细胞壁内装载自组装的载药纳米粒得到。中国专利CN101690822B 公开了一种用于巨隧细胞疾病祀向供药的药物载体及其制备方法，该药物载体为对巨隧细 胞由特异识别能力的轮状病毒外壳蛋白化6经原核表达、自组装而成的中空病毒样颗粒，其 内表面或外表面化学修饰有药物分子。
【申请人】经过专利检索及文献查询，具有主动祀向至 巨隧细胞同时利用药物和载体发挥协同抗炎作用的纳米载体一一憐脂酷丝氨酸修饰的姜 黄素纳米粒未见报道。

【发明内容】

[0005] 本发明所要解决的关键问题是制备一种憐脂酷丝氨酸(PS载体)修饰的姜黄素纳 米粒，使其通过模拟调亡的细胞，被巨隧细胞表面的特异性受体识别后，借助受体介导的巨 隧细胞主动祀向作用，增强巨隧细胞对纳米粒的摄取;药物姜黄素进入巨隧细胞后，发挥其 抗炎作用，同时PS载体被摄取后还会诱导巨隧细胞产生抗炎反应，即致炎细胞因子释放减 少，抗炎因子分泌增加，达到药物和载体协同抗炎的效果。
[0006] 本发明提供的憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒，由姜黄素、憐脂酷丝氨酸、大豆 憐脂、胆固醇油酸醋、Ξ油酸甘油醋和胆固醇按摩尔百分比组成。
[0007] 摩尔百分比为:姜黄素:0.5%~10%，大豆憐脂:20%~50%，憐脂酷丝氨酸:0% ~50%，胆固醇油酸醋：10%~30%，Ξ油酸甘油醋：15%~40%，胆固醇：1 %~15%，物质 的摩尔百分比之和为100%。
[0008] 其中，憐脂酷丝氨酸可^是心曰-憐脂酷丝氨酸（由大豆憐脂或脑憐脂合成）、1-栋 桐酷-2-油酷-憐脂酷丝氨酸、1,2-二油酷基-憐脂酷丝氨酸或其他种类的憐脂酷丝氨酸。
[0009] 上述憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的制备方法，其特征在于，采用薄膜分散 法，具体按W下步骤进行：
[0010] (1)将处方量的大豆憐脂、憐脂酷丝氨酸、胆固醇、胆固醇油酸醋、Ξ油酸甘油醋、 姜黄素的脂质混合物溶于氯仿，在旋转蒸发仪中挥去有机溶剂，得到干燥的脂质薄膜；
[0011] (2)在室溫下用pH6.5憐酸盐缓冲液对脂质薄膜进行水化30min，将脂质混悬液超 声处理lOmin，再进行探头超声(300W，6min);
[0012] (3)采用聚碳酸醋膜(孔径220nm)过滤若干次，除菌的同时使粒径均匀。最终得到 憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒，装入无菌瓶中于4Γ密封保存。
[0013] 所制得的憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的平均粒径为l(K)nm~300nm，多分散 指数(PI)为0.01~〇.l〇，Zeta电位为-15mV至-45mV，，包封率为80%~100%，载药量为2% ~3%。
[0014] 所制得的憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒在透射电镜下呈现黑色类球形的实 屯、结构，大小均一，粒径在100~300nm，与动态光散射法(DLS)测得的粒径结果一致。
[0015] 所制得的憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的稳定性良好，4Γ放置一周，其外观 性状和粒径、多分散系数、电位和包封率等理化性质均未发生明显变化。
[0016] 所制得的憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒在含5%SDS的PBS溶液（0.01M， pH7.4)中，120h内累计释放百分率约为50%~60%，表明该憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳 米粒能够长效、缓慢地释放药物。对药物的体外释放曲线方程进行拟合，结果表明其体外释 放曲线符合一级动力学模型。
[0017] 经实验表明，本发明制备的憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒与大鼠红细胞解育 化后溶血率小于5% ;对小鼠巨隧细胞RAW264.7未表现出明显的细胞毒性，表明该憐脂酷丝 氨酸修饰的姜黄素纳米粒的生物相容性良好。
[0018] 本发明的憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒与未进行PS修饰的纳米粒相比，可W 被高选择性地摄取进入巨隧细胞，结果见图6(激光共聚焦显微镜定性分析)和图7(流式细 胞仪定量分析），说明祀向抗炎双功能纳米粒可W特异性祀向到巨隧细胞。
