血浆补充的制剂的制作方法

血浆补充的制剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种血浆补充的纤维蛋白原和/或血纤蛋白制剂、其制备方法和用途。
【专利说明】
血浆补充的制剂
技术领域
[0001] 本文提供了一种用于制备血浆补充的纤维蛋白原和/或血纤蛋白制剂的方法，一 种血浆补充的纤维蛋白原和/或血纤蛋白制剂及其使用方法。
【背景技术】
[0002] 血纤蛋白密封剂也称为纤维蛋白胶，已在临床中使用了数十年(参见例如，Tab6l6 等人，制药和药物科学杂志，2012年第15卷第124-140页(J Pharm Pharmaceut Sci 2012， 15 :124-140) ;Dickneite，G等人，血检形成研究，2003年第112卷第73-82页（Thrombosis Res 2003，112: 73-82)。通常，血纤蛋白密封剂由两种液体组分组成，包含纤维蛋白原的组 分和包含凝血酶的组分，此类组分由于它们固有的不稳定性被冷冻储存。有时血纤蛋白密 封剂产品由两种冷冻干燥的组分组成，所以需要就在使用之前重构以及通过连接的注射器 或其它双筒递送装置进行递送。冷冻干燥的制剂通常是稳定的，但是纤维蛋白原组分难以 重构。
[0003] 血纤蛋白密封剂凝块通过涉及纤维蛋白原、凝血酶和因子XIII的酶促反应形成。 凝血酶通过酶促作用以由凝血酶浓度确定的速率将纤维蛋白原转化成血纤蛋白。因子XIII 作为血液凝固系统的酶，使血纤蛋白凝块交联并且稳定。此过程绕过了正常凝固的大多数 步骤，并且模拟其最终阶段。一些制造商将抗蛋白水解剂添加到血纤蛋白制剂（例如，如 TO93/05822中所述），或特异性除去纤溶酶原以使纤维蛋白溶解停止或延迟(例如，如美国 专利5，792，835和7，125，569中所述）。纤维蛋白原和凝血酶组分可来自人或动物(例如，牛 或猪）来源或可重组产生。在将两种组分溶液混合时，凝血酶裂解纤维蛋白原，因此使纤维 蛋白原聚合成血纤蛋白并生成密封剂。凝血酶组分包含凝血酶，其为丝氨酸蛋白酶。
[0004] 某些工业纤维蛋白原级分的制备过程导致从纤维蛋白原组合物中部分或完全除 去血浆蛋白中的一些。恰当的示例为这样的纤维蛋白原的制备，该纤维蛋白原包含在因子 VIII(FVIII)制造过程中作为副产物获得的级分。虽然该富含纤维蛋白原的级分可用于获 得用作血纤蛋白密封剂组分的纤维蛋白原组合物，但该级分在工艺步骤过程中可被部分地 或完全地从血浆蛋白质中的一些中耗尽。因此，从此类富含纤维蛋白原的级分获得的纤维 蛋白原具有低水平的重要血浆蛋白或完全缺少重要血浆蛋白。
[0005]
【背景技术】包括美国专利4，341，764; 4，455，300; 5，834，420 和6，277，961。

【发明内容】

[0006] 本文提供了一种用于制备血浆补充的纤维蛋白原的方法、血浆补充的纤维蛋白原 及其用途以便制造密封剂制剂的组分。
[0007] 另外，本文提供了一种用于制造纤维蛋白原制剂的方法、纤维蛋白原制剂自身及 其用途，尤其是，在组织密封剂制剂中作为纤维蛋白原组分的用途。
[0008] 在一个方面，本文提供了一种制备纤维蛋白原制剂的方法，该方法包括如下步骤： 将浓缩纤维蛋白原制备物和血液血浆源混合。浓缩纤维蛋白原制备物涉及这样的制品，该 制品包含比血液或血衆中纤维蛋白原浓度更高的纤维蛋白原浓度(大于约2mg/ml-4mg/ml 并且例如最高200mg/ml)。浓缩纤维蛋白原制备物可从例如哺乳动物来源(例如，人或猪)获 得或可经重组获得。在一些实施方案中，浓缩纤维蛋白原制备物来源于血液或血液级分。在 一些实施方案中，浓缩纤维蛋白原制备物来源于人血或人血级分。
[0009] 在该方法的各种实施方案中，在浓缩纤维蛋白原制备物中纤维蛋白原的浓度为约 10mg/ml至约200mg/ml，例如，约 10mg/ml至150mg/ml;约20mg/ml至40mg/ml;约 15mg/ml至 40mg/ml;约20mg/ml至约 150mg/ml;约30mg/ml;或约25mg/ml至 120mg/ml。在一些实施方案 中，浓缩纤维蛋白原制备物为冷沉淀物。在各种实施方案中，冷沉淀物为因子VIII耗尽的冷 沉淀物(FDC)。在与包含血衆源的溶液混合后，纤维蛋白原浓度可在7mg/ml至150mg/ml，约 20mg/ml至约40mg/ml;约 15mg/ml至约40mg/ml;约25mg/ml至 120mg/ml，或约30mg/ml的范围 内。
[0010] 在该方法的一些实施方案中，血浆源为例如动物血浆，例如哺乳动物血浆，优选人 血浆。在一些实施方案中，血浆源为经混合的动物血浆;例如经混合的人血浆。在一个实施 方案中，血浆源为冷冻混合的血浆。冷冻混合的血浆为从其中去除冷沉淀物的混合血浆。通 常，血浆包含生长因子。在一个实施方案中，血浆源和/或纤维蛋白原是非自体同源的。在某 些实施方案中，血浆不是富血小板血浆。
[0011] 术语"富血小板血衆"（PRP)通常涉及来自体外的制品，其由在有限血浆体积中浓 缩的血小板组成（Lacci KM，Dardik A.，富血小板血浆:对其在创伤愈合中的使用的支持 (Lacci KM,Dardik A. Platelet-rich plasma: support for its use in wound healing.)耶鲁生物医学期刊（Yale J Biol Med.)2010年3月（2010.Mar);83(l):l-9))。
