一种自身具有抑制肿瘤作用的复合纳米药物载体及制备工艺的制作方法
【专利摘要】一种自身具有抑制肿瘤作用的复合纳米药物载体及制备工艺，属于生物材料领域。两亲性聚合物聚乳酸?嵌?聚维生素C丙烯酸酯(PLA?block?PAAA)与聚乳酸?嵌?聚乙二醇(PLA?block?PEG)通过共自组装的方式制备得到的复合纳米药物载体。复合纳米粒子可以保护维生素C抗氧化性，并使药物递送体系在保持纳米载体功能性的基础上，可以发挥聚合物纳米粒子在递送化药的优势。
【专利说明】
-种自身具有抑制肿瘤作用的复合纳米药物载体及制备工艺
技术领域
[0001] 本发明属于生物材料领域，具体设及一种含聚维生素 C片断的复合纳米药物递送 体系及其制备工艺。 技术背景
[0002] 癌症目前为止仍是世界上较难解决的问题。癌症的治疗需要精准的筛查和选择治 疗方法，比如说放疗、化疗还是手术治疗。尽管放疗和手术治疗可W短时间内使肿瘤生长得 到抑制，但是他们需要许多复杂的日程安排。再者化疗存在较低药物利用率、高细胞毒副作 用和非特异性等的缺陷，严重限制了它们在癌症治疗上的应用。因此，急需发展一个主动或 被动祀向癌细胞药物载体系统。纳米生物技术可W为目前化疗的难题提供一个好的解决方 法，而且可W为癌症治疗的药物和基因提供一个可控稳定和祀向性的释放。但是目前对于 纳米药物载体的研究主要侧重于其智能性、祀向性，对纳米载体本身具有抑制性的研究非 常少。同时有研究报道抗坏血酸具有抑制肿瘤的作用，包括去年11月《Science》上的一项研 究报告，也证明了维生素 C在小鼠体内可W遏制肿瘤生长的功能。根据对药理学抗坏血酸的 作用机制的理解可W将其用于疾病治疗，例如将抗坏血酸作为癌症治疗的佐剂。
【发明内容】
[0003] 本发明利用共自组装方法，制备一种生物相容性好，可降解的，有肿瘤抑制作用的 复合纳米药物载体。我们主要基于W上两点，在保持纳米载体功能性和保护维生素 C抗氧化 性的基础上，设计合成了含有维生素 C单元的聚合物纳米粒子，使之不仅可W发挥聚合物纳 米粒子在递送化药的优势，而且其本身还具有一定抑制肿瘤的作用，使传统意义上的运载 化疗药物的"车"自身也能发挥药物的作用，充分发挥药物制剂整体的效果，增强治疗效果。
[0004] 本发明提出的一种自身具有抑制肿瘤作用的复合纳米药物递载体，其特征在于， 两亲性聚合物聚乳酸-嵌-聚维生素 C丙締酸醋(PLA-block-PAAA)与聚乳酸-嵌-聚乙二醇 (PLA-block-PEG)通过共自组装的方式制备得到的复合纳米药物载体。在祀向性递送化疗 药物的基础上，自身具有抗肿瘤作用，与化疗药物具有协同抑制肿瘤的作用。
[0005] 材料聚乳酸-嵌-聚维生素 C丙締酸醋(PLA-block-PAAA)的结构式：
[0006]
[0007] 10《n《200，100，n和m为整数。
[000引材料聚乳酸-嵌-聚乙二醇(PLA-block-PEG)的结构式：
[0009]
[0010] 40《9《200，10《9《200,9和9为整数，3为能够禪连巧光分子或者祀标分子的功 能性官能团，如班巧酷醋（NHS)、氨基（N出）、马来酷亚胺顺下締二酷亚胺(MAL)和生物素 (Biotin)等的基团。
[0011] 聚乳酸-嵌-聚维生素 C丙締酸醋(PLA-block-PAAA)和聚乳酸-嵌-聚乙二醇(PLA- block-PEG)两者的摩尔比例为1:1~12:1。
[0012] -种含有自身具有抑制肿瘤作用的复合纳米载体的药物递送体系的制备方法，其 具体步骤如下：
