含有与水不溶性底物结合的取代枯草杆菌蛋白酶的个人护理组合物的制作方法

专利名称：含有与水不溶性底物结合的取代枯草杆菌蛋白酶的个人护理组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有与擦拭底物结合的单一取代枯草杆菌蛋白酶的个人护理组合物。所述个人护理组合物的实施方案包括个人护理用擦物和个人护肤用遮盖剂。本发明的组合物提供改进的清洁和皮肤调理作用，这归因于活性蛋白的活性，同时减小了使用者对活性蛋白产生变应性反应的危险性。
背景技术：
越来越多的含活性蛋白的市售产品为人们采用。绝大多数此类产品使用了酶作为活性蛋白质。酶是与化合物或底物反应使该化合物分解的蛋白质。基于与其反应的底物的种类，酶被分为多种类型。各种酶一般可催化不同化学键的断裂，产生特异性选择的活性。已知脂肪酶能够水解在烃类和多元醇主链底物之间生成的(但不限于此)酯键。这些底物的实例是甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯聚甘油酯。蛋白酶类的酶能够水解蛋白。将天然和生物工程的蛋白酶掺混在家用清洁洗涤剂中可用来水解蛋白类灰尘和污渍，混合在个人护理产品中用来除去污物和死皮，混合在口腔清洁产品中用来去除口腔中的牙斑，而且可混合在药物中用来影响体内的有害蛋白质。
公认在普通市售清洁产品中掺入蛋白酶可以使产品更加有效。美国专利号4261868(Hora等人)、美国专利号4404115(Tai)、美国专利号4318818(Letton等人)、欧洲专利申请130756(1985.1.9公开)和美国专利5030378(Venegas)都公开了蛋白酶在清洁或洗涤产品中的应用。
然而，人们还认识到，许多包括酶在内的活性蛋白是潜在抗原，而抗原在人体中的某些条件下可引起变态反应。人体免疫系统可在暴露于活性蛋白时产生特异性抗体。当临床上获得有益应答时这种产生特异性抗体的过程被称作“免疫”。但是，当这样的反应导致过敏症时，其被称作“致敏”。已在人体定期暴露于蛋白的环境中观察到对活性蛋白的变态反应。所述环境包括制造厂，工人可能暴露在未受控制的、含有活性蛋白的尘土或悬浮微粒；或市场，在那里消费者反复使用含有活性蛋白的产品；有时会引起变态反应。
目前，通过限制那些用于人体的产品中所选择的蛋白可以减少对活性蛋白的变态反应。虽然这种途径可以减少变应原性问题，但是无法彻底解决该问题，因为常常无法发现具有预期活性的活性蛋白。
减少变态反应的另一方法是减小蛋白分子的大小(参见日本专利公开号4112753)。然而，减小蛋白的大小也可能导致生物活性明显降低。
减小变应原性的第三种建议是通过表位作图并且改变蛋白氨基酸序列，从而释放出具有低变应原性的蛋白。这种方法一般需要花费大量的研制时间和费用。
在医药领域，人们建议通过另一种方法减小蛋白的免疫原性。这种方法包括将非反应性聚合物附着在蛋白上。美国专利号4179337(Davis等人)涉及了偶联于基本上直链的聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)聚合物部分的酶。虽然发现PEG/PPG的偶联缓和了酶的变应原性，但仅仅保留下15％的生理活性。PCT申请WO 96/17929(Olsen等人，1996.6.13公开)涉及通过与适当聚合物接合的酶的改性。Olsen的专利中请描述了改性酶，证明这些酶与亲代酶相比变应原性减小了25％至66％，而保留了亲代活性的39％至100％。
美国专利申请序号08/903298公开了通过加入双生(twin)聚乙二醇聚合物部分改性的酶的应用，从而减小变应原性并且传递高的酶活性。其中改性酶与纤维性底物结合用于擦拭用途。改性酶不附着在底物上。经改性的酶减小了变应原性。
美国专利申请序列号09/088912公开了在三个特异性表位区的一个或多个区中枯草杆菌蛋白酶的聚合物化学改性，发现由此可掩蔽该酶的免疫原决定因素。
另一种减小活性蛋白的变应原性的途径是通过制粒、涂层或溶解活性蛋白来避免它们在空中传播。美国专利4556554(Calvo)公开了含有酶的化妆品组合物，其中通过附着在聚合物载体的颗粒上所述酶得到固定。附着酶的颗粒被分散在化妆品赋形剂中。在将该赋形剂涂敷在皮肤上时，载体释放出酶并且该酶被再次激活。例如这样的方法令使用者暴露于空气传播的蛋白，然而它们仍然存在与大范围组织和所释放酶(这些酶沉积在皮肤上)相接触有关的严重危险性。