[0012] 术语"自体同源的"意指来源于同一个体或涉及既作为供体又作为受体的一个个 体。
[0013] 在一个实施方案中血浆不含凝血酶和/或为因子耗尽的血浆。
[0014] "因子耗尽的血浆"在本文是指耗尽一种或多种凝结因子(诸如因子II、因子X、因 子V)的血浆。
[0015] "因子-II耗尽的血衆"或"因子II耗尽的血衆"或"凝血酶原不足的血衆"由耗尽因 子II或凝血酶原的混合正常人血浆而制造。剩余的凝血酶原的活性可例如小于或等于 10%，或者小于等于1%。
[0016] 术语"不含凝血酶血浆"是指根据血小板凝聚时间测定或显色测定具有凝血酶活 性，例如等于或小于2IU/ml或者活性不可测出的血浆。
[0017] 在各种实施方案中，浓缩纤维蛋白原制备物和血衆源以约3:1至约1:3(w/v、v/v或 w/w)、约2:1至约1:2(w/v、v/v或w/w)或约1: l(w/v、v/v或w/w)的比率混合。
[0018] 在另一方面，本文提供纤维蛋白原制剂，该制剂包含用血浆补充的纤维蛋白原制 备物。在一些实施方案中，纤维蛋白原制剂通过将浓缩纤维蛋白原制备物和血液血浆源混 合而制备。浓缩纤维蛋白原制备物涉及如下制备物，该制备物包含比血液或血浆中纤维蛋 白原浓度更大的纤维蛋白原浓度，例如大于约2mg/ml至4mg/ml并且例如最高约200mg/ml。 浓缩纤维蛋白原制备物可从例如哺乳动物来源(例如，人或猪)获得或可经重组获得。在一 些实施方案中，浓缩纤维蛋白原制备物来源于血液或血液级分。在一些实施方案中，浓缩纤 维蛋白原制备物来源于人血或人血级分。
[0019] 在各种实施方案中，在浓缩纤维蛋白原制备物中纤维蛋白原的浓度为约lOmg/ml 至约200mg/ml，例如，约 10mg/ml至 150mg/ml;约20mg/ml至40mg/ml;约20mg/ml至约 150mg/ ml;约30mg/ml;或约25mg/ml至120mg/ml。在一些实施方案中，浓缩纤维蛋白原制备物为冷 沉淀物。在各种实施方案中，冷沉淀物为因子VIII耗尽的冷沉淀物(FDC)。在与包含血浆源 的溶液混合后，纤维蛋白原浓度可在7mg/ml至150mg/ml，约20mg/ml至约40mg/ml;约15mg/ ml至约40mg/ml;约25mg/ml至 120mg/ml，或约30mg/ml的范围内。
[0020] 在一些实施方案中，血浆源为动物血浆，优选哺乳动物血浆例如人血浆。在一些实 施方案中，血浆源为经混合的动物血浆，例如经混合的人血浆(例如，冷冻混合血浆）。在各 种实施方案中，浓缩纤维蛋白原制备物和血衆源以约3:1至约1:3(w/v、v/v或w/w)，或者约 2:1至约1:2(w/v、v/v或w/w)或约1: l(w/v、v/v或w/w)的比率混合。
[0021] 在一些实施方案中，纤维蛋白原制剂为液体形式。在一些实施方案中，纤维蛋白原 制剂包含药学上可接受的载体。在一个实施方案中，制剂中的纤维蛋白原浓度在50mg/ml至 120mg/ml范围内。在另一个实施方案中，制剂中的纤维蛋白原浓度在50mg/ml至90mg/ml或 55mg/ml至85mg/ml的范围内，为约70mg/ml，在7mg/ml至150mg/ml，约20mg/ml至40mg/ml;约 15mg/ml至40mg/ml;约25mg/ml至 120mg/ml的范围内，或为约30mg/ml。
[0022] 纤维蛋白原制剂例如通过S/D处理、巴氏灭菌和/或过滤优选为无菌的并且不含病 原体。在各种实施方案中，纤维蛋白原制剂被冻干。
[0023] 在另一方面，提供保持血浆补充的纤维蛋白原制剂的容器。该容器可例如为安瓿、 小瓶或注射器。容器可由例如玻璃、金属或塑料制成。
[0024] 在另一方面，提供了一种试剂盒，其包括诸如安瓿、小瓶或注射器的容器，该容器 包含上文所公开的血浆补充的纤维蛋白原制剂;任选地，试剂盒包括凝血酶组分和/或使用 说明。在一些实施方案中，提供了一种试剂盒，该试剂盒包括带有浓缩纤维蛋白原制备物的 容器;和带有血浆的容器。试剂盒可还包括凝血酶组分和/或使用说明。该试剂盒可包括至 少一个容器和至少一个标签。合适容器的示例包括但不限于安瓿、小瓶、注射器和试管等。
[0025] 上文所公开的血浆补充的纤维蛋白原制剂可用于形成密封剂以用于，例如止血、 愈合和/或外科，包括但不限于移植物固定、创伤愈合，吻合部位的修复、重组和密封。纤维 蛋白原制剂还可用于整形外科的密封剂，例如腹壁整形术;皮肤和内部器官移植物固定;组 织愈合;灼伤治疗;和/或减弱创伤出血。此类制剂还可用于例如在颅或脊椎外科中的硬脑 膜密封。
[0026] 因此，在一个方面，提供一种向需要受试者的表面提供止血治疗;移植物固定；创 伤愈合和/或吻合的方法，该方法包括向该表面施用治疗学上有效量的血浆补充的纤维蛋 白原制剂。该方法包括但不限于腹壁整形术;组织愈合;灼伤治疗;和硬脑膜密封。受试者可 为动物，例如哺乳动物受试者，包括人类受试者。
[0027] 在另一方面，提供血浆补充的纤维蛋白原制剂，其用于愈合、止血和/或外科。用途 包括但不限于移植物固定;创伤愈合;吻合;腹壁整形术;组织愈合;灼伤治疗;和硬脑膜密 封。
[0028] 在另一方面，本文提供用于在表面形成密封剂的方法，所述方法包括将血浆补充 的纤维蛋白原组分和凝血酶组分施用至该表面。