[0013] ①合成聚乳酸-嵌-聚维生素 C丙締酸醋(PLA-block-PAAA)和聚乳酸-嵌-聚乙二醇 (PLA-block-PEG)
[0014] 1)通过自由基聚合反应得到聚乳酸-嵌-聚维生素 C丙締酸醋(PLA-block-PAAA);
[0015] 用面化节保护维生素 C的活性締醇式径基，制备得到维生素 C丙締酸醋单体 (化AA);金属催化剂催化丙交醋开环聚合得到聚乳酸均聚物(PLA-Br)，PLA-化再和化AA通 过自由基聚合得到聚乳酸-嵌-苄基保护聚维生素 C丙締酸醋(PLA-block-PBnAA)，然后再通 过催化加氨得到聚乳酸-嵌-聚维生素 C丙締酸醋(PLA-block-PAAA)。
[0016] 2) W双径基端的PEG作为原料，一端功能化，另一端引发聚合，得到聚乳酸-嵌-聚 乙二醇（PLA-block-PEG)。
[0017] W双径基端的PEG作为原料，对聚乙二醇一端径基进行对甲苯横酷的保护，再进行 叠氮化，然后再修饰上可禪连巧光分子和祀标分子的功能化官能团；一端保留径基引发丙 交醋的开环聚合，得到聚乳酸-嵌-聚乙二醇(PLA-block-PEG)。
[0018] ②制备复合纳米药物递载体的药物递送体系：
[0019] 避光条件下，将聚乳酸-嵌-聚维生素 C丙締酸醋(PLA-block-PAAA)、聚乳酸-嵌-聚 乙二醇(PLA-block-PEG)和化疗药物溶于有机溶剂中，其中优选化疗药物的质量分数浓度 为10%~100%，整个聚合物材料的浓度为l.Omg/mL，采用共自组装方法得到复合纳米药物 递送材料。
[0020] 所用的自由基聚合法为RAFT、ATRP或NMRP法。
[0021 ] 所用的双径基端的PEG分子量为2000-5000。
[0022] 所用的PEG-端用来禪连巧光分子或者祀标分子的功能性官能团（R)为班巧酷醋 (NHS)、马来酷亚胺顺下締二酷亚胺(MAL)、氨基(NH2)和生物素(Biotin)等。
[0023] 所用的有机溶剂为Ξ氯甲烧、二甲基亚讽、四氨巧喃。
[0024] 所用的复合纳米递送体系的制备方法中的自组装方法为乳化溶剂蒸发法、透析法 或微相分离法。
[0025] 本发明的优势在于形成的复合纳米粒子可W保护维生素讨亢氧化性，并使药物递 送体系在保持纳米载体功能性的基础上，可W发挥聚合物纳米粒子在递送化药的优势，而 且其本身还具有一定抑制肿瘤的作用，使传统意义上的运载化疗药物的"车"自身也能发挥 药物的作用，充分发挥药物制剂协同抑制肿瘤的效果，增强疗效。
【附图说明】
[0026] 图1含本发明的复合纳米载体的药物递送体系示意图；
[0027] 图2复合纳米粒子对NIH 3T3细胞的毒性实验结果图；
[0028] 图3不同肿瘤细胞系对复合纳米粒子和抗坏血酸的敏感性测试效果图。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合实施例对本发明进一步说明，但本发明并不限于W下实施例。
[0030] 实施例1
[0031] 1)在氮气保护下，依次向10毫升反应瓶中加入化合物引发剂PLA-Br(1.12mmol)， 偶氮二异下腊(〇.〇14mmol)，维生素 C单体(2.16mmol)和甲苯（ImL)，反应体系置于60°C油浴 中揽拌14h后。反应体系用Ξ氯甲烧溶解，浓缩后在无水甲醇中沉淀重复3次，得到聚合物 PLAi2〇-block-PAAA3〇 ；
