含fk506类化合物/fkbp蛋白二聚体的药物组合物及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了含FK506类化合物/FKBP蛋白二聚体的药物组合物及其制备方法。本发明的含FK506类化合物/FKBP蛋白二聚体的药物组合物中FK506与hFKBP12a蛋白以物质的量比1:1的比例结合，溶剂为pH6～8的PBS缓冲液。本发明中FK506的内源性结合蛋白hFKBP12a蛋白与FK506形成的二聚体，可极大增强FK506在水溶液中的溶解性，从而增强FK506水溶液的药效和储存时间。
【专利说明】
含FK506类化合物/FKBP蛋白二聚体的药物组合物及其制备 方法
技术领域
[00011本发明属于生物医药技术领域，具体涉及含FK506类化合物/FKBP蛋白二聚体的药 物组合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 他克莫司（Tacro I imus)又名FK506，分子式为C44H69NO12，分子量为804，由日本藤泽 制药有限公司从筑波山的土壤的链霉菌属(Streptomyces tsukubaensis)中分离出的发酵 产物，其化学结构属23元大环内酯类抗生素。为一种强力的新型免疫抑制剂，主要通过抑制 白介素 -2(L-2)的释放，全面抑制T淋巴细胞的作用。其免疫抑制效果极强，较同类药物环孢 素 A(CsA)相比强100倍。近年来，作为肝、肾移植的一线用药，已在日本、美国等14个国家上 市。临床实验表明，其在心、肺、肠、骨髓等移植中应用有很好的疗效。同时FK506在治疗特应 性皮炎(AD)、系统性红斑狼疮(SLE)和免疫性眼病，如过敏性结膜炎、角膜移植等疾病中也 发挥着重要的作用。
[0003] FK506结构式如下：
[0004]
[0005] FK506目前临床上应用的剂型主要为口服胶囊、注射液、外用眼膏和滴眼液四种。 其中，滴眼液是治疗眼部疾病中最常用、最直接和最有效的方法。由于FK506在水溶液中溶 解性极差，估计最大溶解度低于1〇μΜ，严重影响其达到有效的药物浓度。此外，FK506水溶液 中稳定性差，容易发生异构化，转化为其他两种无免疫抑制功能的异构体。因此，提高FK506 在水中的溶解度和稳定性，进而提高其药效，一直是临床和基础研究中亟待解决的问题。
[0006] 人类FKBP12是一类具有脯氨酸异构酶活性的FK506内源性结合蛋白。hFKBP12可与 进入体内的FK506结合，形成FK506/FKBP12二聚体，该二聚体进而与钙调蛋白磷酸酶 (Calcineurin)结合，从而阻断免疫反应的发生。
【发明内容】
[0007] 本发明根据FK506/hFKBP12a蛋白二聚体在水溶液中具有极好的溶解性的特性，设 计和制备新型FK506的水溶液制剂，提供了一种含有FK506类化合物/FKBP蛋白二聚体的药 物组合物，其是利用药物-蛋白二聚体制备新型的FK506医用药剂，其中的FK506类化合物/ FKBP蛋白二聚体具有极好的溶解性，可解决目前单纯FK506水溶液制剂存在的如下缺点： 一、水溶液中溶解度低，FK506在水中最大溶解性低于ΙΟμΜ;二、稳定性差，易发生异构化，生 成两种无免疫抑制功能的分子。本发明的含有FK506类化合物/FKBP蛋白二聚体的药物组合 物可用于眼科及其他领域。
[0008] 一种药物组合物，含有FK506类化合物/FKBP蛋白二聚体和含水的液体赋形剂，所 述的FK506类化合物/FKBP蛋白二聚体是以FK506类化合物作为活性成分，以FKBP蛋白作为 载体，所述的 FK506类化合物为 FK506、EP184162、EP315978、EP323042、EP423714、EP427680、 W091/13889、TO91/19495、EP484936 或 EP532088;所述的 FKBP 蛋白为hFKBP12a 蛋白或其变 体、同系物或衍生物，所述的hFKBP12a蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。所述的 hFKBP12a蛋白的氨基酸序列C末端有His-tag、N末端有V5-tag。
[0009] FK506可被其他自然存在或人工合成的FK506类似物所代替，该FK506类似物可以 同hFKBP12a蛋白（或其他的可与FKB506相结合的FKBP同源蛋白）结合且具备相应的药理学 作用。FK506有许多衍生物、拮抗剂、激动剂与同型物都是已知的，它们具有FK506的基本结 构和至少一种生物学的性质。在许多专利中都叙述过这类化合物，例如EP184162、 EP315978、EP323042、EP423714、EP427680、TO91/13889、W091/19495、EP484936、EP532088 等;FK506和这些化合物一起称作FK506类化合物。