[0029] 在另一方面，本文提供了一种用于形成密封剂的方法。该方法包括使用血浆补充 的纤维蛋白原。
[0030] 在另一方面，本文提供了一种用于制造密封剂制剂的组分的方法，该方法包括如 下步骤:将浓缩纤维蛋白原制备物和血浆源混合。
[0031] 密封剂制剂可为一种组分密封剂制剂，或多组分密封剂制剂诸如双组分或更多组 分密封剂制剂。一种组分密封剂制剂的示例包括1^5318524、1^8367802、1^6262236 81、 US6268483 B1、US5750657A、US6500427 B1。在一个实施方案中，一种组分密封剂为稳定液 体密封剂制剂，其包含血纤蛋白单体和可逆的血纤蛋白聚合阻断剂。在一个实施方案中，单 组分密封剂制剂包括纤维蛋白原;和维生素 K-依赖性血小板凝聚酶原，诸如因子II (FII)和 因子X(FX)。
[0032] 表面可为受试者的出血或未出血表面。表面还可为例如体表、外部或内部身体器 官、血管或移植组织或器官。受试者可为动物，例如哺乳动物受试者，包括人类受试者。
[0033] 在某些实施方案中，在本发明各种方面中的血浆源不是冷沉淀物。
[0034] 在参阅以下详细的【具体实施方式】和附图后，本发明的这些和其它方面和实施方案 将变得显而易见。
【附图说明】
[0035]图1示出通过SDS-PAGE测试的多种纤维蛋白原制剂的比较结果，所述纤维蛋白原 制剂未用血衆补充(泳道2和泳道4)或已经用血衆补充(泳道1和泳道3)，在37°C (泳道1和泳 道2)或在-80°C (泳道3和泳道4)保存5天。
【具体实施方式】
[0036] 本发明部分基于意想不到的发现:用血液血浆补充浓缩纤维蛋白原制备物引起可 (尤其）用作生物密封剂的组分的稳定纤维蛋白原制备物。到目前为止，纤维蛋白原或包含 级分的纤维蛋白原已经与血浆隔离以生成用于组织密封剂的纤维蛋白原制剂，因此制造包 含附加血液血浆源至浓缩纤维蛋白原制备物的纤维蛋白原制剂违反直觉并被认为例如被 蛋白酶污染制剂。此外，与未经补充的纤维蛋白原制剂相比，血液血浆补充的纤维蛋白原制 剂表现出令人惊讶的稳定性。
[0037] 可例如通过观察制剂的凝胶分离图谱、通过借助Clauss法比较随着时间推移的纤 维蛋白原浓度或者通过制剂形成凝块的能力，来确定纤维蛋白原制剂的稳定性。
[0038] 本文所公开的是：制造纤维蛋白原制剂的方法、血浆补充的纤维蛋白原制剂自身 和使用血浆补充的纤维蛋白原制剂的方法，该制造纤维蛋白原制剂的方法包括该步骤:将 浓缩纤维蛋白原制备物和血浆源混合。
[0039] 除非内容明确指出不是这样，否则本文所用的不定冠词"一个(a)"和"一个(an)" 意为"至少一个"或"一个或多个"。
[0040]如本文所用，术语"包含"、"包括"、"具有"、以及它们的语法变体应被视为指定所 述特征、步骤或组分，但不排除添加一种或多种另外特征、步骤、组分或它们的组。
[0041 ]当数值前面为术语"约"时，术语"约"旨在指示+/-10 %。术语"g"是指克，"mg"是指 毫克，并且"ml"是指毫升。
[0042]本文所用术语"密封剂"可与术语"胶"互换使用。
[0043] "浓缩纤维蛋白原制备物"涉及这样的制品，该制品包含比血液或血浆中纤维蛋白 原浓度更高的纤维蛋白原浓度，诸如高于约2mg至4mg纤维蛋白原/ml并且例如最高200mg纤 维蛋白原/ml。浓缩纤维蛋白原制备物包含例如约20mg/ml至40mg/ml;约15mg/ml至40mg/ ml;约 10mg/ml至200mg/ml; 10mg/ml至 150mg/ml; 20mg/ml至 150mg/ml;约30mg/ml;或约 25mg/ml至120mg/ml。浓缩纤维蛋白原制备物可由任何来源制备，例如，哺乳动物来源（例 如，来自人血液血浆或猪血浆），或者可被重组。在一些实施方案中，浓缩纤维蛋白原制备物 为冷沉淀物。在与包含血衆源的溶液混合后，纤维蛋白原浓度可在7mg/ml至150mg/ml，约 20mg/ml至约40mg/ml;约 15mg/ml至约40mg/ml;约25mg/ml至 120mg/ml，或约30mg/ml的范围 内。
[0044] 在本发明的一个实施方案中，"浓缩纤维蛋白原制备物"为经纯化的纤维蛋白原制 备物。经纯化的纤维蛋白原制备物从包含纤维蛋白原的起始组合物获得，并通过使该起始 组合物经受一次或多次纯化步骤(诸如色谱分离步骤或析出步骤），得到富含纤维蛋白原的 制品（当与起始组合物比较时)而获得。
[0045] 术语"冷冻混合血衆"是指其中去除冷沉淀物的混合血浆。
[0046] 功能性纤维蛋白原的浓度可通过经修改的欧洲药典测定法（E u r 〇 p e a η Pharmacopeia Assay) (0903/1997)规程测量、以及通过Clauss A，快速测定纤维蛋白原浓 度的方法（Gerinnungsphysiologische Schne 1 lmethode zur Bestimmung des Fibrinogens) (Acta Haematol · 1957，17:237-246)测量；通过形成凝块的能力测量或者通 过本领域中已知的任何其它方法测量，所述欧洲药典测定法在《欧洲药典》，血纤蛋白密封 剂试剂盒，1997;0903:858(European Pharmacopoeia,Fibrin sealant kit.1997;0903: 858)中详尽描述。