[0019] 所述的憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒与姜黄素溶液或PS修饰的空白纳米粒 (即PS单独应用）相比，可W更显著地促进炎症状态下的巨隧细胞分泌抗炎因子，同时抑制 其致炎因子的产生，表明药物和载体能发挥协同抗炎的疗效。
[0020] 本发明的憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒与现有技术相比，至少具有如下优 占. y ?、、·
[0021] 1)与常规祀向纳米粒相比，本发明采用安全的生物内源性憐脂，通过简单的物理 结合对载体进行修饰，操作简单方便，成本较低，并且不会引起机体的免疫反应；
[0022] 2)与常规祀向纳米粒相比，本发明的载体对巨隧细胞具有良好的祀向性，可通过 特异性PS受体识别机制增加巨隧细胞对姜黄素的摄取，提高药物的抗炎疗效；
[0023] 3)与常规祀向纳米粒相比，本发明的载体可W模拟生物体内调亡细胞，被巨隧细 胞摄取后诱导巨隧细胞产生抗炎反应，与药物姜黄素发挥协同增效的抗炎作用。
【附图说明】
[0024] 图1是憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的粒径分布图；
[0025] 图2是憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的透射电镜图；
[0026] 图3是憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的体外释放曲线；
[0027] 图4是憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的溶血性实验；
[0028] 图5是憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的细胞毒实验；
[0029] 图6是激光共聚焦显微镜对细胞摄取的定性分析图示；
[0030] 图7是流式细胞仪对细胞摄取的定量分析图示；
[0031] 图8是巨隧细胞致炎因子和抗炎因子的mRNA表达水平图示；图中，从左至右且从上 到下依次为:A、阳性对照组，B、姜黄素溶液组，C、空白载体组，D、实施例9含药载体组，E.阴 性对照组；图中，邮<0.01，代表与A比有显著性差异，*p<0.01，代表与D相比有显著性差异。
[0032] 图9是巨隧细胞致炎因子和抗炎因子的蛋白表达水平图示；图中，从左至右且从上 到下依次为:A、阳性对照组，B、姜黄素溶液组，C、空白载体组，D、实施例9含药载体组，E、阴 性对照组；图中，邮<0.01，代表与A比有显著性差异，*p<0.01，代表与D相比有显著性差异。
[0033] W下结合附图和实施例W及实验对本发明作进一步的详细说明。
【具体实施方式】
[0034] 本发明的憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒，采用生物内源性的PS作为膜材，审U 备PS修饰的纳米脂质载体作为祀向递药系统，对抗炎药物姜黄素进行包载，可实现特异性 祀向到巨隧细胞，同时发挥药物和载体协同抗炎的疗效。
[0035] W下是发明人给出的实施例，运些实施例仅用于帮助理解本发明，本发明不限于 运些实施例。
[0036] 实施例1:憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的制备方法选择
[0037] 常见的纳米脂质载体制备方法主要有高压匀质法、烙融乳化法、烙融超声法、溶剂 扩散法、溶剂乳化蒸发法、高速揽拌超声法、微乳法等。其中高压匀质法需要较高的溫度，通 常为8(TC左右，热敏性药物不适合用此方法制备。而冷高压匀质法又很难制得粒径较小且 分布较窄的纳米结构脂质载体。因此，结合药物特点，筛选出W下几种制备方法进行考察。 [003引1.1乳化蒸发法-低溫固化法
[0039] W摩尔百分比计，称取姜黄素5%，憐脂45% ,1-栋桐酷-2-油酷-憐脂酷丝氨酸 0%，胆固醇油酸醋15%，Ξ油酸甘油醋25%，胆固醇10%的脂质混合物，溶于氯仿，超声使 其充分溶解，构成有机相。将有机相预热至65°C，随后将其匀速滴入相同溫度下的pH 6.5憐 酸盐缓冲液中，磁力揽拌化形成初乳。随后进行探头超声（300W，6min)，减压蒸去有机溶剂 并浓缩至适当体积，将浓缩后的溶液快速倒入磁力揽拌下4Γ的水相中冷却，继续揽拌Ih 后，通过聚碳酸醋膜(孔径220nm)过滤若干次，除菌的同时使粒径均匀。