[0032] 2)W双径基端的PEG4000作为原料，一端NHS化，另一端引发丙交醋开环聚合，直形 的Schlenk瓶除水除氧后加入重结晶处理过的L型丙交醋（g.Ommol)、引发剂H0-PEG- Maleimide(0.085mmol)、催化剂辛酸亚锡（1.05mmol)和甲苯2.0血。将整个反应体系置于85 °(：油浴中开始反应，反应4h后停止，用液氮快速终止反应。反应体系用Ξ氯甲烧溶解，在无 水甲醇中沉淀离屯、3次，真空干燥化，得到白色粉末状聚合物PLA2〇〇-block-PEG8〇。
[0033] ②制备复合纳米递送体系：
[0034] 避光条件下，将奥沙利销（10% )、聚合物PLAi2〇-block-PAAA3〇( 1.6祉mol)和聚合物 PLA2Q()-block-PEG8()(0.14皿〇1)溶于4血四氨巧喃。完全溶解后缓慢滴加4mL去离子水。连续 揽拌约化后，旋转蒸发除有机溶剂，得到载奥沙利销的复合纳米粒子的溶液。
[0035] 实施例2
[0036] ①合成聚合物 PLA-block-PAAA 和 PLA-block-PEG
[0037] 1)在圆底Schlenk瓶中加入引发剂PLA-化(0.085mmol)、维生素 C单体(2.16mmol)、 配体PMDETA(0.1 Immol)、漠化铜（0.0043mmol)和无水甲苯2. OmL，室溫下密封揽拌溶解过 夜。冷冻循环Ξ次，在氮气保护下加入漠化亚铜(〇.〇85mmol)，继续进行冷冻循环3次。75°C 油浴中反应40h，用液氮快速终止反应。反应体系用Ξ氯甲烧溶解，用中性氧化侣的柱子除 铜，浓缩后在无水甲醇中沉淀重复3次，得到聚合物PLAso-block-PAAAio;
[0038] 2) W双径基端的PEG2000作为原料，一端氨基化，另一端引发乙二醇聚合，直形的 Schlenk瓶除水除氧后加入乙二醇（10.5mmol)、引发剂册-PEG-Maleimide(0.0525mmol)和 甲苯3 .OmL。将整个反应体系置于90°C油浴中开始反应，反应化后停止，用液氮快速终止反 应。反应体系用Ξ氯甲烧溶解，在无水甲醇中沉淀离屯、3次，真空干燥化，得到白色粉末状聚 合物 PLA3〇〇-block-PEG4〇。
[0039] ②制备复合纳米递送体系：
[0040] 避光条件下，将阿霉素（50 % )、聚合物化AsQ-block-PAAAiQ(0.9如mol)和聚合物 PLA3Q()-block-PEG4() (0.14皿〇1)溶于4血Ξ氯甲烧。完全溶解后缓慢滴加4mL去离子水。连续 揽拌约化后，将纳米体系转移到截留分子量(MWC0)为3500的渗析袋中，置于0.15M的抑7.4 的憐酸盐缓冲液中进行渗析，得到载阿霉素的复合纳米粒子的溶液。
[0041 ] 实施例3
[0042] ①合成聚合物 PLA-b 10 ck-PAAA 和 PLA-b 10 ck-PEG
[0043] 1)在圆底Sch 1 enk瓶中加入引发剂PLA-Br (0.11 Ommo 1)、维生素 C单体（1.86mmo 1)、 链转移试剂4-氯基戊酸二硫代苯甲酸(0. lOmmol)和二氧六环3.OmL,室溫下密封揽拌至溶 液澄清。冷冻循环Ξ次。60°C油浴中反应2地，用液氮快速终止反应。反应体系用Ξ氯甲烧溶 解，在无水甲醇中沉淀重复3次，得到聚合物PLAiso-block-PAAAso;