[0047] 术语"冷沉淀物"是指这样的血液组分，其通过由全血制备而成的冷冻血浆、复原 的血浆或通过血浆取出法采集的血浆而获得。当将冷冻血浆在寒冷条件下(通常在〇-4°C的 温度下）缓慢解冻，引起形成含有纤维蛋白原和因子XIII的析出物时，可获得冷沉淀物。可 例如通过离心收集析出物。
[0048]析出物可为来自FVIII制造过程的副产物且在本文被称为"FDC"，例如酸析出物、 冷却析出物、氢氧化铝析出物(参见例如美国专利4,455,300)、甘氨酸析出物(参见例如美 国专利4，297，344 )、乙醇析出物和肝素析出浆体。
[0049] 术语"副产物"是指通常在工业或生物处理的过程中，除了期望的物质/产品之外 产生或形成的非期望和/或非预期和/或无用的物质和/或残留物质。
[0050] 术语"析出物"和"析出的级分"可互换。
[0051] 在一个实施方案中，析出物为氢氧化铝析出物。有利地，当析出物包含氢氧化铝 时，该氢氧化铝连同某些蛋白酶可例如通过离心和/或过滤容易地从悬浮的析出物中去除。
[0052] 在本发明的一个实施方案中，浓缩纤维蛋白原制备物在用血浆源补充期间至少部 分地可溶、完全可溶或完全不可溶。
[0053] "完全可溶"意指100 %溶解的，例如没有任何固体颗粒。"部分可溶"意指小于 100%溶解，例如该浓缩纤维蛋白原析出物可被溶解约5%至小于100%。
[0054]在本发明的一个实施方案中，该浓缩纤维蛋白原制备物被溶解约50%至约95%。 [0055] "完全不可溶"意指100 %处于固体形式。
[0056] 如本文所述，该浓缩纤维蛋白原制备物和血衆源以约3:1至约1:3 (w/v、v/v或w/w) 或约2:1至约1: 2(w/v、v/v或w/w)或约1:1 (w/v、v/v或w/w)的比率混合。术语"w/v、v/v或w/ w"意指，浓缩纤维蛋白原制备物和血浆源可独立地为液体或固体。
[0057] 提供一种用于制造密封剂制剂的方法。该方法包括如下步骤:将浓缩纤维蛋白原 制备物与血浆源混合。
[0058] 密封剂制剂可包含一种或多种组分。
[0059] 密封剂可包含含有血浆补充的纤维蛋白原的一种组分和含有凝血酶的另一种组 分。
[0060] 另选地，密封剂可包含含有血浆补充的纤维蛋白原和凝血酶原的组分。
[0061 ]另外，在抑制聚合的情况下，例如低pH或通过将聚合抑制剂诸如GPRP包含在组合 物中，密封剂可包含含有血纤蛋白单体的组分。可例如通过将血浆补充的纤维蛋白原与偶 联到小珠的凝血酶接触并收集未结合级分，由血浆补充的纤维蛋白原制备血纤蛋白单体。
[0062] 在抑制纤维蛋白原聚合的情况下，纤维蛋白原、凝血酶和血浆可接触。
[0063] 血浆可用于稳定和/或添加重要血浆蛋白至包含血纤蛋白单体的液体密封剂制 剂。
[0064] 本文提供了包含血纤蛋白单体的血浆补充的液体密封剂制剂。本文还提供了一种 血浆补充的液体密封剂制剂，其包含:a)血纤蛋白单体;和b)可逆血纤蛋白聚合阻断剂。
[0065] 在一个实施方案中，可逆抑制剂涉及对血纤蛋白单体亲和力低并且对血纤蛋白聚 合或血纤蛋白凝块不具有永久性作用的抑制剂(例如GPRP肽）。因此，通常稀释和/或去除将 除去抑制作用。
[0066] 可逆血纤蛋白聚合抑制剂的示例包括但不限于GPRP肽、pH和核酸配体。
[0067] 如本文所用的术语"纤维蛋白单体"包括血纤蛋白单体、二聚体和/或具有多个血 纤蛋白单元的低聚体，使得血纤蛋白在选自由以下项组成的组的环境温度下在水性液体溶 液中呈可溶形式保持:约20 °C、21°C、22 °C、23 °C、24°C和25 °C。在一个实施方案中，低聚体含 有至多10个纤维蛋白单元。
[0068] 如本文所用的术语"血纤蛋白聚合物"包括具有多个血纤蛋白单元的多个血纤蛋 白单元，从而限制了血纤蛋白在选自由以下项组成的组的环境温度下在水性液体溶液中的 溶解度:约 20 °C、21°C、22 °C、23 °C、24 °C 和 25 °C。
[0069] 另外，本文提供了包含血纤蛋白单体的血浆补充的纤维蛋白原和/或血浆补充的 液体密封剂制剂，其可作为独立制剂施用至有需要的受试者。
[0070] 提供可施用至有需要的受试者的血纤蛋白密封剂制剂。
[0071] "血浆"和"血液血浆"可互换使用，且是指血液的血浆级分，其包含（尤其是）盐、 酶、免疫球蛋白（抗体）、血小板凝聚因子和蛋白质，该蛋白质包含白蛋白、因子VIII和纤维 蛋白原。"血浆源"可为这样的血浆，其来自分级混合血浆、冷冻混合血浆、复原的血浆和通 过血浆取出法收集的人血的流体部分的血浆。在一个实施方案中，血浆为凝血酶耗尽和/或 因子耗尽的血浆。
[0072] 血浆为血液的级分。未分级的血液不能看作在实例申请中限定的"血浆源"。
[0073] "凝血酶"或"凝血酶多肽"为哺乳动物的丝氨酸蛋白酶，此类酶由作为酶原前体的 凝血酶原（因子II)被另一种丝氨酸蛋白酶(因子Xa)裂解产生。凝血酶为血液凝固级联的部 分并且将纤维蛋白原转化成不溶解的血纤蛋白链，以及催化其它凝固相关的反应。在人中， 凝血酶原由F2基因编码，并且所得多肽在凝固级联中被蛋白溶解裂解以形成凝血酶。凝血 酶尤其用作若干止血产品中的活性组分。例如，血纤蛋白密封剂通常包含纤维蛋白原组分 和凝血酶组分。当两种组分混合时（例如当施用到出血创伤时），凝血酶裂解纤维蛋白原并 且血纤蛋白聚合物形成。