[0040] 1.2溶剂扩散法
[0041] W摩尔百分比计，称取姜黄素5%，憐脂45% ,1-栋桐酷-2-油酷-憐脂酷丝氨酸 ο %，胆固醇油酸醋15 %，Ξ油酸甘油醋25 %，胆固醇10 %的脂质混合物，溶于氯仿，超声使 其充分溶解，构成有机相。将有机相预热至65°C，随后将其匀速滴入相同溫度下的pH 6.5憐 酸盐缓冲液中，磁力揽拌化形成初乳。随后进行探头超声（300W，6min)，减压蒸去有机溶剂 并浓缩至适当体积，自然冷却至室溫后，通过聚碳酸醋膜(孔径220nm)过滤若干次，除菌的 同时使粒径均匀。
[0042] 1.3薄膜分散法
[0043] W摩尔百分比计，称取姜黄素5%，憐脂45% ,1-栋桐酷-2-油酷-憐脂酷丝氨酸 0%，胆固醇油酸醋15 %，Ξ油酸甘油醋25%，胆固醇10%的脂质混合物，溶于氯仿，在旋转 蒸发仪中挥去有机溶剂，得到干燥的脂质薄膜。在室溫下用抑6.5憐酸盐缓冲液对脂质薄 膜进行水化30min，将脂质混悬液超声处理lOmin，在进行探头超声（300W，6min)。最后通过 聚碳酸醋膜(孔径220nm)过滤若干次，除菌的同时使粒径均匀。
[0044] 由于有机相W氯仿为溶剂，与水相的憐酸盐缓冲溶液互不相溶，前两种制备方法 无法有效制备得到纳米脂质载体。因此最终选择薄膜分散法制备憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄 素纳米粒。
[0045] 实施例2:憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒中憐脂酷丝氨酸/憐脂摩尔比例的筛 选
[0046] 根据实施例1中结果，采用薄膜分散法制备PS修饰的姜黄素纳米粒，固定其他条 件，制备PS修饰量(mo 1 % )分别为0 %、4%、8 %、12 %、20 %的姜黄素纳米粒。用激光粒度分 析仪测其粒径，并测定其包封率。考察PS摩尔比例对于姜黄素纳米粒粒径、包封率的影响， W此确定有效的PS摩尔比例的范围进行后续试验。
[0047] 表1:不同PS修饰量(mol % )的姜黄素纳米粒的粒径、多分散系数及包封率(Mean ± SD，n = 3)
[004引
[0049 ] 结果表明，PS修饰量在0~12 %时，对药物的粒径和包封率影响不大。但当PS的修 饰量为20%时，包封率显著减小，可能是由于此时PS在憐脂单层膜中的插入量超过了其所 能承载的最大容量进而影响药物包载。因此在本研究中选择PS的修饰量(mol%)分别为 0%、4%、8%和12%制备姜黄素纳米粒进行后续的研究。
[0050] 实施例3:憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒处方优化
[0051] 固定PS用量(mol%)为8%，W粒径和包封率为考察指标，采用薄膜分散法制备姜 黄素纳米粒，对其憐脂种类、甘油Ξ醋种类、投药量、固液脂质比、憐酸缓冲溶液的pH值等处 方因素进行优化。
[0化2] 3.1憐脂种类的选择
[0053]固定其它条件不变，分别W国产普通大豆憐脂，德国lipoid公司的大豆憐脂S100, 上海AVT公司的蛋憐脂PC 98-Τ，采用薄膜分散法制备PS修饰的姜黄素纳米粒，用激光粒度 分析仪测其粒径，并测定其包封率。
[0054]表2:不同憐脂种类的姜黄素纳米粒的粒径、多分散系数及包封率(Mean±SD，n = 3)
[0化5]_
[0056]结果表明，国产大豆憐脂纯度低，所含杂质较多，制备所得纳米粒易产生沉淀，粒 径较大，包封率较低。Lipoid S100和PC 98-T，纯度较高，其中卵憐脂含量大于95%，两者制 备的纳米粒粒径没有显著性差别，但Lipoid S100包封率较高，故最终选择Lipoid S100制 备姜黄素纳米粒。
[0化7] 3.2甘油Ξ醋种类的选择
[0058] 固定其它条件不变，分别W辛癸酸甘油醋，硬脂酸甘油醋和Ξ油酸甘油醋，采用薄 膜分散法制备PS修饰的姜黄素纳米粒，用激光粒度分析仪测其粒径，并测定其包封率。
[0059] 表3:不同甘油Ξ醋种类的姜黄素纳米粒的粒径、多分散系数及包封率(Mean±SD， n = 3)
[0060]
[0061] 结果表明，硬脂酸甘油醋制备所得纳米粒粒径较大，包封率较低。辛癸酸甘油醋和 Ξ油酸甘油醋制备的纳米粒粒径没有显著性差别，但Ξ油酸甘油醋包封率较高，运可能与 不同液态脂所形成的纳米粒内部结构不同有关，故最终选择Ξ油酸甘油醋制备姜黄素纳米 粒。
[0062] 3.3固液脂质比的选择
[0063] 固定其它条件不变，分别W不同的固液态脂质比(111%)2/1、2/3、2/5、2/7，采用薄 膜分散法制备PS修饰的姜黄素纳米粒，用激光粒度分析仪测其粒径，并测定其包封率。