加拿大专利1229808(1987年12月1日授权)教导了将酶，尤其是β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶固定在纤维素底物上，其中通过吸附在琼脂糖胶涂层的底物内使酶得到固定。
UK专利申请GB2240040(1991.7.24公开)也教导将酶固定在底物上。酶共价结合在底物上，提供一种含药敷料。
通过应用酶在仪器表面的位点特异性附着可增强生物仪器如生物传感器、生物分离器和生物反应器中所用酶的活性。参见黄等人，“通过位点特异性附着于表面改进固定枯草杆菌蛋白酶的活性”分析化学(Analytieal Chemistry),69(22),1997.11.15。黄提出枯草杆菌蛋白酶经突变的丝氨酸249或丝氨酸145固定于半胱氨酸并且结合在用氨基官能化的二氧化硅珠上。
人们非常希望开发出一种可提供高水平蛋白活性而在暴露于活性蛋白时维持低变应原性反应的组合物。如果能够实现，将可以为使用者提供更加安全的途径来利用蛋白技术的益处。
本发明的目的是提供一种擦拭组合物，所述组合物能提供这种改进的活性，同时维持对免疫系统的低刺激和所得活性。
发明概述本发明涉及含有水不溶性底物、多种单一取代的枯草杆菌蛋白酶BPN’酶变种和结合方式的组合物，各个酶永久性固着在底物上，其中该个人护理组合物在底物上含有约0.01μg/cm2至约1000μg/cm2的所述酶。
发明详述本发明的个人护理组合物含有通过半胱氨酸氨基酸基团的单一取代改性的枯草杆菌蛋白酶BPN’酶及其衍生物，它们永久性结合在水不溶性底物上。所述组合物提供一种方便的方式来利用枯草杆菌蛋白酶BPN’酶及其衍生物的特定活性，其中所述酶结合在底物上，由此尽量减小任何变态反应的危险性。组合物的优选实施方案非常有效地清洁皮肤上的汗渍、皮脂、死皮细胞、脂肪和油分，并使皮肤增湿。
不受理论的限制，相信所述酶通过永久性与底物结合，可以令它们与皮肤接触，使它们在表面起作用。随后当擦物或遮盖剂移走时，全部酶离开皮肤表面，与使用的擦物一起除去并且弃掉，由此减小烟雾状散开和长时间皮肤暴露的危险性。活性蛋白与化合物反应，在与皮肤接触的一段时间内它具有特异的反应性，并且在使用后不会滞留在皮肤上刺激免疫系统并且进而形成引起变态反应的抗体。
在此所用的术语“氨基酸序列”是指构成蛋白的氨基酸的特异构型。下面是本文描述氨基酸的缩写目录。氨基酸 三字母缩写单字母代号丙氨酸AlaA精氨酸ArgR天门冬酰胺AsnN天门冬氨酸AspD半胱氨酸 CysC谷氨酰胺 GlnQ谷氨酸GluQ甘氨酸GlyG组氨酸HisH异亮氨酸 IleI亮氨酸LeuL赖氨酸LysK甲硫氨酸 MetM苯丙氨酸 PheF脯氨酸ProP丝氨酸SerS苏氨酸ThrT色氨酸TrpW酪氨酸TyrY缬氨酸ValV在位置上无氨基酸 Xaa*
此处所用的术语“突变”是指生物的遗传变异，其改变了生物所产生的酶的氨基酸序列。常常发现生物的突变改变了酶的性质。
此处所用的术语“野生型”是指由未突变宿主产生的酶。
此处所用的术语“变种”是指具有不同于野生型酶的氨基酸序列的酶，这归因于产生此类酶的宿主的遗传突变。
除非另外说明，此处所用的所有百分比和比例是以重量计，并且所有的测量是在25℃下进行，除非另外指出。本发明可以含有这里描述的基本组分以及选择性组分和成分，或由或基本上由基本组分以及选择性组分和成分组成。
本发明的个人护理组合物的基本组分以及优选和任选成分的非排他性目录详述如下。水不溶性底物本发明的产物含有水不溶性底物。所谓“水不溶性”是指底物浸渍于水中时不溶于水或不容易分裂开。水不溶性底物是将本发明活性蛋白输送到待清洁和增湿的皮肤上并且除去皮肤上的基本上所有的蛋白的工具或载体。
许多材料可用作底物。下列非限定特征是理想的(ⅰ)足够使用的湿强度，(ⅱ)足够的磨蚀度，(ⅲ)足够的回弹力和孔隙度，(ⅳ)足够的厚度，和(ⅴ)适当的尺寸。
符合上述标准的适当不溶性底物的非限定实例包括无纺底物、纺织底物、水力缠结(hydroentaugled)底物、气缠结(air entangled)底物、天然海绵、合成海绵、聚合物网状筛等。优选的实施方案采用无纺底物，因为它们在众多材料中经济且易于获得。无纺是指层由纤维构成，这些纤维不是纺成织物而是形成薄片、垫或衬层。纤维可以是随机的(即随机排列)，或可以将它们梳理(即梳理为基本上在一个方向取向)。此外，无纺底物可以由随机和梳理纤维层的组合形式构成。
无纺底物可以由各种天然和合成的材料构成。天然材料是指由植物、动物、昆虫或植物、动物和昆虫的副产物获得的材料。合成材料是指主要由各种人造材料或由已经进一步改造的天然材料获得的材料。常规的基本原材料一般是纤维网状物，其中含有任何常见的合成或天然纺织品长度的纤维或其混合物。