[0010] hFKBPl 2a蛋白可以被其他的可与FKB506 (或其他FK506类化合物）相结合的FKBP同 源蛋白所代替。本发明所采用的hFKBP12a蛋白可以通过多种人工和酶促的方法进行修饰和 改良，以提高其可溶性和在血浆中的生存期，并可改变其免疫原性。所述的改良包括但不仅 限于聚乙二醇化、乙酰化和甲基化。可以对hFKBP 12a蛋白结构中的FK506结合位点进行改良 和修饰，以提高或减弱FK506和hFKBP12a蛋白的结合力、加速或减慢FK506/hFKBP12a蛋白二 聚体中FK506的释放速度。本发明中，hFKBP12a蛋白、对其进行改良或修饰后得到的 hFKBPl 2a蛋白以及其变体、同系物或衍生物统称为FKBP蛋白。
[0011] 优选，所述的FK506类化合物为FK506，所述的FKBP蛋白为hFKBP12a蛋白，所述的含 水的液体赋形剂为PBS缓冲液，其pH为6~8,渗透压为260~320m0sm/L(不含钙镁离子）。
[0012 ] 优选，所述的FK506与hFKBP 12a蛋白的物质的量比为1:1~2。所述的药物组合物中 FK506与hFKBP12a蛋白以物质的量比1:1的比例结合，稍过量的hFKBP12a蛋白以确保绝大部 分的FK605同hFKBP12a蛋白相结合形成二聚体。
[0013 ]优选，所述的PBS缓冲液的pH为7 · 5。
[0014] 优选，所述的药物组合物还含有羧甲纤维素、甲基纤维素、羟丙甲纤维素、聚乙烯 醇、聚维酮、聚乙二醇、黄原胶、泊洛沙姆、卡波姆、玻璃酸钠和/或丙三醇作为增粘剂。
[0015] 优选，所述的药物组合物还含有硫柳汞和/或苯扎溴铵作为防腐剂和抑菌剂。
[0016] 所述的药物组合物的制备方法，包括以下步骤：
[0017] (1)将FK506溶于有机溶剂中，制备成FK506溶液；
[0018] (2)将hFKBP12a蛋白溶于pH6~8、渗透压为260~320πι〇8Π?/1的I3BS缓冲液中，制备 成hFKBP12a蛋白溶液，所述的hFKBP12a蛋白的氨基酸序列如SEQ ID Ν0.1所示；
[0019 ](3)使用步骤⑵制备的hFKBPl 2a蛋白溶液稀释步骤（1)制备的FK506溶液，控制混 合溶液中FK506与hFKBP12a蛋白的物质的量比为1:1~2，搅拌均匀，以形成?1(506/1^仙？12& 蛋白二聚体，由此得到FK506/hFKBPl 2a蛋白二聚体水溶液；
[0020] (4)去除FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液中的有机溶剂，得到的去除有机溶剂 的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液即为所要制备的药物组合物。
[0021] 所述的步骤(1)的有机溶剂为DMS0、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、乙酸乙酯或乙醚。
[0022] 所述的去除FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液中的有机溶剂，是采用离心机溶液 置换、透析或凝胶过滤层析的方法进行去除。
[0023] 本发明还提供所述的药物组合物用于制备免疫抑制剂中的用途。
[0024] 优选，所述的免疫抑制剂为滴眼液。
[0025]本发明还提供所述的药物组合物用于提高FK506在水溶液中的溶解度、提高FK506 药效、降低游离FK506的副作用中的用途。
[0026] 制备得到的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体也可通过结晶等方法进一步纯化。FK506/ hFKBP12a蛋白二聚体的分子构成和结构可以通过X射线晶体解析的技术进行检测和验证。 对于大规模批量生产而言，可抽取FK506/hFKBP12a蛋白二聚体的样本进行结晶，并通过X射 线晶体解析的技术检测FK506/hFKBPl 2a蛋白二聚体的分子构成和结构，以确保产品质量。 [0027] 上述步骤(3)和(4)制备的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体可以使用如PBS缓冲液在内 的其他医用缓冲液浓缩，以利于储备和进一步应用。
[0028]
【发明人】们发现，本发明的含有FK506类化合物/FKBP蛋白二聚体的药物组合物具有 以下优点：
[0029] (1)可以提高FK506在水溶液或其他医用FK506溶液中的溶解性。在角膜移植动物 模型中，我们成功配置的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液中FK506在水溶液中的溶解度 可以至少达到1〇〇μΜ，这将FK506在水溶液中的溶解度至少提高了 10倍；而根据我们使用 Nano dr ο ρ测定的hFKBP 12 a蛋白质储存液浓度的结果，理论上我们可以配制出浓度高达 1.58mM的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体溶液，这将FK506在水溶液中的溶解度提高了约158 倍。