[0064] 表4:不同固液脂质比的姜黄素纳米粒的粒径、多分散系数及包封率(Mean±SD，n =3)
[00 化]
[0066]结果表明，固液态脂质比对粒径影响不大，但对包封率有较大影响，随着液态脂质 比例的增加，包封率先增大后减小，因此选择固液态脂质比为2/5。
[0067] 3.4投药量的选择
[0068] 固定其它条件不变，分别W不同的投药量5111邑、1〇111邑、15111邑、2〇111邑，采用薄膜分散法 制备PS修饰的姜黄素纳米粒，用激光粒度分析仪测其粒径，并测定其包封率。
[0069] 表5:不同固液脂质比的姜黄素纳米粒的粒径、多分散系数及包封率(Mean±SD，n =3)
[0070]
[0072] 结果表明，投药量对粒径和包封率均有较大影响，投药量在15mgW下，随着投药量 的增加，粒径逐渐增大，包封率先增大后减小。当投药量在15mgW上，粒径减小但包封率也 较低，故投药量选择lOmg。
[0073] 3.5憐酸缓冲盐溶液pH值的选择
[0074] 固定其它条件不变，分别W不同pH值5.0、6.5、7.0、7.4的憐酸缓冲盐溶液，采用薄 膜分散法制备PS修饰的姜黄素纳米粒，用激光粒度分析仪测其粒径，并测定其包封率。
[0075] 表6:不同固液脂质比的姜黄素纳米粒的粒径、多分散系数及包封率(Mean±SD，n =3)
[0076]
[0077] 结果表明，憐酸缓冲盐溶液的抑值对粒径和包封率均有较大影响，抑在6.5时，粒 径较小且包封率较高，当抑值进一步增加时，包封率下降，可能是姜黄素在中性条件下不稳 定，导致包封率较低。因此选择憐酸缓冲盐溶液的pH值为6.5。
[0078] 实施例4:憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒制备工艺优化
[0079] 固定PS用量(mol%)为8%，W粒径和包封率为考察指标，采用薄膜分散法制备姜 黄素纳米粒，对其成膜溫度、水合时间、超声时间等制备工艺参数进行优化。
[0080] 4.1成膜溫度的选择
[0081] 固定其它条件不变，分别W不同成膜溫度55°(：、65°(：、75°(：、85°(：，采用薄膜分散法 制备PS修饰的姜黄素纳米粒，用激光粒度分析仪测其粒径，并测定其包封率。
[0082] 表7:不同成膜溫度的姜黄素纳米粒的粒径、多分散系数及包封率(Mean±SD，n = 3)
[0083]
[0084] 结果表明，溫度的改变对化C的粒径无明显影响，但对包封率有显著影响。随着溫 度的升高，包封率呈下降的趋势，可能由于溫度过高，药物和脂质发生氧化的缘故，因此成 膜溫度选择55 °C。
[0085] 4.2水合时间的选择
[0086] 固定其它条件不变，分别W不同的水合时间15min、30min、60min、90min，采用薄膜 分散法制备PS修饰的姜黄素纳米粒，用激光粒度分析仪测其粒径，并测定其包封率。
[0087] 表格8:不同成膜溫度的姜黄素纳米粒的粒径、多分散系数及包封率(Mean±SD，n =3)
[008引
[0089] 结果表明，当水合时间在15min时包封率较低，可能是由于药物未能与脂质充分接 触，水合不完全。当水合时间在30min时，包封率增大，但继续延长水合时间，粒径和包封率 无明显变化，故为节省时间，水合时间选择30min。
[0090] 4.3探头超声时间的选择
[0091 ]固定其它条件不变，分别W不同的探头超声时间3111；[]1、61]1；[]1、91]1；[]1、121]1；[]1，采用薄 膜分散法制备PS修饰的姜黄素纳米粒，用激光粒度分析仪测其粒径，并测定其包封率。
[0092] 表9:不同超声时间的姜黄素纳米粒的粒径、多分散系数及包封率(Mean±SD，n = 3)
[0093]
[0094]结果表明，探头超声时间对粒径和包封率有较大影响，随着超声时间的延长，粒径 和包封率均呈下降的趋势。可能由于超声时间过长，破坏载体的结构，导致部分药物泄漏的 缘故。6min时粒径和包封率较为理想，因此超声时间选择6min。
[0095] 实施例5:正交试验法优化憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的处方和制备工艺
[0096] 根据实施例3和实施例4中单因素考察的结果，选择影响姜黄素纳米粒粒径和包封 率的四个主要参数为考察对象，即W投药量(A)，固液态脂质比(B)，探头超声时间(C)，憐酸 缓冲盐溶液的pH值(D)为4个主要考察因素，每个因素选取3个水平，按正交设计L9(34)表进 行实验，优选最佳处方和制备工艺，因素水平见下表。
[0097] 表10:正交设计因素水平表 [009引