[0074] 对于长期储存，将纤维蛋白原制剂等分到无菌小瓶、安瓿或其它容器中，例如注射 器或其它施用器，然后将它们密封。在一个实施方案中，使用允许利用注射器穿过密封件去 除制剂的容器。根据药学或医疗装置领域的标准操作来标记容器。
[0075] 在另一方面，提供了一种试剂盒，其包含诸如安瓿、小瓶或注射器的容器，该容器 包含上文所公开纤维蛋白原制剂;任选地，试剂盒包括凝血酶组分和/或使用说明。试剂盒 可包括至少一个容器和至少一个标签。合适的容器包括例如安瓿、小瓶、注射器和试管。容 器可由例如玻璃、金属或塑料制成。在另选的方面提供了一种试剂盒，其包括带有浓缩纤维 蛋白原制备物的容器以及带有血浆的容器;任选地该试剂盒包括凝血酶组分和/或使用说 明。
[0076] "环境温度"为保存纤维蛋白原制剂的周围的温度。
[0077] 纤维蛋白原制剂可用作用来形成生物密封剂的纤维蛋白原组分。使用时，纤维蛋 白原制剂可根据单个患者的需要并且根据出血的严重性直接从容器使用。例如，纤维蛋白 原制剂可连同凝血酶制剂施用至出血组织以实现止血。另选地，纤维蛋白原制剂可用于单 组分密封剂制剂。在一个实施方案中，单组分密封剂制剂包括纤维蛋白原;和维生素 K-依赖 性血小板凝聚酶原，诸如因子II(FII)和因子X(FX)。
[0078] 根据本发明的制剂可以是液体、冷冻的或冻干的。
[0079] 本发明制剂的优点是多方面的，并且可为下列优点中的至少一个:增强稳定性、增 强例如在抗B19特异性抗体中富含的抗病毒活性，改进的愈合性质，和/或有效使用浓缩纤 维蛋白原副产物制备物作为另选的用于血纤蛋白密封剂的起始物质。
[0080] 血纤蛋白密封剂可由一种组分的制剂、双组分或更多组分的制剂形成。
[0081] "药学上可接受的载体或稀释剂"是指与制剂中的成分相容并且适用于与人和动 物的组织接触，而没有过量毒性、刺激、过敏反应或其它并发症、与合理的利益/风险比率相 称的试剂、化合物、材料、组合物、稀释剂。
[0082] "表面"为人们期望形成密封剂或胶的位置或方位。表面取决于密封剂的使用。密 封剂可用于例如止血、组织固定、移植物固定、创伤愈合和吻合。本文所公开的制剂、方法和 试剂盒可在内部或在外部用于在包括提供止血的血管外科手术中的组织和器官移植物固 定、用于密封外科创伤，以及用于吻合，诸如动脉、胃肠和气管吻合。
[0083] 如本文所用的术语"动物"包括哺乳动物和人类受试者。
[0084] 如本文所用的"受试者"包括哺乳类动物，包括人。在一些实施方案中，受试者为外 科患者或受伤患者。
[0085] "治疗有效量"意指这样的量，其提供血纤蛋白密封效果，例如在受试者上密封、愈 合和/或减少失血。
[0086] 来源于血液组分的生物材料通常被纯化掉感染性粒子以便最小化由血液传播的 病原体造成的潜在风险。纯化过程可通过纳米过滤、溶剂/洗涤剂（S/D)处理、热处理、γ或 UVC(〈280nm)照射或者通过在本领域已知的任何其它方法来进行。
[0087]术语"感染性粒子"是指可在生物有机体中感染或传播的微观粒子，诸如但不限于 微生物或朊病毒。感染性粒子可以是病毒粒子。可通过在纯化过程前和/或在纯化过程中将 钝化分子加入到溶液中进行传染性粒子的灭活过程。可通过重力作用、柱层析相分离法或 本领域已知的任何其它方法将所加的分子及其产物去除。可通过过滤或通过选择性吸收方 法，诸如亲和、离子交换或疏水层析，实施感染性粒子的去除。
[0088] 可进行多步骤病毒灭活程序。例如，通过结合以下方法中的两种或多种:溶剂/洗 涤剂处理、巴氏灭菌、选择性色谱法和纳米过滤。
[0089] 术语"病毒灭活"既指其中病毒保持在溶液中但呈现非活性(例如，通过将病毒的 脂质包膜溶解)的情况，和/或又指其中病毒物理上从溶液去除的情况(例如，通过尺寸排阻 技术)。
[0090] "溶剂/洗涤剂（S/D)处理"通常是指通过破坏其脂质包膜而使包膜或脂质包膜病 毒灭活的过程。该处理可通过添加洗涤剂(诸如Triton X-45、Triton X-100或吐温80)和溶 剂[诸如三(正丁基)磷酸酯（ΤηΒΡ)、二或三烷基磷酸酯]来进行。用于灭活脂质包膜病毒的 溶剂-洗涤剂组合可以是本领域已知的任何溶剂-洗涤剂组合，诸如ΤηΒΡ和Triton Χ-100; 吐温80和胆酸钠以及其它组合。所用的一种或多种溶剂和一种或多种洗涤剂的浓度可以是 本领域中常用的那些，例如，>〇·1%ΤηΒΡ和>0.1%Triton X-100。有时使用l%Triton X-100和0.3%TnBP的组合。通常，溶剂-洗涤剂灭活病毒所处的条件由以下条件组成：10mg/ ml-100mg/ml的溶剂-洗涤剂，5-8范围内的pH水平，以及2°C-37°C范围内的温度，持续30分 钟至24小时。然而，其它溶剂-洗涤剂组合和合适的条件将对本领域技术人员显而易见。在 S/D处理中使用的大量溶剂-洗涤剂可被去除，例如通过使用色谱柱诸如疏水相互作用色谱 柱(HIC)(例如，C-18二氧化硅填料材料)和SDR(溶剂-洗涤剂去除)HyperD;蛋白吸收基质诸 如离子交换基质；亲和性基质；油萃取和/或尺寸排阻基质而被去除。SDR HyperD有利地涉 及疏水相互作用的混合模式吸收并且与分子排阻作用相关联(Guerrier L等人，"Specific sorbent to remove solvent-detergent mixtures from virus-inactivated biological fluids"，色谱分析与生物医学应用期刊（J Chromatogr B Biomed Appl)， 1995年2月3日（1995Feb 3);664(1):119-125)。