适用于本发明的天然材料的非限定例是丝纤维，角蛋白纤维和纤维素纤维。角蛋白纤维的非限定例包括选自羊毛纤维、骆驼毛纤维等的那些。纤维素纤维的非限定例包括选自木浆纤维、棉纤维、大麻纤维、黄麻纤维、亚麻纤维和它们的混合物的纤维。
适用于本发明的合成材料的非限定例包括选自醋酸纤维、丙烯酸类纤维、纤维素酯纤维、改性聚丙烯腈纤维、聚酰胺纤维、聚酯纤维、聚烯烃纤维、聚乙烯醇纤维、人造丝纤维、聚氨酯泡沫及其混合物的那些。这些合成材料的一些实例包括丙烯酸类，例如阿克利纶、克丽斯纶，和基于丙烯腈的纤维，奥纶；纤维素酯纤维，例如醋酸纤维素、阿尼尔和阿西尔；聚酰胺类如尼龙(如尼龙6、尼龙66、尼龙610等)；聚酯类如福特勒尔，科代尔，和聚对苯二甲酸乙二酯纤维，大可纶；聚烯烃类如聚丙烯，聚乙烯；聚乙酸乙烯酯纤维；聚氨酯泡沫和它们的混合物。这些和其它适用的纤维和由它们制备的无纺材料全面公开在Riedel的“无纺结合方法和材料”无纺世界(Nonwoven World)(1987)；美国百科全书(The Encyclopedia Americana)第11卷，147-153页和第26卷，566-581页(1984)；美国专利号4891227(Thaman等人，1990.1.2授权)；和美国专利号4891228，它们在此全文引入作为参考。
由天然材料制备的无纺底物包括网状物或薄片，它们最常见是由纤维的液态悬浮体在细丝筛网上形成。参见C.A.Hampel等人《化学大全》(The Encyclopedia of Chemistry)第3版，1973,793-795页(1973)；美国百科全书，第21卷，376-383(1984)；和G.A.Smook，《纸浆和纸张技术手册》(Handbook of Pulp and Paper Technologies)，纸浆和造纸工业技术协会(1986)；它们在此全文引入作为参考。
适用于本发明的由天然材料制备的底物可以由多种市售来源获得。适用于本发明的市售纸层的非限定例包括Airtex，一种压花气流成网纤维素层，其织物单位重量约为71gsy，购自James River,Green Bay,WI；和Walkisoft，一种压花气流成网纤维素层，织物单位重量约为75gsy,购自Walkisoft U.S.A.(Mount Holly,NC)。
制备无纺底物的方法是所属领域公知的。通常，这些无纺底物可以通过气流成网法、湿法成网(water-laying)、熔喷法、共成法(coforming)、纺粘法或梳理法制备，其中纤维或长丝首先从长缕切割为预期长度，通入水或气流中，随后沉积在筛网上，负载纤维的空气或水经该筛网流过。无论其制备方法或组成如何，所得的层然后进行数种粘合操作的至少一种，使单独的纤维固定在一起形成自持网状物。在本发明中，无纺层可以通过许多方法制备，包括水力缠结法(hydroentanglement)，热粘合，和这些方法的联合形式。此外，本发明的底物可包括单层或多层。而且，多层底物可以包括薄膜和其它非纤维材料。
适用于本发明的由合成材料制备的无纺底物也可以由多种市售来源获得。适用于本发明的无纺层材料的非限定例包括HEF 40-047，一种有孔水力缠结材料，它含有约50％人造丝和50％聚酯，并且织物单位重量为约43克/平方码(gsy)，购自Veratec,Inc.,Walpole,MA；HEF 140-102，一种有孔水力缠结材料，含有约50％人造丝和50％聚酯，并且织物单位重量约为56gsy，购自Veratec,Inc.(Walpole,MA)；Novonet149-616，一种热粘网格花纹材料，含有约100％聚丙烯，并且织物单位重量为约50gsy，购自Veratec,Inc.(Walpole,MA)；Novonet149-801，一种热粘网格花纹材料，含有约69％人造丝、约25％聚丙烯和约6％棉，并且织物单位重量约为75gsy，购自Veratec,Inc.(Walpole,MA)；Novonet149-191，一种热粘网格花纹材料，含有约69％人造丝、约25％聚丙烯和约6％棉，并且织物单位重量约为100gsy，购自Veratec,Inc.