一种不同粒径跨血脑屏障膜荧光二氧化硅纳米颗粒的制备方法
【专利摘要】本发明涉及不同粒径跨血脑屏障膜荧光二氧化硅的制备方法，包括荧光3?氨丙基三乙氧基硅烷前体的制备，荧光二氧化硅纳米颗粒FSiNPs的制备，FSiNPs?PEG2000?Mal的制备，FSiNPs?PEG2000?CDX的制备。该方法控制反应条件制备不同尺寸的荧光二氧化硅纳米颗粒，并在其表面选择性连接跨血脑屏障膜靶向分子。该荧光纳米颗粒具有结构稳定、生物相容性好、荧光信号强等特点。所得的产物能满足科研的需求。本发明中的制备方法工艺简单，可操作性强，能进一步满足生产和应用。
【专利说明】
一种不同粒径跨血脑屏障膜荧光二氧化硅纳米颗粒的制备方法
技术领域
[0001]本发明具体涉及一种以二氧化硅为介质，同时连接荧光分子和血脑屏障靶向分子的制备技术。本发明属于纳米生物医药材料领域。【背景技术】
[0002]根据世界卫生组织(WHO)在2008年的报道，在全球范围内，脑肿瘤的发病率大约为 3.5/100，000。在全身肿瘤的发病率中，其发病率仅次于胃、子宫、乳腺及食管癌的发病率。 此外，脑肿瘤病人的中位生存期非常短，仅为16个月，在不治疗的情况下，只有3 %-10 %的病人能活过5年。目前，由于脑肿瘤，尤其是脑胶质瘤呈浸润性生长，与周围正常脑组织边界不清，使得手术完全切除十分困难，从而导致较高的复发率。而化疗不仅能杀灭尚处于初期的脑肿瘤细胞，还能对术后残留的脑肿瘤细胞起到杀伤作用，从而防止脑肿瘤的复发。但是，在脑肿瘤化疗方面，最为突出的问题就是由于血脑屏障(BBB，blood-brain barrier)的存在，抗癌药物自身不能进入脑内，从而对脑肿瘤治疗起到阻碍作用。
[0003]之所以BBB对化疗药物起着阻碍效果，这还得归结于其自身的结构特点。BBB主要是由脑微血管内皮细胞(ECs)、内皮细胞间紧密连接(TJs)、基膜、周细胞和星形胶质细胞组成。由于TJs的存在，血管内皮细胞对血液中携带的分子的通透性十分低。有研究发现BBB上的膜孔径大小约为0.4 nm，比非神经内皮细胞的孔径(6-7 nm)要小的多。此外，TJs还使得 BBB有很高的电阻值(1000-2000 Q / cm2)，从而能够阻止极性以及带电荷的物质进入脑内。
[0004]如何穿越BBB并对脑肿瘤进行给药治疗，困扰着广大的科研工作者。随着纳米技术的出现，利用纳米材料进行脑肿瘤靶向递药取得了极大的发展。研究人员通常利用纳米材料为递药载体，通过在载体表面修饰上靶向分子(小分子、寡聚核苷酸、多肽、抗体等)，利用 BBB表面存在的受体，使得药物载体能够在受体介导内吞机制的帮助下主动穿透BBB屏障膜，从而进入脑肿瘤区域并释药，最终达到治愈脑肿瘤的目的。
[0005]尽管在脑肿瘤靶向递药上取得了一些成果，但目前脑肿瘤靶向递药仍然存在靶向性低的问题，具体表现为递药载体穿越BBB的能力较低，从而对治疗效果造成较大的影响。 针对这一问题，我们认为药物载体的粒径大小很可能是影响靶向效果的重要因素。
【发明内容】
[0006]为克服现有技术的不足，本发明提供一种不同粒径跨血脑屏障膜荧光二氧化硅的制备方法。为实现这样的目的，在本发明的技术方案中，我们首先用3-氨丙基三乙氧基硅烷 (APTES)对得到的荧光二氧化硅纳米颗粒(FSiNPs)进行表面修饰，使其表面修饰上氨基基团，为后续聚乙二醇(PEG)的嫁接提供了可能。接着我们利用NHS( N-羟基琥珀酰亚胺)和氨基的特异性反应，将NHS-PEG2(xx)-Mal修饰至FSiNPs表面。为了构建有靶分子的FSiNPs，通过 Mai (马来酰亚胺)基团和巯基(-SH)的特异性反应，CDX(乙酰胆碱受体介导脑靶向多肽)被修饰至SiNPs-PEG2_上。
[0007] —种不同粒径跨血脑屏障膜荧光二氧化硅纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:(1)荧光3-氨丙基三乙氧基硅烷前体的制备取2.0 mg含羧基的荧光分子，分散在1.0 mL乙醇中，超声一小段时间，待溶液澄清后， 在磁力搅拌器的作用下，加入80yL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，避光反应24小时，制备得到荧光APTES前体；(2)荧光二氧化硅纳米颗粒FSiNPs的制备依次将0.5 mL TE0S和0.1 mL荧光APTES前体溶解在乙醇/水的混合溶剂中，乙醇:水= 0.5:1-2:1，然后与0.1-1.