[0044] 2) W双径基端的PEG5000作为原料，一端生物素化，另一端引发乙二醇聚合，直形 的Schlenk瓶除水除氧后加入乙二醇（10.5mmol)、引发剂册-PEG-Maleimide(0.0525mmol) 和甲苯3.OmL。将整个反应体系置于100°C油浴中开始反应，反应4h后停止，用液氮快速终止 反应。反应体系用Ξ氯甲烧溶解，在无水甲醇中沉淀离屯、3次，真空干燥化，得到白色粉末状 聚合物 PLA2 日日-block-PEGi2〇。
[0045] ②制备复合纳米递送体系：
[0046] 避光条件下，将多西他赛（100%)、聚合物PLAi8〇-block-PAAA8〇(0.14皿〇1)和聚合 物PLA2日日-block-PEGi2〇(0.14μηιο1)溶于4mL二甲基亚讽。完全溶解后缓慢滴加4mL去离子水。 用MCW0为1000的超滤离屯、管离屯、除有机试剂，得到载多西他赛的复合纳米粒子的溶液。
[0047] 数据集：
[0048] 1)复合纳米粒子具有良好的生物相容性
[0049] 测试条件：聚合物胶束浓度:〇. 1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.5mg/mL 测试细 胞:小鼠胚胎成纤维细胞(NIH 3T3);测试时间：24，48，7化;试剂盒:MTS试剂盒;现聯仪器： 酶标仪，490nm。
[0050] 2)复合纳米粒子自身具有一定的肿瘤抑制作用
[0051] 测试条件：聚合物胶束浓度：800、400、200、100、50、25、12.5、6.75、3.38、1.56、 0.84、0.42μg/mレ测试细胞：脑胶质瘤细胞（C6)、人乳腺癌细胞（MCF-7)、人肺癌细胞 化1299)、人肺癌细胞(95C)、人卵巢腺癌细胞(Sk-ov-3)、人宫颈癌细胞化ela)、人口腔癌细 胞(ACC)、人肝癌细胞化址-7)、人肝癌细胞化epG2);测试时间：4化;试剂盒:MTS试剂盒；ii 试仪器:酶标仪，490nm。
[0052] Table 1 Molecular Qiaracteristics of PLA-block-PEG
[0化6] 表1:
[0化7] 表示W马来酷化端基阳G为大分子引发剂；
[0化引b DPrati。表示嵌段聚合物PLA-block-PEG的疏水片段重复单元数；
[0059] 皆义均分子量是由核磁氨谱计算得到的；
[0060] d数均分子量和Mw/Mn即PDI是由GPC得到的；
[0061] 表2:
[0062] 3mi表示W乳酸均聚物PLA-化为大分子引发剂；
[0063] 6 DPrati。表示嵌段聚合物化A-block-PBnAA的疏水片段与亲水片段的重复单元数 之比，如120/30表示疏水片段重复单元为120,亲水片段重复单元为30的嵌段聚合物；
[0064] 等义均分子量是由核磁氨谱计算得到的；
[0065] d数均分子量和Mw/Mn即PDI是由GPC得到的；
[0066] e DPrati康示氨化后通过氨化率计算得到的最终的两亲性聚合物PLA-block-PAAA 的疏水与亲水片段重复单元数之比。
【主权项】