(Walpole,MA)；HEF Nubtex149-801，一种结节有孔水力缠结材料，含有约100％聚酯，并且织物单位重量约为70gsy，购自Veratec,Inc.,Walpole,MA；Keybak951V，一种干法成形的有孔材料，含有约75％人造丝、约25％丙烯酸类纤维，并且织物单位重量约43gsy，购自Chicopee,New Brunswick.NJ；Keybak1368，一种有孔材料，含有约75％人造丝、约25％聚酯，并且织物单位重量约39gsy，购自Chicopee,New Brunswick.NJ；Duralace1236，一种有孔、水力缠结材料，含有约100％人造丝，并且织物单位重量约40gsy-约115gsy，购自Chicopee,New Brunswick.NJ；Duralace5904，一种有孔、水力缠结材料，含有约100％聚酯，并且织物单位重量约40gsy-约115gsy，购自Chicopee,New Brunswick.NJ；Sontaro 8868，一种水力缠结材料，含有约50％纤维素和约50％聚酯，并且织物单位重量约60gsy，购自Dupont Chemical Corp.。
此外，水不溶性底物可以是聚合物网状海绵，如欧洲专利号EP 702550A1(公开于1996年3月27日)所描述的，在此全文引入作为参考。聚合物海绵含有许多挤出管状结网的叠层，该挤出管状结网是由柔性很强的聚合物制成，例如烯烃单体的加成聚合物和多元羧酸的聚酰胺。虽然这些聚合物海绵被设计用来与液体清洗剂合用，此类海绵可以在本发明中作为水不溶性底物使用。
底物可以制成多种形状和形式，包括扁平垫，厚垫，薄片，球形工具，不规则形状工具，并且其大小从表面积约一平方英寸至约数百平方英寸。精确尺寸取决于预期的用途和产品特性。特别方便的是正方形、圆形、矩形或椭圆形垫子，其表面积是约1平方英寸至约144平方英寸，优选约10平方英寸至约120平方英寸，更优选约30平方英寸至约80平方英寸；并且厚度是约1密耳(mil)至约500密耳，优选约5密耳至约250密耳，更优选约10密耳至约100密耳。
本发明的水不溶性底物可以包含两个或多个层，各层具有不同的质地和磨蚀性，不同的质地可能是由于采用不同材料的组合形式或采用不同的制造方法或它们的结合造成的。可以制造双质地底物来提供较粗糙侧用于剥落和较柔软吸收侧用于温和清洁的效果。此外，底物的各层可以制成具有不同的颜色，由此有助于使用者进一步区分表面。单一取代的枯草杆菌蛋白酶BPN’酶-“蛋白酶G”本发明的基本成分是多种单一取代的枯草杆菌蛋白酶BPN’酶(下文称作蛋白酶G)。蛋白酶G在水不溶性底物表面上以约0.01μg/cm2至约1000μg/cm2，优选约0.05μg/cm2至约100μg/cm2，首选约0.1μg/cm2至约10μg/cm2浓度存在。
根据国际生物化学和分子生物学联合会(IUBMB)的推荐(1992)，通常蛋白酶被分类为酶分类号E.C.3.4.(羧酸酯水解酶)。有关蛋白酶还描述在PCT公开中WO 95/30010(Procter & Gamble公司，在1995.11.9公开)；WO 95/30011(由Procter & Gamble公司，在1995.11.9公开)；WO95/29979(由Procter & Gamble公司，在1995.11.9公开)。
枯草杆菌蛋白酶是由微生物嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、解糖芽孢杆菌(Bacillus amylosaccharicus)、地衣形芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌天然产生的蛋白酶。一种已知枯草杆菌蛋白酶是BPN’。由解淀粉芽孢杆菌产生的野生型BPN’的氨基酸序列特征是1 10 20Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln lle Lys Ala Pro Ala Leu His Ser Gln Gly30 40Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val lle Asp Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro50 60Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Ash Pro Phe Gln Asp70 80Ash Asn Ser His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly90 100Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly110 120Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asa Gly Ile Glu Trp Ala Ile Ala Ash Ash Met Asp130 140Val Ile Ash Met Ser Leu Gly Gly Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp150 160Lys Ala Val Ala Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Ash Glu Gly Thr Ser Gly170 180Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val190 200Asp Ser Ser Ash Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala210 220Pro Gly Val Ser lle Gln Ser Thr Leu Pro Gly Ash Lys Tyr Gly Ala Tyr Ash Gly Thr230 240Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Ash250 260Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Ash Thr Thr Thr Lys Leu Gly Asp Ser270 275Phc Tyr Tyr Gly Lys Lys Gly Leu Ilc Asn Ash Val Gln Ala Ala Ala GlnBPN’的若干变种也是已知的。下文均称作“蛋白酶A”的若干相关变种公开在美国专利5030378(1991.7.9授与Venegas)中，其特征在于所述BPN’氨基酸序列具有下列突变a)Gly 166位的Gly被Asn,Ser,Lys,Arg,His,Gln,Ala或Glu代替；Gly 169位的Gly被Ser代替；Met 222位的Met被Gln,Phe,Cys,His,Asn,Glu,Ala或Thr代替；或b)Gly 166位的Gly被Lys代替并且Met 222位的Met被Cys代替；或c)Gly 160位的Gly被Ala代替并且Met 222位的Met被Ala代替。下文称作“蛋白酶B”的BPN’的其它变种公开在Genencor International,Inc.(San Francisco,California)的欧洲专利EP-B-251446(1994.12.28授权，公开在1988.1.7)，其特征在于野生型BPN’氨基酸在一个或多个下列氨基酸中具有突变Tyr21,Thr22,Ser24,Asp36,Ala45,Ala48,Ser49,Met50,His67,Ser87,Lys94,Val95,Gly97,Ser101,Gly102,Gly103,Ile107,Gly110,Met124,Gly127,Gly128,Pro129,Leu135,Lys170,Tyr171,Pro172,Asp197,Met199,Ser204,Lys213,Tyr214,Gly215,和Ser221；或两种或多种上述氨基酸和Asp32,Ser33,Tyr104,Ala152,Asn155,Glu156,Gly166,Gly169,Phe189,Tyr217和Met222，其中突变均不发生在Asp32,Ser33,Tyr104,Ala152,Asn155,Glu156,Gly166,Gly169,Phe189,Tyr217和Met222氨基酸上。
另一种下文称作“蛋白酶D”的另一BPN’变种蛋白酶描述在WO95/10615中(Genencor International,公开于1995.4.20)，其特征在于野生型BPN’氨基酸在Asn76位具有突变，同时在一个或多个选自下列的其它氨基酸位点具有突变Asp99,Ser101,Gln103,Tyr104,Ser105,Ile107,Asn109,Asn123,Leu126,Gly127,Gly128,Leu135,Glu156,Gly166,Glu195,Asp197,Ser204,Gln206,Pro210,Ala216,Tyr217,Asn218,Met222,Ser260,Lys265,和/或Ala274.