[0091] "巴氏灭菌"通常是指热破坏脂质包膜和无包膜病毒两者的过程。"巴氏灭菌"可与 术语"加热灭活"或"热处理"互换。加热灭活可在约60 °C下进行约10小时。可在巴氏灭菌步 骤过程中将稳定剂诸如蔗糖和甘氨酸添加到溶液中。
[0092] "纳米过滤"通常是指这样的过程，通过该过程脂质包膜和无包膜病毒通过使用纳 米级过滤器，诸如 Planova? 15N、20N、35N 和 75N;Viresolve/70TM、Viresolve/180? 从溶液 中排除。过滤器可具有小于70nm，优选地介于15nm和50nm之间的孔尺寸。然而，具有足以从 样品中减少或消除病毒的孔尺寸的任何膜均可用于纳米过滤中。通过纳米过滤去除的病毒 可以为有包膜的病毒（例如HIV、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、西尼罗河病毒、细胞巨化 病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、单纯疱疹病毒(HSV))和无包膜病毒(例如甲肝病毒、 细小病毒B19、脊髓灰质炎病毒）。溶液可通过超滤处理而浓缩。超滤可在渗虑之后进行或在 渗虑之前进行以交换缓冲液。通过超滤和渗虑的浓度和渗析分别可在一个步骤中或作为两 个独立步骤进行。渗虑可针对适用于人体施用的任何溶剂或缓冲液而进行。
[0093] 以上或以下引用的专利申请、专利和出版物的公开内容在此均以引用方式并入。
[0094] 虽然下面的实施例展示了本发明的某些实施方案，但它们不应被理解为限制本发 明的范围，而应理解为有助于完整描述本发明。
[0095] 实施例
[0096] 材料和方法。
[0097] 因子VIII耗尽的冷沉淀物(FDC)的制备:
[0098] FVIII耗尽的冷沉淀物(FDC)为因子VIII (FVIII)制造过程的副产物。在制造过程 中，纤维蛋白原、纤连蛋白、因子XIII和蛋白酶诸如胞浆素和/或纤溶蛋白通过在低盐浓度、 温度范围14°c-18°c内的条件下添加乙醇而从悬浮的冷沉淀物中析出，之后进行离心。在离 心步骤之前，氢氧化铝[ai(oh) 3]在上述重悬期间添加，从而得到维生素 K依赖性凝结作用 因子诸如因子II、因子VII和因子X与氢氧化铝一起析出。氢氧化铝析出物（即，roc)从含有 的因子VIII的上清液中分离并且用于下述实验。
[0099] 如下制备FDC:血浆冷沉淀物基本上按照国际专利申请公布号W0 93/05822和W0 94/22503所述进行制备。
[0100] 简而言之，冷沉淀物由冷冻（-30 °C)人血浆制备，该人血浆在4 °C下解冻且去除上 清液。将该冷沉淀物保持在-30 °C直至使用。冷沉淀物在0 °C -4 °C下解冻并在10 °C -20 °C下重 悬在包含3IU/ml肝素钠(蛋白酶抑制剂）的双倍体积水中。使用稀释的乙酸将pH调节至7-8。 添加乙醇至1 %的最终浓度。使用稀释的乙酸将pH调节至6.8-7.2。将混合物在搅拌下冷却 至10°C-15°C的温度并且添加氢氧化铝（108g的2%铝胶溶液/lKg冷沉淀物），之后于17， 000g、14°C_18°C离心25min。去除上清液(包含因子VIII)并收集片状沉淀物。该析出物(片 状沉淀物），也称为ΠΧ：，包含(尤其是)纤维蛋白原、因子VIII、纤粘蛋白、胞浆素和/或纤溶 酶原、氢氧化铝和维生素 K依赖性凝结作用因子。片状沉淀物包含乙醇（~1%乙醇)且pH小 于7.2。片状沉淀物在-80°C下保存直至进一步处理。
[0101]该冷沉淀物(FDC)用作浓缩纤维蛋白原制备物的一个实施例。
[0102] 纤维蛋白原水平的确定:
[0103] 通过测试血小板凝聚的时间来确定纤维蛋白原的水平(Clauss方法）。
[0104] Clauss方法为欧洲药典测定法0903/1997的修改，基于该Clauss方法，其为评估所 测试样品的血小板凝聚时间的动态方法。在存在过量凝血酶的情况下使用1%纤维蛋白原 (酶研究(Enzyme Research))绘制了校准曲线，且从校准曲线计算了样品的纤维蛋白原浓 度。校准曲线被生成用于在8mg/100ml至32mg/100ml范围内的纤维蛋白原。所测试样品的结 果通过将结果乘以样品的稀释因子的纤维蛋白原进行报告，以mg/ml计：
[0105] 样品的纤维蛋白原(11^/1111)=(来自校准曲线的11^/10〇1111\稀释因子)/100。
[0106] 实施例1:从FDC获得的浓缩纤维蛋白原制备物的血浆补充。
[0107] 未补充的纤维蛋白原样品和血衆补充的纤维蛋白原样品如下制备：120ml和90ml 重悬缓冲液(〇. 7%NaCl、0.295%柠檬酸三钠 ，pH 7.4)分别在两个不同烧杯A和B中预热至 34°C。然后将7.5ml的2%铝胶[A1(0H)3]和2.25ml偶联至小珠的氨甲环酸(TEA)(其具体地 从FDC制备物去除血浆和/或纤溶酶原，如大体上在国际专利申请公布号W0 2013/001524中 所公开的）在连续搅拌下添加至每个烧杯中。将30ml混合的人血浆(冷冻混合血浆)添加至 烧杯B中的混合物。