[0030] (2)FK506同hFKBP12a蛋白结合后可以避免发生异构化，从而保持FK506结构的活 化状态；
[0031] (3)可以通过蛋白质结构工程学的方法来进一步改善药物配方，从而改变FK506/ hFKBP12a蛋白二聚体稳定性和其在血浆中的生存期；
[0032] (4)可以通过修饰和改变FKBP与FK506的结合位点，从而改变FK506/hFKBP12a蛋白 二聚体中FK506的释放动力学特性；
[0033] (5)可以通过蛋白融合工程学的方法改进剂型，以提高药物的在人体组织中的靶 向作用能力，如肿瘤组织等；
[0034] (6)基于热动平衡的原理，FK506/hFKBP12a蛋白二聚体可以同人体内源性FKBP进 行交换，以产生理想的药学作用。本发明揭示了FK506同hFKBP12a蛋白结合后，在细胞水平 和动物模型中都具有相应的药理学作用；而且较低浓度的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶 液（100μΜ)即可起到与市面上通用的较高浓度的FK506混悬液(质量分数0.05%，ΒΡ621.89μ Μ)相同或更好的抑制角膜植片免疫排斥反应的效果，还显著延长角膜植片生存期;此外，由 于FK506非常昂贵，FK506在药物中的使用浓度大大降低将极大的减少药物成本；
[0035] (7)由于FK506/hFKBP12a蛋白二聚体具有极强的亲和力，这使得最终溶液中游离 的FK506极少。同单纯的FK506的剂型相比，本发明可以极大程度地降低游离FK506的副作用 和不良反应。
【附图说明】
[0036] 图1为FK506/hFKBP12a蛋白二聚体在NFAT-GFP HeLa细胞系中免疫抑制图；其中 DMSO(上排左图）为DMSO(二甲基亚砜)处理组(DMS0终浓度为0.1%)，1(下排左图）为离子霉 素处理组（离子霉素终浓度为3μΜ)，FKBP (上排中图）为hFKBPl 2a蛋白水溶液处理组 (hFKBPl2a蛋白终浓度为1.2μΜ)，FKBP+I (下排中图）为hFKBPl 2a蛋白水溶液和离子霉素处 理组(hFKBP12a蛋白终浓度为1.2μΜ、离子霉素终浓度为3yM)，FK506+I(上排右图）为FK506 水溶液和离子霉素处理组(FK506终浓度为1.2μΜ、离子霉素终浓度为3μΜ)，FKBP+FK506+I (下排右图）为FK506/hFKBPl 2a蛋白二聚体水溶液和离子霉素处理组(FK506/hFKBPl 2a蛋白 二聚体终浓度为1.2μΜ、离子霉素终浓度为3μΜ)。
[0037]图2为术后第14日FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液在大鼠同种异体角膜移植模 型中抗免疫排斥反应的眼前段照相;Α:100μΜ FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液组;B:质 量分数0.05 % FK506混悬液组;C: PBS阴性对照组。
[0038] 图3为100μΜ FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液在大鼠同种异体角膜移植模型中 抗免疫排斥反应的生存分析图；1〇〇μΜ ?1(506/^0?、0.05%?1(506和？83分别表示10(^]\1 FK506/hFKBPl 2a蛋白二聚体水溶液组、质量分数0.05 % FK506混悬液组和PBS阴性对照组。 [0039]图4为使用Nanodrop测定hFKBP12a蛋白质储存液的浓度，A为中山眼科中心国家重 点实验室的美国Nanodrop超微量分光光度计(ND2000)，用于测定蛋白质、核酸和脱氧核酸 的浓度，具有高度灵敏性;B为测定hFKBP12a蛋白浓度的结果，浓度(mg/ml)C计算为所测得 的 A280/Abs，其中 hFKBPl 2a蛋白的 Abs 值为0.642。
【具体实施方式】
[0040]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0041 ]以下实施例中所用的实验仪器:德国Beckman超速离心机、美国奥豪斯分析天平 (DV114C)、美国Nanodrop超微量分光光度计(ND2000)、美国密理博3000MWC0蛋白质离心分 子筛（15ml，3kD)。