[0099] 根据正交设计因素水平表，采用正交设计助手Π 专业版软件进行正交实验设计， 按照软件给出的实验安排制备姜黄素纳米粒，并测定包封率。结果见表11，方差分析见表 12。
[0100] 表11:L9(34)正交实验设计及结果
[0101]
[0102]
[0103] 表12:方差分析结果[0104]
[0105] 注：临界值 F0.05 (2，2) = 19.00，冲 <0.05[0106] 从表11中可W看出，各个因素的不同水平对姜黄素纳米粒包封率的影响依次为： 八1〉42〉43,82〉81〉83，(：1乂2乂3,02〉03〉01，4〉00〉8，即投药量对姜黄素纳米粒包封率的影 响最大，其次是探头超声时间，再次是憐酸缓冲溶液的pH值，固液脂质比对包封率的影响相 比较前Ξ者而言最小。
[0107]由表12可知，投药量和探头超声时间对包封率的影响具有显著性差异(Ρ<0.05)。 按照正交实验结果，最优工艺的组合为A1B2C2D2,即投药量为lOmg，固液脂质比为2/5,超声 时间为6min，憐酸缓冲溶液的pH值为6.5。
[010引实施例6:优化工艺条件的验证实验
[0109] 结合正交实验设计筛选的工艺和参数，按照最佳处方和工艺条件，制备Ξ批姜黄 素纳米粒，并测定包封率，对最佳组合结果进行验证。结果见表13。
[0110] 表13:正交实验设计结果验证(n = 3)
[0111]
[0112] 方差分析的结果说明所选的4个因素在各自设定的水平内有2个因素对粒径的影 响不具有统计学意义，因此结合既定的工艺和参数，按照最佳处方和工艺条件制备的姜黄 素纳米粒的平均包封率为88.78%，而且较为稳定，粒径和载药量都较为理想，说明优化的 方案可行且工艺的重现性良好。
[0113] 实施例7:0%憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的制备
[0114] W摩尔百分比计，取姜黄素5%，大豆憐脂45%，1-栋桐酷-2-油酷-憐脂酷丝氨酸 0%，胆固醇油酸醋15%，Ξ油酸甘油醋25%，胆固醇10%，通过W下步骤制备祀向抗炎双功 能纳米粒：
[0115] (1)将上述组分的脂质混合物溶于氯仿，在旋转蒸发仪中挥去有机溶剂，得到干燥 的脂质薄膜；
[0116] (2)在室溫下用ρΗ6.5憐酸盐缓冲液对脂质薄膜进行水化30min，将脂质混悬液超 声处理lOmin，再进行探头超声(300W，6min);
[0117] (3)采用聚碳酸醋膜(孔径220nm)过滤若干次，除菌的同时使粒径均匀。最终得到 憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒，装入无菌瓶中于4Γ密封保存。
[0118] 实施例8:4%憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的制备
[0119] W摩尔百分比计，取姜黄素5%，大豆憐脂41%，1-栋桐酷-2-油酷-憐脂酷丝氨酸 4%，胆固醇油酸醋15%，Ξ油酸甘油醋25%，胆固醇10%，通过W下步骤制备祀向抗炎双功 能纳米粒：
[0120] (1)将上述组分的脂质混合物溶于氯仿，在旋转蒸发仪中挥去有机溶剂，得到干燥 的脂质薄膜；
[0121] (2)在室溫下用ρΗ6.5憐酸盐缓冲液对脂质薄膜进行水化30min，将脂质混悬液超 声处理lOmin，再进行探头超声(300W，6min);
[0122] (3)采用聚碳酸醋膜(孔径220nm)过滤若干次，除菌的同时使粒径均匀。最终得到 憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒，装入无菌瓶中于4Γ密封保存。
[0123] 实施例9:8%憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的制备
[0124] w摩尔百分比计，取姜黄素5%，大豆憐脂37 %，1-栋桐酷-2-油酷-憐脂酷丝氨酸 8%，胆固醇油酸醋15%，Ξ油酸甘油醋25%，胆固醇10%，通过W下步骤制备祀向抗炎双功 能纳米粒：
[0125] (1)将上述组分的脂质混合物溶于氯仿，在旋转蒸发仪中挥去有机溶剂，得到干燥 的脂质薄膜；
[0126] (2)在室溫下用ρΗ6.5憐酸盐缓冲液对脂质薄膜进行水化30min，将脂质混悬液超 声处理lOmin，再进行探头超声(300W，6min);
[0127] (3)采用聚碳酸醋膜(孔径220nm)过滤若干次，除菌的同时使粒径均匀。最终得到 憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒，装入无菌瓶中于4Γ密封保存。