另一种下文称作“蛋白酶F”的BPN’变种蛋白酶描述在美国专利号4760025(1988.7.26授权给Estell等人)，其特征在于野生型BPN’氨基酸在一个或多个选自下列的氨基酸位点具有突变Asp32,Ser33,His64,Tyr104,Asn155,Glu156,Gly166,Gly169,Phe189,Tyr217和Met222。
本发明个人护理组合物中所用的酶，蛋白酶G，含有上述任何在氨基酸序列中具有单一取代或插入的半胱氨酸的BPN’酶及其变体。半胱氨酸对于预期表位区的取代而言是首选取代氨基酸，因为它不存在于野生型枯草杆菌蛋白酶BPN’或其衍生物中。取代或插入的氨基酸提供了适合将本发明底物附着在酶中特定位点的部分。
上述取代或插入优选应发生在表位区中的位置，该位置为远离该蛋白活性位点的蛋白中的点。在枯草杆菌蛋白酶BPN’及其衍生物中，这个活性位点是由三元组Asn32,His64和Ser221的空间三联体确定。在蛋白酶G类酶中，半胱氨酸在远离三联体的位点发生取代。用于取代的优选表位区是Asp140-Val150和Ala230-Leu250区。可能的半胱氨酸取代的非限定例是在Ser145,Asn240或Ser249。半胱氨酸对于预期表位区中的取代是首选的取代氨基酸，因为它不存在于野生型枯草杆菌蛋白酶BPN’或其衍生物中。结合方式活性蛋白通过适当结合方式结合于水不溶性底物。结合方式包括任何永久性将活性蛋白与底物结合的物理或化学方法。许多此类方式是该将a)活性蛋白和粘合剂或b)活性蛋白和单体/引发剂组合的溶液均匀喷涂在底物表面。可能需要粘合剂或单体/引发剂或单独引发剂的第二涂层来获得足够的粘合性。随后干燥底物使聚合物固化。此后彻底漂洗底物除去任何游离蛋白。链接在底物的聚合物凝胶涂层上的蛋白蛋白可以通过化学链和底物结合，该化学链结合在位于底物上的聚合物涂层上。蛋白和聚合物链结合，该聚合物链共价附着在聚合物涂层上。聚合物链的一种实施方案是聚乙二醇(PEG)-马来酰亚胺，由Shearwater Polymers,Inc.出售。PEG-马来酰亚胺必须与半胱氨酸氨基酸合用，因此它可以在活性蛋白是蛋白酶G时使用。PEG-马来酰亚胺也可以和聚丙烯酸2-羟乙酯涂层一起使用。一种优选的丙烯酸酯-PEG-马来酰亚胺链的一般结构可由下式表示 链接在擦拭底物上的聚合物涂层上的含半胱氨酸蛋白的另一个实施方案包括通过N-羟基琥珀酰亚胺共价结合在聚乙烯亚胺涂层上的PEG-马来酰亚胺，如下式所示 包括链接蛋白的结合方式与物理包埋相比，是优选的，因为链接蛋白更易移动并且被聚合物涂层覆盖得较少，这两点都可使蛋白具有更高的活性。共价连接在活化工具(activated implement)表面的蛋白本发明另一种结合蛋白的方式是共价连接于表面上的活化位点。对于这种结合方式，优选底物是纤维素材料。化学连接可以是任何可与底物和蛋白反应的双官能化合物。优选的化学连接是乙二胺/N-γ-马来酰亚氨基丁酰氧基琥珀酰亚胺酯(maleimidobutyryloxysuccinimideester)(GMBS)。