[0042]以下实施例中所用的药品来源:所用hFKBP12a蛋白来自北京康乐卫士生物公司， FK506来自美国Sigma公司、福建科瑞生物制药公司，DTT来自美国Sigma公司，DMSO来自美国 Sigma 公司，PBS(pH=7.5,渗透压 260-320m0sm/L)来自美国 Sigma 公司。
[0043]上述的来自北京康乐卫士生物公司的hFKBP12a蛋白是使用大肠埃希菌或者其他 真核细菌诱导和表达重组hFKBP12a蛋白（其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示），并利用已建 立的蛋白质纯化方法得到实验所需的高纯度的hFKBP12a蛋白。hFKBP12a蛋白的摩尔质量约 为12000g/mol，即12kD，C末端加入His-tag、N末端加入V5-tag后其分子量约为15.5kD。 [0044] 实施例1
[0045] FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液的制备方法如下：
[0046] (1)使用分析天平精密称取FK506粉末4mg溶解于0.2ml纯DMSO中，制备成20mg/ml (即约25mM)的FK5〇6的DMSO溶液；
[0047] (2)使用ρΗ7·5的I3BS缓冲液(渗透压320m0sm/L)将高纯度的hFKBP12a蛋白稀释制 备成0.1 mM的hFKBPl2a蛋白溶液；
[0048] (3)使用上述步骤(2)中的hFKBP12a蛋白溶液（50ml)缓慢稀释步骤（1)中的FK506 的DMSO溶液(0.2ml)，缓慢均匀搅拌，以形成FK506/hFKBP12a蛋白二聚体，由此得到50.2ml FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液。该FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液中FK506同 hFKBPl2a蛋白的摩尔比为I: I，FK506/hFKBP12a蛋白二聚体的终浓度为100μΜ。即将步骤（1) 中20mg/ml (即25mM)的FK506的DMSO溶液用步骤（2)中的0 · ImM的hFKBPl2a蛋白溶液稀释了 250倍，有机溶剂DMSO在该FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液中的体积比为0.4% (v/v)。有 机相中释放出来的FK506在稀释过程中会立即与hFKBP12a蛋白结合(Kd = 0.4nM)。即使在稀 释的ΙΟμΜ FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液中，高达99.99%的？1(506处在同1^仙？123蛋 白的结合状态；
[0049] (4)用ρΗ7·5的PBS缓冲液将50.2ml FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液稀释至 502ml，再使用15ml的分子筛离心管将该溶液浓缩至50.2ml (美国密理博3000MWC0蛋白质离 心分子筛，离心机参数:4000g，40min)。经过此步骤的处理，FK506/hFKBP12a蛋白二聚体溶 液中的有机溶剂DMSO得到去除。由此得到去除了有机溶剂的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水 溶液，可以用于储备或进一步应用。
[0050] 按上述过程制备出的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液使FK506的溶解性得到明 显提高。单纯FK506在水溶液中最大溶解度不足ΙΟμΜ，而参照本实施例中FK506/hFKBP12a蛋 白二聚体水溶液的制备方法制备得到的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液中FK506在水溶 液中的溶解度可以至少达到100μΜ，这将FK506在水溶液中的溶解度至少提高了 10倍;配制 较高浓度的hFKBP12a蛋白质储存液并使用Nanodrop测定（图4)，如图4Β中第18行结果所示， 储存液中hFKBP12a蛋白浓度可达2.44mg/ml (计算公式为C = A280/Abs = 1.567/0.642，Abs =0.642)，换算单位后（除以hFKBP12a蛋白的分子量15.5kD)约为1.58mM。因此，理论上我们 至少可配制浓度为1.58mM的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液，这将FK506在水溶液中的 溶解度提高了约158倍。
[0051 ] 此外，该FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液也在体内和体外实验中取得了良好的 免疫抑制效果。