〇11^25%浓氨水混合，搅拌反应24小时，随后依次用乙醇和水洗涤3遍，最后4摄氏度保存二甲基甲酰胺(DMH中，制备得到FSiNPs;(3)FSiNPs-PEG2_-Mal 的制备将1.6微升三乙胺加入到上述FSiNPs的DMF溶液中，搅拌均匀，加入20 mg NHS-PEG2Q()()-Mal，室温下反应2小时；分别用DMF以及水离心洗涤，保存在1.0 mL 10 mM roS(磷酸缓冲盐溶液，pH 7.4)中；(4)FSiNPs-PEG2_-CDX 的制备称取1.0 mg SH-⑶X，将其加入到上述roS中，过夜搅拌反应;反应液用roS、水离心洗涤，最后4摄氏度保存在水相中，1.0 mL。[00〇8]所述的含羧基的荧光分子为6-羧基荧光素、5-羧基荧光素、荧光素cy3、荧光素 cy5.5、6_羧基四甲基罗丹明的一种。
[0009]该方法控制反应条件制备不同尺寸的荧光二氧化硅纳米颗粒，并在其表面选择性连接跨血脑屏障膜靶向分子。该荧光纳米颗粒具有结构稳定、生物相容性好、荧光信号强等特点。所得的产物能满足科研的需求。
[0010]本发明的优点在于:(1)本发明以荧光二氧化硅为介质，通过偶联的方法将血脑屏障膜靶向分子嫁接其上， 所用原料生物安全性高。
[0011](2)本发明制备的荧光纳米颗粒具有良好的物理化学稳定性、发光性能和血脑屏障膜靶向性能。
[0012](3)本发明中的制备方法工艺简单，可操作性强，能进一步满足生产和应用。【附图说明】[0〇13]图1为实施例1所制备的30 nm荧光二氧化硅纳米颗粒的透射电子显微镜图。[〇〇14]图2为实施例2所制备的50 nm荧光二氧化硅纳米颗粒的透射电子显微镜图。[〇〇15]图3为实施例3所制备的100 nm荧光二氧化硅纳米颗粒的透射电子显微镜图。[〇〇16]图4为实施例4所制备的200 nm荧光二氧化硅纳米颗粒的透射电子显微镜图。【具体实施方式】[〇〇17]以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。
[0018]实施例1:1.荧光APTES前体的制备取2.0 mg 6-羧基荧光素，分散在1.0 mL乙醇中，超声一小段时间，待溶液澄清后，在磁力搅拌器的作用下，加入80微升APTES，避光反应24小时，制备得到荧光APTES前体。
[0019]2.FSiNPs的制备依次将0.5 mL TE0S和0.1 mL荧光APTES前体溶解在乙醇/水的混合溶剂中(乙醇:水= 0.5:1)，然后与0.1 mL 25%浓氨水混合，搅拌反应24小时。随后依次用乙醇和水洗涤3遍， 最后4摄氏度保存DMF中，制备得到FSiNPs。
[0020]3.FSiNPs-PEG2QQ()-Mal的制备将1.6微升三乙胺加入到上述FSiNPs的DMF溶液中，搅拌均匀，加入20 mg NHS-PEG2Q(x)-Mal，室温下反应2小时。分别用DMF以及水离心洗涤，保存在1.0 mL 10 mM roS (磷酸缓冲盐溶液，pH 7.4)中。
[0021]4.FSiNPs-PEG2_-CDX的制备称取1.0 mg SH-⑶X，将其加入到上述roS中，过夜搅拌反应。反应液用roS、水离心洗涤，最后4摄氏度保存在水相中(1.0 mL)。[〇〇22]图1为所制备的粒径为30 nm荧光二氧化硅纳米颗粒的透射电子显微镜图。[〇〇23]实施例2:1.荧光APTES前体的制备取2.0 mg荧光素cy3,分散在1.0 mL乙醇中，超声一小段时间，待溶液澄清后，在磁力搅拌器的作用下，加入80微升APTES，避光反应24小时，制备得到荧光APTES前体。
[0024]2.FSiNPs的制备依次将0.5 mL TE0S和0.1 mL荧光APTES前体溶解在乙醇/水的混合溶剂中(乙醇:水= 1:1)，然后与0.2 mL 25%浓氨水混合，搅拌反应24小时。随后依次用乙醇和水洗涤3遍，最后4摄氏度保存DMF中，制备得到FSiNPs。
[0025]3.FSiNPs-PEG2QQ()-Mal的制备将1.6微升三乙胺加入到上述FSiNPs的DMF溶液中，搅拌均匀，加入20 mg NHS-PEG2Q(x)-Mal，室温下反应2小时。分别用DMF以及水离心洗涤，保存在1.0 mL 10 mM roS (磷酸缓冲盐溶液，pH 7.4)中。
[0026]4.FSiNPs-PEG2_-CDX的制备称取1.0 mg SH-⑶X，将其加入到上述roS中，过夜搅拌反应。反应液用roS、水离心洗涤，最后4摄氏度保存在水相中(1.0 mL)。[〇〇27]图2为所制备的粒径为50 nm荧光二氧化硅纳米颗粒的透射电子显微镜图。[〇〇28]实施例3:1.荧光APTES前体的制备取2.0 mg荧光素cy5.5,分散在1.0 mL乙醇中，超声一小段时间，待溶液澄清后，在磁力搅拌器的作用下，加入80微升APTES，避光反应24小时，制备得到荧光APTES前体。