[0108] FDC如下制备:80g冷冻roc通过使用共混机在2次20秒循环下机械地研磨成小片（〈 lcm)，在循环之间暂停20秒。在30°C_32°C温度于连续搅拌下将30g研磨的FDC添加至每个烧 杯(A和B)中。在样品B中FDC与血浆的比率为1:1 (w/v) 10分钟后，使用0.1M NaOH将混合物的 pH调节至7.2-7.3，并且使混合物在搅拌下于90分钟内溶解。一旦ΠΧ：在两个烧杯中均溶解， 就通过17,000g/25分钟离心来沉淀出非悬浮/不溶粒子。通过经1.2μπι过滤器过滤上清液而 使之澄清。澄清的上清液被补充至具有最终浓度ImM CaCl2和120mM甘氨酸，并且样品Α和样 品B(上清液)在<-30°C存放直到测定稳定性(实施例2)和抗B19抗体含量(实施例4)。样品A 和样品B中的纤维蛋白原浓度在15mg/ml至40mg/ml的范围内。
[0109] 实施例2:从FDC获得的血浆补充的浓缩纤维蛋白原制备物的稳定性。
[0110] 上面实施例1的未经补充的(A)纤维蛋白原样品和血浆补充的(B)纤维蛋白原样品 如下测试纤维蛋白原稳定性：
[0111] 样品在室温20°C_25°C下保存最多5天。使用Clauss方法评估纤维蛋白原的稳定性 (如上所述）。结果汇总在表1中。
[0112] 表1:血浆补充的纤维蛋白原和无血浆补充的纤维蛋白原的稳定性。
[0113]
[0114] 表1示出，血浆补充的样品(样品B)在该研究的5天内保持稳定，而平行的未经补充 的样品(样品A)示出不佳的稳定性。
[0115] 使用不同批次的roc及不同批次血浆的若干实验确认了该结果。
[0116]实施例3:从冷沉淀物获得的血浆补充的浓缩纤维蛋白原的稳定性。
[0117] 将血浆添加至从冷沉淀物获得的浓缩纤维蛋白原制备物以评估血浆对蛋白稳定 性的影响（例如，蛋白质水解的减少）。来源于冷沉淀物的浓缩纤维蛋白原制备物按如下步 骤制备:将冷沉淀物溶解，添加氢氧化铝，经受S/D处理，并通过油萃取和反相柱去除S/D物 质（如大体上在W0 93/05822和W0 94/22503中所述的）。在该实施例中，浓缩纤维蛋白原制 备物既不经受用于去除血浆/纤溶酶原的TEA也不经受蛋白酶抑制剂。收集来自两个批次的 浓缩纤维蛋白原制备物的样品（约30mg/ml)，并在37 °C (或保持冷冻)在添加或不添加血浆 下培养，并且使用SDS-PAGE测试蛋白完整性。所用的血浆是从供体通过血浆取出法收集的 血浆单元。稀释缓冲液的组合物为120mM NaCl; 10mM柠檬酸钠；120mM甘氨酸;95mM精氨酸盐 酸盐和ImM氯化|丐。
[0118] 浓缩纤维蛋白原制备物和血浆经解冻，并且随后用于以下四组中的每一组而制备 等分试样(4Χ200μ1):
[0119] I.37°C存储-100μΙ纤维蛋白原制备物+100μ1血浆。
[0120] II.37°C存储-100μΙ纤维蛋白原制备物+100μ1稀释缓冲液。
[0121] III.-80°C存储-100μΙ纤维蛋白原制备物+100μ1血浆。
[0122] IV._80°C存储-100μΙ纤维蛋白原制备物+100μ1稀释缓冲液。
[0123] 根据上述方案，样品在-80°C或在37°C下存储5天。在培养5天后，将来自四个组的 样品通过SDS-PAGE进行分析。
[0124] SDS-PAGE过程如下进行：
[0125] -升运行缓冲液通过用50ml MOPS运行缓冲液X20(美国生命科技公司（Life Technologies)，NP0001)稀释950ml DDW来制备。装样混合物的组成在表2中示出。
[0126] 表2:用于SDS-PAGE分析的样品组成。
[0127]
[0128] 1 Nupage样品缓冲液 X 4(英杰公司（Invitrogen)NP0007)。
[0129] 2 Nupage还原剂 X 10(英杰公司（Invitrogen)NP0007) 〇
[0130] 全部样品均在95°C加热5分钟，并离心。在每个泳道上凝胶(NuPAGE 12%Bis-Tris 凝胶，美国生命科技公司（Life Technologies)NP0314B0X)装载有10μ1经稀释的样品。在 200V跑胶40分钟。凝胶用DDW冲洗三次，且用Instant Imperial Protein Stain(赛默 (Thermo)，26145)染色至少1小时。用DDW冲洗进行褪色，且凝胶通宵干燥。SDS-PAGE的结果 在图1中示出。
[0131] 图1示出通过SDS-PAGE测定的多种浓缩纤维蛋白原样品的比较结果，所述样品是 未被补充(泳道2和泳道4)或者血衆补充的（泳道1和泳道3 )，并且在37 °C (泳道1和泳道2)或 在-80°C (泳道3和泳道4)保存5天。
[0132] 出人意料地，该结果示出，血浆的添加引起低分子量带的出现显著减少并且完整 纤维蛋白原带增加(参见图1，泳道lvs泳道2)。
[0133] 实施例4:在实施例1公开的血浆补充的纤维蛋白原中抗B19抗体的量化。
[0134] B19特异性抗体的量化使用细小病毒B19-IgG酶联免疫试剂盒(BI0TRIN)、用于检 测在人血清血浆中的IgG类细小病毒B19抗体的夹心酶联免疫分析进行。测定均根据制造商 的说明书来实施。样品A和样品B获得的结果汇总于表3中。
[0135] 表3:在所测试样品中的B19抗体。
[0136]