[0052]在体外实验中，发明人通过使用NFAT-GFP的HeLa细胞系，验证了终浓度为1.2μΜ的 FK506/hFKBP12a蛋白二聚体可明显抑制Ca2+-Cn-NFAT免疫反应通路的激活。如图1所示，在 NFAT-GFP HeLa细胞系中，绿色荧光部位为NFAT存在的位置，如果绿色荧光存在于细胞浆 中，则未启动免疫反应。相反，如果细胞核为绿色，则表示NFAT进入细胞核引起免疫反应。如 图1所示，在加入离子霉素（Ionomycin，I)后（图1中I组），引起HeLa细胞的免疫反应，大量 NFAT进入细胞核使其呈现出绿色荧光;而在FK506+I组，由于FK506对Ca2+-Cn-NFAT信号通路 的抑制作用，绿色荧光标记的NFAT停留在细胞浆中；在FKBP+FK506+I组，实验结果与FK506+ I组相同，均在细胞浆中看到绿色荧光标记的NFAT。这表明在细胞水平，FK506/hFKBP12a蛋 白二聚体同FK506，可有效阻断Ca 2+-Cn-NFAT信号通路，从而抑制免疫反应的发生。
[0053] 在体内试验中，100μΜ浓度的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液可在同种异体大 鼠角膜移植模型中，30日内明显抑制角膜植片免疫排斥反应的发生，并且通过生存分析、病 理学和免疫学实验多方面证实了其效果。在图2，我们可以看到100μΜ FK506/hFKBPl2a蛋白 二聚体水溶液组（图2A)同质量分数0.05%FK506混悬液组（图2B)相同在术后第14日，角膜 透明、可清晰看到虹膜纹理、无明显水肿；角膜切片HE染色均表现为少量炎性细胞聚集、基 质层无明显肿胀、各层结果完整;在免疫组化实验中，与免疫反应密切相关的IL-2在角膜组 织中表达量较少。而PBS阴性对照组（图2C)则发生角膜排斥反应、出现角膜混浊、水肿，难以 辨认瞳孔轮廓；角膜切片HE染色可以清楚看到大量炎症细胞聚集，角膜基质层肿胀、断裂； 免疫组化实验可见角膜组织中表达大量的IL-2。这从形态学、病理学和免疫学三个层面证 实了 FK506/hFKBP12a蛋白二聚体在体内实验中抗角膜排斥反应的有效性。
[0054] 图3为三组大鼠角膜植片的生存曲线，100μΜ FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液 组和质量分数〇. 05 %FK506混悬液组角膜植片生存期均明显优于I3BS阴性对照组，并且100μ M FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液组的角膜植片生存期明显优于质量分数0.05 %FK506 混悬液组的角膜植片生存期，P<〇.05,具有统计学意义。
[0055] 实施例2
[0056] (1)使用分析天平精密称取FK506粉末3.22mg溶解于0.02ml无水乙醇中，制备成 161mg/ml (即约200mM)的FK506的乙醇溶液；
[0057] (2)使用ρΗ7·5的I3BS缓冲液(渗透压280m0sm/L)将高纯度的hFKBP12a蛋白稀释制 备成0.1 mM的hFKBPl2a蛋白溶液；
[0058] (3)使用上述步骤(2)中的hFKBP12a蛋白溶液(40ml)缓慢稀释步骤（1)中的FK506 的乙醇溶液（0.02ml)，缓慢均匀搅拌，以形成FK506/hFKBPl2a蛋白二聚体，由此得到40ml FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液。该FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液中FK506同 hFKBPl2a蛋白的摩尔比为I: I，FK506/hFKBP12a蛋白二聚体的终浓度为100μΜ。即将步骤（1) 中161mg/ml(即200mM)的FK506的乙醇溶液用步骤（2)中的O.lmM的hFKBP12a蛋白溶液稀释 了2000倍，有机溶剂乙醇在该FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液中的体积比为0.05% (v/ v)。有机相中释放出来的FK506在稀释过程中会立即与hFKBP12a蛋白结合(Kd = 0.4nM)。即 使在稀释的1〇μΜ FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液中，高达99.99%的？1(506处在同 hFKBPl2a蛋白的结合状态；