[0128] 实施例10:12%憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的制备
[0129] W摩尔百分比计，取姜黄素5%，大豆憐脂33%，1-栋桐酷-2-油酷-憐脂酷丝氨酸 12%，胆固醇油酸醋15%，Ξ油酸甘油醋25%，胆固醇10%，通过W下步骤制备祀向抗炎双 功能纳米粒：
[0130] (1)将上述组分的脂质混合物溶于氯仿，在旋转蒸发仪中挥去有机溶剂，得到干燥 的脂质薄膜；
[0131] (2)在室溫下用ρΗ6.5憐酸盐缓冲液对脂质薄膜进行水化30min，将脂质混悬液超 声处理lOmin，再进行探头超声(300W，6min);
[0132] (3)采用聚碳酸醋膜(孔径220nm)过滤若干次，除菌的同时使粒径均匀。最终得到 憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒，装入无菌瓶中于4Γ密封保存。
[0133] 实施例11:憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的形态学、粒径、Zeta电位、包封率 和载药量的测定
[0134] 利用透射电镜观察纳米粒的微观形态，采用激光粒度分析仪测定纳米粒的粒径分 布及Zeta电位，采用微柱离屯、法测定纳米粒的包封率和载药量。
[0135] 纳米粒的粒径分布图和微观形态分别见图1和图2。
[0136] 表14:纳米粒的粒径、Ze化电位、包封率和载药量(Mean ±SD，n = 3)
[0137]
[013引透射电镜下可见所有的纳米粒均为黑色类球形的实屯、结构，大小均一。表14显示 随着PS修饰量的增加，电位呈现下降趋势，说明PS已经成功插入到憐脂单层膜中。当PS的摩 尔比例大于8%时，电位趋于恒定，说明PS在憐脂单层膜中已达到饱和状态。从表中可W看 出粒径分布范围较窄，粒径大小均匀。
[0139] 实施例12:憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的体外释放行为考察
[0140] 采用透析袋法，考察纳米粒在PBS(抑7.4)中的释药特性(见图3)。结果表明，憐脂 酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的药物释放具有一定的缓释性。对药物的体外释放曲线方程 进行拟合，结果表明其体外释放曲线符合一级动力学模型。
[0141] 实施例13:憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的溶血性考察
[0142] 取大鼠全血2mL置于肝素化试管中，用玻璃棒揽拌去除纤维蛋白原，加入约10倍量 的生理盐水，摇匀，15(K)rpm离屯、15min弃去上清液，沉淀的红细胞再用等量的生理盐水重复 洗涂3~4次，至上清液不显红色为止，将所得红细胞用生理盐水配成2%的红细胞悬液。
[0143] 取6支lOmL离屯、管，编号，按下表15进行实验，第1~4管分别为实施例1~4中的憐 脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒，第5管为阴性对照，第6管为阳性对照，混匀后置于37Γ恒 溫水浴中振荡化（lOOr/min)。于3000巧m离屯、lOmin后，收集上清，过0.22皿的有机滤膜，采 用紫外-可见分光光度计，在500nm~650nm波长范围内进行扫描。测定每组上清液在最大吸 收波长处的吸光度，按下式计算溶血率：
[0144] 溶血率（％ )=(实验组吸光度值-阴性对照组吸光度值)/(阳性对照组吸光度值- 阴性对照组吸光度值）X 100
[0145] 表15:溶血试验各组分加入方法(mU
[0146]
[0147] 表16:溶血性实验结果(Mean±SD，n = 3)
[014 引
[0149] 由图4和表16可知，不同实施例中纳米粒的溶血率均小于5%，表明纳米粒没有溶 血性。
[0150] 实施例14:憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的细胞毒性考察
[0151] 取对数生长期的RAW 264.7巨隧细胞W5X 104个/孔密度接种于96孔板中，每孔 20化LDMEM培养基于培养箱中37°C，5%C02培养24h后，洗去培养液，分别加入用含10%胎牛 血清的DMEM培养基稀释的不同PS修饰的姜黄素纳米粒20化L(化r浓度均为20μΜ)，解育24小 时后，向每个孔中加入20化ΜΤΤ储备液(5mg/mL，抑7.4PBS)，37°C继续解育4小时。去除上清 液，加入15化L DMS0，稍加振摇溶解蓝紫色的甲琐结晶，用酶联免疫测定仪于49化m测定吸 光度。W含10%胎牛血清的培养液解育细胞，相同操作作为阴性对照；W无细胞的空白培养 基接种并按相同操作处理作为空白对照。每个样品Ξ复孔，计算细胞存活率。