[0029]2.FSiNPs的制备依次将0.5 mL TE0S和0.1 mL荧光APTES前体溶解在乙醇/水的混合溶剂中(乙醇:水= 1.5:1)，然后与0.5 mL 25%浓氨水混合，搅拌反应24小时。随后依次用乙醇和水洗涤3遍，最后4摄氏度保存DMF中，制备得到FSiNPs。
[0030]3.FSiNPs-PEG2_-Mal的制备将1.6微升三乙胺加入到上述FSiNPs的DMF溶液中，搅拌均匀，加入20 mg NHS-PEG2Q(x)-Mal，室温下反应2小时。分别用DMF以及水离心洗涤，保存在1.0 mL 10 mM roS (磷酸缓冲盐溶液，pH 7.4)中。
[0031]4.FSiNPs-PEG2_-CDX的制备称取1.0 mg SH-⑶X，将其加入到上述roS中，过夜搅拌反应。反应液用roS、水离心洗涤，最后4摄氏度保存在水相中(1.0 mL)。[〇〇32]图3为所制备的粒径为100 nm荧光二氧化硅纳米颗粒的透射电子显微镜图。[〇〇33]实施例4:1.荧光APTES前体的制备取2.0 mg6-羧基四甲基罗丹明，分散在1.0 mL乙醇中，超声一小段时间，待溶液澄清后，在磁力搅拌器的作用下，加入80微升APTES，避光反应24小时，制备得到荧光APTES前体。
[0034]2.FSiNPs的制备依次将0.5 mL TE0S和0.1 mL荧光APTES前体溶解在乙醇/水的混合溶剂中(乙醇:水= 2:1)，然后与1 mL 25%浓氨水混合，搅拌反应24小时。随后依次用乙醇和水洗涤3遍，最后4 摄氏度保存DMF中，制备得到FSiNPs。
[0035]3.FSiNPs-PEG2_-Mal的制备将1.6微升三乙胺加入到上述FSiNPs的DMF溶液中，搅拌均匀，加入20 mg NHS-PEG2Q(x)-Mal，室温下反应2小时。分别用DMF以及水离心洗涤，保存在1.0 mL 10 mM roS (磷酸缓冲盐溶液，pH 7.4)中。
[0036]4.FSiNPs-PEG2Q〇()-CDX的制备称取1.0 mg SH-⑶X，将其加入到上述roS中，过夜搅拌反应。反应液用roS、水离心洗涤，最后4摄氏度保存在水相中(1.0 mL)。[〇〇37]图4为所制备的粒径为200 nm荧光二氧化硅纳米颗粒的透射电子显微镜图。
【主权项】
1.一种不同粒径跨血脑屏障膜荧光二氧化硅纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括 如下步骤:(1)荧光3-氨丙基三乙氧基硅烷前体的制备取2.0 mg含羧基的荧光分子，分散在1.0 mL乙醇中，超声一小段时间，待溶液澄清后， 在磁力搅拌器的作用下，加入80yL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，避光反应24小时，制备 得到荧光APTES前体；(2)荧光二氧化硅纳米颗粒FSiNPs的制备依次将0.5 mL TEOS和0.1 mL荧光APTES前体溶解在乙醇/水的混合溶剂中，乙醇:水= 0.5:1-2:1，然后与0.1-1.〇11^25%浓氨水混合，搅拌反应24小时，随后依次用乙醇和水洗 涤3遍，最后4摄氏度保存二甲基甲酰胺(DMH中，制备得到FSiNPs;(3 )FSiNPs-PEG2_-Mal 的制备将1.6微升三乙胺加入到上述FSiNPs的DMF溶液中，搅拌均匀，加入20 mg NHS-PEG2000-Mal，室温下反应2小时;分别用DMF以及水离心洗涤，保存在1.0 mL 10 mM roS(磷酸缓冲盐 溶液，pH 7.4)中；(4)FSiNPs-PEG2_-CDX的制备称取1.0 mg SH-⑶X，将其加入到上述PBS中，过夜搅拌反应；反应液用roS、水离心洗 涤，最后4摄氏度保存在水相中，1.0 mL。2.根据权利要求1所述一种不同粒径跨血脑屏障膜荧光二氧化硅纳米颗粒的制备方 法，其特征在于，所述的含羧基的荧光分子为6-羧基荧光素、5-羧基荧光素、荧光素cy3、荧 光素cy5.5、6-羧基四甲基罗丹明的一种。
【文档编号】A61K49/00GK105999296SQ201610398081
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】何丹农, 张鹏, 王萍, 金彩虹
【申请人】上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司