[0059] (4)用ρΗ7·5的PBS缓冲液将40ml FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液稀释至 400ml，再使用15ml的分子筛离心管将该溶液浓缩至40ml (美国密理博3000MWC0蛋白质离心 分子筛，离心机参数:4000g，40min)。经过此步骤的处理，FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶 液中的有机溶剂乙醇得到去除。由此得到去除了有机溶剂的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水 溶液，可以用于储备或进一步应用。
[0060] 实施例3
[0061 ] (1)使用分析天平精密称取FK506粉末3.3mg，并溶于0.05ml纯DMSO中，得到80mM的 FK506 的 DMSO 溶液。
[0062] (2)按照MFK5〇6:MhFKBPi2affi= 1:1 ·6的比例，用pH7 · 5的PBS缓冲液溶解hFKBP12a蛋白 制备0.2mM的hFKBP12a蛋白溶液32ml。
[0063] (3)将步骤（1)和步骤(2)中得到的溶液混合均匀以形成FK506/hFKBPl 2a蛋白二聚 体，由此得到FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液(其中FK506的浓度为0.125mM)。
[0064] (4)再使用 PBS 缓冲液(ρΗ=7·5,渗透压 260m0sm/L)将 32ml 的 FK506/hFKBP12a 蛋白 二聚体水溶液稀释至320ml，再使用15ml的分子筛离心管(离心机参数:4000g，40min)将该 溶液浓缩至32ml。由此得到去除了有机溶剂DMSO的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液。 [0065] (5)将得到的去除了有机溶剂DMSO的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液分装于洗 净灭菌的滴眼液瓶中，密封包装。
[0066] 实施例4
[0067] (1)使用分析天平精密称取FK506粉末3.3mg，并溶于0.05ml纯DMSO中，得到80mM的 FK506 的 DMSO 溶液。
[0068] (2)按照MFK5〇6:MhFKBPi2affi= 1:2的比例，用pH7 · 5的PBS缓冲液溶解hFKBP12a蛋白制 备0 · 25mM的 hFKBP12a蛋白溶液32ml。
[0069] (3)将步骤（1)和步骤(2)中得到的溶液混合均匀以形成FK506/hFKBPl 2a蛋白二聚 体，由此得到FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液(其中FK506的浓度为0.125mM)。
[0070] (4)再使用 PBS 缓冲液(ρΗ=7·5,渗透压 280m0sm/L)将 32ml 的 FK506/hFKBP12a 蛋白 二聚体水溶液稀释至320ml，再使用15ml的分子筛离心管(离心机参数:4000g，40min)将该 溶液浓缩至32ml。由此得到去除了有机溶剂DMSO的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液。 [0071] (5)在得到的去除了有机溶剂DMSO的FK506/hFKBPl 2a蛋白二聚体水溶液中加入 1.67g甲基纤维素，均匀搅拌直至溶解。
[0072] (6)然后将其分装于洗净灭菌的滴眼液瓶中，密封包装。
[0073] 实施例5
[0074] (1)使用分析天平精密称取FK506粉末3.3mg，并溶于0.05ml纯DMSO中，得到80mM的 FK506 的 DMSO 溶液。
[0075] (2)按照MFK5〇6:MhFKBPi2affi= 1:1 ·6的比例，用pH7 · 5的PBS缓冲液溶解hFKBP12a蛋白 制备0.2mM的hFKBP12a蛋白溶液32ml。
[0076] (3)将步骤（1)和步骤(2)中得到的溶液混合均匀以形成FK506/hFKBPl 2a蛋白二聚 体，由此得到FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液(其中FK506的浓度为0.125mM)。
[0077] (4)再使用 PBS 缓冲液(ρΗ=7·5,渗透压 280m0sm/L)将 32ml 的 FK506/hFKBP12a 蛋白 二聚体水溶液稀释至320ml，再使用15ml的分子筛离心管(离心机参数:4000g，40min)将该 溶液浓缩至32ml。由此得到去除了有机溶剂DMSO的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液。 [0078] (5)在得到的去除了有机溶剂DMSO的FK506/hFKBPl 2a蛋白二聚体水溶液中加入 1.0 g羟丙甲纤维素，均匀搅拌直至溶解。
[0079] (6)然后在该溶液中加入硫柳汞0.004g，混匀。