1. 一种自身具有抑制肿瘤作用的复合纳米药物递载体，其特征在于，两亲性聚合物聚 乳酸-嵌-聚维生素 C丙烯酸酯(PLA-block-PAAA)与聚乳酸-嵌-聚乙二醇(PLA-block-PEG) 通过共自组装的方式得到的复合纳米药物载体； 材料聚乳酸-嵌-聚维生素 C丙烯酸酯(PLA-block-PAAA)的结构式：10彡η彡200，5彡m彡100，n和m为整数； 材料聚乳酸-嵌-聚乙二醇(PLA-block-PEG)的结构式：40<p<200，10<q<200，p和q为整数，R为能够耦连荧光分子或者靶标分子的功能性 官能团。2. 按照权利要求1所述的一种自身具有抑制肿瘤作用的复合纳米药物递载体，其特征 在于，R为琥珀酰酯(NHS)、氨基(NH2)、马来酰亚胺顺丁烯二酰亚胺(MAL)或生物素(Biotin) 的基团。3. 按照权利要求1所述的一种自身具有抑制肿瘤作用的复合纳米药物递载体，其特征 在于，聚乳酸-嵌-聚维生素 C丙烯酸酯（PLA-block-PAAA)和聚乳酸-嵌-聚乙二醇（PLA-block-PEG)两者的摩尔比例为1:1 ~12:1 。4. 一种含有权利要求1所述的自身具有抑制肿瘤作用的复合纳米药物递载体的药物递 送体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： ① 合成聚乳酸-嵌-聚维生素 C丙烯酸酯（PLA-block-PAAA)和聚乳酸-嵌-聚乙二醇 (PLA-block-PEG)； 1) 通过自由基聚合反应得到聚乳酸-嵌-聚维生素 C丙烯酸酯(PLA-block-PAAA); 2) 以双羟基端的PEG作为原料，一端功能化，另一端引发丙交酯的开环聚合，得到聚乳 酸-嵌-聚乙二醇（PLA-block-PEG); ② 制备包复合纳米药物递载体的药物递送体系： 避光条件下，将聚乳酸-嵌-聚维生素 C丙烯酸酯(PLA-block-PAAA)、聚乳酸-嵌-聚乙二 醇(PLA-block-PEG)和化疗药物溶于有机溶剂中，采用共自组装方法得到药物递送体系。5. 按照权利要求4的方法，其特征在于，聚乳酸-嵌-聚维生素 C丙烯酸酯(PLA-block-PAAA)的制备：用卤化苄保护维生素 C的活性烯醇式羟基，制备得到维生素 C丙烯酸酯单体 (BnAA);金属催化剂催化丙交酯开环聚合得到聚乳酸均聚物(PLA-Br) ,PLA-Br再和BnAA通 过自由基聚合得到聚乳酸-嵌-苄基保护聚维生素 C丙烯酸酯(PLA-block-PBnAA)，然后再通 过催化加氢得到聚乳酸-嵌-聚维生素 C丙烯酸酯(PLA-block-PAAA); 聚乳酸-嵌-聚乙二醇(PLA-block-PEG)的制备：以双羟基端的PEG作为原料，对聚乙二 醇一端羟基进行对甲苯磺酰的保护，再进行叠氮化，然后再修饰上可耦连荧光分子和靶标 分子的功能化官能团；一端保留羟基引发丙交酯的开环聚合，得到聚乳酸-嵌-聚乙二醇 (PLA-block-PEG)〇6. 按照权利要求4的方法，其特征在于，制备包复合纳米药物递载体的药物递送体系 时，化疗药物的质量分数浓度为10%~100% ;整个聚合物材料的浓度为I .Omg/mL。7. 按照权利要求4的方法，其特征在于，用的自由基聚合法为RAFT、ATRP或NMRP法。8. 按照权利要求4的方法，其特征在于，所用的双羟基端的PEG分子量为2000-5000。9. 按照权利要求4的方法，其特征在于，所用的有机溶剂为三氯甲烷、二甲基亚砜或四 氢呋喃。10. 按照权利要求4的方法，其特征在于，复合纳米递送体系的制备方法中的自组装方 法为乳化溶剂蒸发法、透析法或微相分离法。
【文档编号】A61K47/48GK105999282SQ201610320069
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】杨晶, 宋玉凤, 谢嫣琪, 李瑞琼
【申请人】北京化工大学