优选的乙二胺/GMBS连接的一般结构可以由下式表示 通过聚合物链共价连接于活化工具表面的蛋白将活性蛋白和本发明个人护理用擦物的底物相结合的另一种方式是与底物表面的活化位点共价结合的聚合物链。优选的链是乙二胺/聚乙二醇-马来酰亚胺。直接结合的乙二胺/PEG-马来酰亚胺链的一般结构可以由下式表示 选择性组分本发明的擦拭组合物可以含有多种选择性组分。CTFA国际化妆品组分词典(第6版，1995)在此全文引入作为参考，其中公开了多种护肤工业中常用的非限定化妆品和药物组分，它们也适用于本发明的组合物。这些功能类组分的非限定例公开在该参考文献的第537页。这些功能类别的实例包括磨料，抗痤疮剂，防结块剂，抗微生物剂，抗氧剂，粘合剂，生物添加剂，填充剂，螯合剂，化学添加剂，着色剂，化妆用收敛剂，化妆用杀虫剂，变性剂，药物收敛剂，乳化剂，外用镇痛剂，成膜剂，香料成分，增湿剂，温和促进剂(mildness enhancer)(阳离子和非离子聚合物，辅助表面活性剂，脂质湿润剂，烃油，硅油，蜡)，遮光剂，增塑剂，防腐剂，推进剂，还原剂，皮肤漂白剂，皮肤调理剂(润肤剂，增湿剂，混杂型和堵塞型(miscellaneous and occlusive))，皮肤防护剂，溶剂，泡沫促进剂，水溶助长剂，加溶剂，稳定剂，悬浮剂，防晒剂，表面活性剂(阴离子、阳离子、两性、两性离子)，紫外吸收剂，和增粘剂(含水和非水)。其它适用于本发明的功能类材料的实例是所属领域普通技术人员熟知的，包括加溶剂、多价螯合剂和溶角蛋白剂等。
使用方法本发明的个人护理组合物适用于个人清洁、皮肤美容处理和/或皮肤调理。本发明可采用个人护理擦物或个人护肤遮盖剂的形式。通常，用擦物使被清洁区域在较短时间内暴露于活性酶下。使用时，擦物接触或擦拭需处理的皮肤并且随后除去。本发明擦物的典型清洁用量是约1至约4擦(wipe)/次使用，优选约1至约2擦/次使用。皮肤遮盖剂是用来使被处理区域暴露较长的时间。本发明皮肤遮盖剂的典型清洁用量是约1至约2面层(mask)/次使用，优选1面层/次使用。
实施例和制备方法下列实施例进一步描述和证明本发明范围内的实施方案。在下列实施例中，所有组分均以有效含量列出。实施例的目的仅仅是举例说明，对本发明不构成限定，在不脱离本发明的实质和范围下可以有多种改变。组分名称为化学名称或CTFA名称。
下列是本发明的带有结合活性蛋白的擦物的非限定实施例。实施例1-包埋在人造丝/PET底物上的丙烯酸酯凝胶中的蛋白酶G将蛋白酶G提纯并且在10 mM磷酸一钾(KH2PO4)缓冲液(pH5.5)中浓缩至浓度为3 mg/mL。加入丙烯酸2-羟乙酯(HEA)至1.3M的最终摩尔浓度。加入50mM过氧化氢(H2O2)使H2O2的最终摩尔浓度为2.5mM。将蛋白酶F/HEA/H2O2溶液均匀喷涂在人造丝/PET薄片上直至薄片变为饱和。将硫酸亚铁(Ⅱ)七水合物(FeSO4·7H2O)溶液均匀喷涂在薄片上。使该薄片静置5分钟。经过连续0.01M KH2PO4浴漂洗薄片直至除去全部游离蛋白。干燥该薄片。实施例2-链接于聚合物涂层的蛋白酶G
将蛋白酶G提纯并且在10 mM KH2PO4缓冲液(pH 5.5)中浓缩至约2.5mg/mL。以15∶1摩尔过量加入丙烯酸酯-PEG3400-马来酰亚胺(ShearwaterPolymers,Inc.)。用稀氢氧化钠(NaOH)将溶液pH升高至7。室温下令蛋白酶G和丙烯酸酯-PEG-马来酰亚胺反应1-2小时。用稀磷酸(H3PO4)使溶液pH降低至5.5。向蛋白酶G-PEG-马来酰亚胺溶液中加入丙烯酸2-羟乙酯(HEA)获得1.3M的最终摩尔浓度。向蛋白酶G-PEG/HEA溶液加入50mM H2O2溶液使H2O2的最终摩尔浓度为2.5mM。将该溶液喷涂在人造丝/PET薄片上直至薄片变饱和。