[0080] (7)再将其分装于洗净灭菌的滴眼液瓶中，密封包装。
[0081]虽然上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本 发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种药物组合物，其特征在于，含有FK506类化合物/FKBP蛋白二聚体和含水的液体 赋形剂，所述的FK506类化合物/FKBP蛋白二聚体是以FK506类化合物作为活性成分，以FKBP 蛋白作为载体，所述的 FK506 类化合物为 FK506、EP184162、EP315978、EP323042、EP423714、 EP427680、W091/13889、W091/19495、EP484936或EP532088;所述的FKBP蛋白为hFKBP12a蛋 白或其变体、同系物或衍生物，所述的hFKBP12a蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。2. 根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的FK506类化合物为FK506,所 述的FKBP蛋白为hFKBPl 2a蛋白，所述的含水的液体赋形剂为roS缓冲液，其pH为6~8，渗透 压为 260 ~320m0sm/L。3. 根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述的FK506与hFKBP12a蛋白的物 质的量比为1:1~2。4. 根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的PBS缓冲液的pH为7.5。5. 根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物还含有羧甲纤维 素、甲基纤维素、羟丙甲纤维素、聚乙烯醇、聚维酮、聚乙二醇、黄原胶、泊洛沙姆、卡波姆、玻 璃酸钠和/或丙三醇作为增粘剂，还含有硫柳汞和/或苯扎溴铵作为防腐剂和抑菌剂。6. 权利要求3所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 将FK506溶于有机溶剂中，制备成FK506溶液； (2) 将hFKBP12a蛋白溶于pH6~8、渗透压为260~320m0sm/L的PBS缓冲液中，制备成 hFKBP12a蛋白溶液，所述的hFKBP12a蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示； (3) 使用步骤(2)制备的hFKBP 12a蛋白溶液稀释步骤（1)制备的FK506溶液，控制混合溶 液中FK506与hFKBP12a蛋白的物质的量比为1:1~2,搅拌均匀，以形成FK506/hFKBP12a蛋白 二聚体，由此得到FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液； (4) 去除FK506/hFKBP 12a蛋白二聚体水溶液中的有机溶剂，得到的去除有机溶剂的 FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液即为所要制备的药物组合物。7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)的有机溶剂为DMSO、甲 醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、乙酸乙酯或乙醚;所述的步骤(4)的去除FK506/hFKBP 12a蛋白二 聚体水溶液中的有机溶剂，是采用离心机溶液置换、透析或凝胶过滤层析的方法进行去除。8. 权利要求1所述的药物组合物用于制备免疫抑制剂中的用途。9. 根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的免疫抑制剂为滴眼液。10. 权利要求1所述的药物组合物用于提高FK506在水溶液中的溶解度、提高FK506药 效、降低游离FK506的副作用中的用途。
【文档编号】A61K47/42GK106074367SQ201610576947
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月20日 公开号201610576947.6, CN 106074367 A, CN 106074367A, CN 201610576947, CN-A-106074367, CN106074367 A, CN106074367A, CN201610576947, CN201610576947.6
【发明人】陈伟蓉, 陈林, 林浩添, 刘奕志
【申请人】中山大学中山眼科中心