[0152] 图5结果表明，与纳米粒解育后的细胞，与未处理的正常细胞相比，细胞存活率未 发生明显变化。
[0153] 实施例15:憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的巨隧细胞摄取研究
[0154] 采用巧光染料香豆素-6(Coumarin-6，C6)代替姜黄素制备祀向抗炎双功能纳米 粒，通过激光共聚焦显微镜(化SM)和流式细胞仪(FCM)考察巨隧细胞对纳米粒的摄取程度。
[0155] 取无菌处理的圆形盖玻片置于24孔板内，将RAW264.7W1X105接种于24孔细胞 板，在含有10%胎牛血清的DMEM培养基(含有lOOunits/mL青霉素和10化g/mL链霉素）中标 准条件培养2地，弃去上层培养基，用PBS润洗，将各组巧光标记的纳米粒分别用无血清培养 基稀释至Coumarin-6浓度为lOOng/mL，用各组稀释后的纳米粒混悬液替换细胞生长培养 基。不含纳米粒的空白培养液作为阴性对照。37 °C培养化后，吸除上层培养液，PBS洗细胞3 次，加1ml的4%多聚甲醒(v/v)固定细胞(室溫20min)，PBS洗3次，加入细胞核染色剂DAPI (200μ1/孔），避光室溫解育lOmin。弃去DAPI，PBS洗2min，重复5次;取出细胞爬片置于洁净 载玻片上，采用50%甘油封片，避光保存于4°C，CLSM观察细胞对各组纳米粒的摄取情况。
[0156] 将RAW264.7巨隧细胞W5X105/孔接种于6孔板内，于培养箱中37°C，5%C02培养 24h细胞长满孔板后，除去培养基，加入各组巧光标记的纳米粒分别用无血清培养基稀释至 Coumarin-6浓度为10化g/mL，用各组稀释后纳米粒混悬液替换细胞生长培养基。W不含纳 米粒的空白培养基作为阴性对照。37 °C培养化后，吸除上层培养液，PBS洗涂，膜酶消化液处 理各组细胞形成细胞悬液，收集细胞悬液于离屯、管中，离屯、（100化pm，5min)后，用0.5ml的 PBS复悬细胞，用于流式细胞仪检测，每次分析10000个细胞。
[0157] 图6和图7表明，憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒与未进行PS修饰的纳米粒（即 0%憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒)相比，可W被高选择性地摄取进入巨隧细胞;且8% 憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒摄取率最高，故选择8%憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳 米粒用于后续细胞抗炎特性研究。
[0158] 实施例16:憐脂酷丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的抗炎特性研究
[0159] 按1 X 105/孔的密度接种RAW264.7细胞于12孔板，加入含10%胎牛血清的DMEM培 养基，其中培养液内含有双抗（lOOyg/mL链霉素和lOOunits/mL青霉素），37°C条件下、饱和 湿度、5%C02培养箱中培养24h;再分别按如下方式进行处理分组，继续培养2地，每组设置3 个复孔进行，分别进行后续不同生化指标检测。
[0160] 按照细胞不同干预处理可分为W下五组：
[0161] (1)阳性对照组:加入含有50yg/mL oxLDL不含任何制剂的无血清DMEM;
[0162] (2)药物溶液组:加入含有50yg/mL oxLDL和含有20ιχΜ姜黄素溶液的DMEM;
[0163] (3)空白载体组:加入含有50yg/mL oxU)L和不含姜黄素的空白载体(PS浓度与含 药载体相同）的DMEM;
[0164] (4)含药载体组:加入含有50yg/mL oxU)L和含药载体（即8%PS修饰的姜黄素纳米 粒，其中姜黄素浓度为20μΜ)的DMEM;
[01化](5)阴性对照组:加入无血清的DMEM。
[0166]各细胞组中致炎因子和抗炎因子mRNA表达水平测定:按照试剂盒说明书提取各组 细胞的总RNA，W稀释后的RNA样本作为模板合成cDNA，将制备得到的cDNA进行实时巧光定 量PCR扩增。所有结果均用GAPDH进行校正，比较方法为Ct法化AAGT)，计算公式如下：A ACT =(Ct-Cr)规御-(Ct-Cr)娜壌且，其中（Ct-Cr)规御表示处理组的勒1基因和内参基因的Ct差值，而 (打-Cr)础細表示对照组的祀基因和内参基因的Ct差值。