'[0137] 表3示出，虽然两个样品均具有抗B19抗体存在，但在由血浆补充的纤维蛋白原样 Βαπ (样品B)中抗B19抗体的量显著高于未经补充的样品（样品A)(4.8IU/ml对2.0IU/ml)。
[0138] 实施例5:血浆补充的纤维蛋白原的处理。
[0139] 实施例1的血浆补充的纤维蛋白原经处理（基本上如国际专利申请公布号W0 2013/001524中所述）以包括两个正交病毒灭活步骤，去除血浆和纤溶酶原、浓缩、制备和无 菌过滤。最终制剂包含50mg/ml-90mg/ml范围内的纤维蛋白原浓度。
[0140] 实施例6:作为血纤蛋白密封剂组分的血浆补充的纤维蛋白原制剂的体内评估。
[0141] 大鼠肾止血模型为测试止血的常见模型（Raccuia JS等人，美国外科杂志(Am J Surg.)，1992.163(2) :234-8,在大鼠肾脏模型中局部止血剂的可比较的功效(Comparative efficacy of topical hemostatic agents in a rat kidney model) 〇简而言之，将肾从 腹膜侧切开，并且围绕它放置垫片以吸收出血。将夹具置于供应肾的血管上，并且进行横向 切割穿过肾。包含血浆补充的纤维蛋白原组分(在实施例5中制备）的密封剂制剂和凝血酶 组分(在EVICEL凝血酶密封剂中的凝血酶组分）以1:1的比率使用。施用密封剂并且去除夹 具。评估一小时周期内的出血，之后对血的总量承重。随后，将制剂擦除，并使出血恢复并且 定量为低、中或高（以评价出血潜力是否仍然存在）。将所有大鼠以300IU肝素/kg动物重量 输注肝素以阻止自发止血。
[0142] 该结果示出，包含血浆补充的纤维蛋白原组分的血纤蛋白密封剂实现有效止血。
[0143] 虽然本文已描述了各种实施方案，但是可以对那些实施方案实施多种修改和变 型。另外，凡是公开了用于某些组分的材料的，均可使用其它材料。上述【具体实施方式】和下 述权利要求旨在涵盖所有这样的修改和变型。
[0144] 以引用方式全文或部分地并入本文的任何专利、公布或其它公开材料均仅在所并 入的材料不与本公开所述的现有定义、陈述或其它公开材料相冲突的范围内并入本文。因 此，并且在必要的程度下，本文明确阐述的公开内容取代以引用方式并入本文的任何冲突 材料。本申请中的任何参考文献的引用或鉴定不应解释为承认此类参考文献可用作本发明 的现有技术。
[0145] 节段标题在本文用于易于理解说明书并且不应理解为必要限制性的。
【主权项】
1. 一种制备纤维蛋白原制剂的方法，所述方法包括以下步骤： 将浓缩纤维蛋白原制备物和血浆源混合。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述浓缩纤维蛋白原制备物来源于血液或血液级 分。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述浓缩纤维蛋白原制备物中的所述纤维蛋白 原浓度在约l〇mg/ml至200mg/ml的范围内。4. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述浓缩纤维蛋白原制备物中的所述纤维蛋白 原浓度在约l〇mg/ml至150mg/ml的范围内。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述浓缩纤维蛋白原制备物为冷沉淀 物。6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述冷沉淀物为因子VIII耗尽的冷沉淀物。7. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述浓缩纤维蛋白原制备物和所述血 浆以约1:1的比率混合。8. -种血浆补充的纤维蛋白原制剂。9. 一种能够根据权利要求1至7中任一项所述的方法获得的纤维蛋白原制剂。10. 根据权利要求8或9所述的纤维蛋白原制剂，所述纤维蛋白原制剂用作血纤蛋白密 封剂的组分。11. 一种密封剂制剂，所述密封剂制剂包含血浆补充的纤维蛋白原。12. -种用于在表面制备密封剂的方法，所述方法包括将血浆补充的纤维蛋白原组分 和凝血酶组分施用至所述表面。13. -种密封剂制剂，所述密封剂制剂包含由血浆补充的纤维蛋白原制备的血纤蛋白 单体。14. 一种容器，所述容器包含根据权利要求8、9、11或13中任一项所述的制剂。15. -种试剂盒，所述试剂盒包括根据权利要求14所述的容器并任选地包括使用说明。16. -种在有需要的受试者上密封、愈合和/或减少失血的方法，所述方法包括向所述 受试者施用有效量的根据权利要求8、9、11或13中任一项所述的制剂。17. 根据权利要求16所述的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利 要求8、9或11中任一项所述的带有凝血酶制剂的制剂。18. -种血浆补充的制剂，所述血浆补充的制剂包含血纤蛋白单体。
【文档编号】A61L24/10GK106061519SQ201580010752
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2015年2月25日
【发明人】R.梅德勒, E.格里姆伯格, O.贝亚伊夫, Y.蒂尔曼, I.努, T.奥尔巴奇-内沃
【申请人】奥姆里克斯生物药品有限公司