[0167] 各细胞组中致炎因子和抗炎因子蛋白表达水平测定:按照上述细胞培养及给药方 案处理分组后，继续培养24h结束后，收集细胞培养液，12000巧m4°C离屯、lOmin，分别采用 ELISA试剂盒测定致炎因子和抗炎因子的蛋白表达水平。
[0168] 图8和图9结果表明，分组给予不同的制剂处理后，与阳性对照组相比，姜黄素溶液 组、空白载体组和含药载体组中细胞致炎因子(MCP-1、TNF-a、比-6)的mRNA和蛋白表达水平 均显著下降;抗炎因子(化-10、TGF-i3)mRNA和蛋白表达水平显著上升，而含药载体组作用最 强。可见给予药物和载体后均能抑制致炎因子的表达，促进抗炎因子的表达，且两者合用后 效果增强，表明PS与姜黄素有协同抗炎作用。
【主权项】
1. 一种磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒，其特征在于，制得的该磷脂酰丝氨酸修饰 的姜黄素纳米粒由以下物质按摩尔百分比组成： 姜黄素：0.5 %~10%，大豆磷脂：20%~50 %，磷脂酰丝氨酸:0 %~50%，胆固醇油酸 酯：10%~30%，三油酸甘油酯：15%~40%，胆固醇：1%~15%，物质的摩尔百分比之和为 100%〇2. 如权利要求1所述的磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒，其特征在于，所述的磷脂酰 丝氨酸是L-α-磷脂酰丝氨酸、1-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰丝氨酸、1，2_二油酰基-磷脂酰丝氨 酸或其他种类的磷脂酰丝氨酸。3. 如权利要求1所述的磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒，其特征在于，所述的磷脂酰 丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒平均粒径为lOOnm~200nm，多分散指数（PI)为0.01~0.10， Zeta电位为-15mV至-45mV，包封率为80 %~100 %，载药量为2 %~3 %。4. 权利要求1或2或3所述的磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的制备方法，其特征在 于，采用薄膜分散法，具体按以下步骤进行： (1) 将处方量的大豆磷脂、磷脂酰丝氨酸、胆固醇、胆固醇油酸酯、三油酸甘油酯、姜黄 素的脂质混合物溶于氯仿，在旋转蒸发仪中挥去有机溶剂，得到干燥的脂质薄膜； (2) 在室温下用pH6.5磷酸盐缓冲液对脂质薄膜进行水化30min，将脂质混悬液超声处 理lOmin，再进行探头超声6min; (3) 采用孔径220nm的聚碳酸酯膜过滤若干次，除菌的同时使粒径均匀，最终得到磷脂 酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒，装入无菌瓶中于4°C密封保存。5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的磷脂酰丝氨酸是L-α-磷脂酰丝氨酸、 1-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰丝氨酸、1，2_二油酰基-磷脂酰丝氨酸或其他种类的磷脂酰丝氨 酸。6. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒平 均粒径为lOOnm~200nm，多分散指数(PI)为0.01~0.10，Zeta电位为-15mV至-45mV，包封率 为80%~100%，载药量为2%~3%。7. 权利要求1~3任一项所述的磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒用于制备治疗巨噬 细胞介导相关疾病药物的应用。8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于，作为药物在递送系统以特异性靶向到巨噬细 胞，并且发挥药物和载体协同抗炎疗效。
【文档编号】A61K47/24GK105999290SQ201610251256
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年4月21日
【发明人】王晓娟, 王济, 冯斌
【申请人】中国人民解放军第四军医大学