单独将50mM七水合硫酸亚铁(Ⅱ)(FeSO4·7H2O)溶液喷涂在薄片上，使整个表面均匀喷涂。静置该薄片5分钟。随后经过0.01M KH2PO4浴连续漂洗直至除去全部游离蛋白酶G。干燥该薄片。实施例3-直接共价连接于活化工具表面的蛋白酶G利用1mL溶液/1cm2薄片，将人造丝/PET薄片浸泡在10％(w/v)NaOH的水溶液中10-15分钟，同时在自动振荡器上振摇。在抽吸下用去离子水将薄片洗涤3次，每次洗涤时每cm2薄片使用约1ml水。在抽吸下用丙酮洗涤薄片5次。在两次洗涤之间将薄片在丙酮中浸泡1分钟。令薄片在10％(w/v)对甲苯磺酰氯的丙酮溶液中反应25-30分钟，同时振摇(～1ml/cm2)。在抽吸下用丙酮洗涤薄片3次，除去过量的对甲苯磺酰氯。令薄片在2.2M乙二胺的丙酮溶液中(pH 13-14)反应2小时同时振摇。在抽吸下用丙酮漂洗薄片3次，除去过量的EDA。在抽吸下用无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)漂洗薄片5次。在两次漂洗之间令薄片在DMF中浸泡1分钟。令薄片在10％(w/v)N-γ-马来酰亚氨基丁酰氧基琥珀酰亚胺酯(GMBS)中反应过夜(～1ml/cm2)同时振摇。在抽吸下用无水DMF将薄片漂洗3次。用0.01M KH2PO4缓冲液(pH 7)在抽吸下漂洗薄片5次。两次漂洗之间将薄片在缓冲液中浸泡1分钟。令薄片在10mM KH2PO4缓冲液(pH 7)中的3mg/ml蛋白酶G(～1ml/cm2)中反应约1-2小时。用0.01M KH2PO4缓冲液(pH5.5)漂洗薄片3次。干燥薄片。实施例4-经聚合物链共价连接于活化工具表面(activated implementSurface)的蛋白酶G利用1mL溶液/1cm2薄片，将人造丝/PET薄片浸泡在10％(w/v)NaOH的水溶液中10-15分钟，同时在自动振荡器上振摇。在抽吸下用去离子水将薄片洗涤3次(～1ml/cm2/洗涤)。在抽吸下用丙酮洗涤薄片5次。在两次洗涤之间将薄片在丙酮中浸泡1分钟。令薄片在10％(w/v)对甲苯磺酰氯的丙酮溶液中反应25-30分钟，同时振摇(～1ml/cm2)。在抽吸下用丙酮漂洗薄片3次，除去过量的对甲苯磺酰氯。令薄片在2.2M 乙二胺的丙酮溶液中(pH 13-14)反应2小时，同时振摇。在抽吸下用丙酮漂洗薄片3次，除去过量的EDA。在抽吸下用0.2M硼酸钠缓冲液(pH8.5)漂洗薄片5次。在两次漂洗之间令薄片在缓冲液中浸泡1分钟。令薄片在0.2M硼酸钠缓冲液(pH8.5)中的3-5％(w/v)马来酰亚胺-PEG3400-NHS(Shearwater Polymers,Inc.)中反应1-2小时(～1ml/cm2)，同时振摇。用10mM KH2PO4缓冲液(pH 7)在抽吸下漂洗薄片5次，除去过量的PEG。令薄片在存在于10mM KH2PO4缓冲液(pH7)(～1ml/cm2)中的3mg/ml蛋白酶G中反应约1-2小时。用0.01M KH2PO4缓冲液(pH5.5)漂洗薄片3次。干燥薄片。实施例5-经聚合物链共价连接于涂敷工具表面的蛋白酶G室温下，振摇的同时将人造丝/PET薄片在500ppm聚乙烯亚胺浴中浸泡1小时(～1-2ml/cm2薄片)。将人造丝/PET薄片在2个连续的0.2M硼酸钠缓冲液(pH12)浴(～5-10ml/cm2)中漂洗。将薄片在2个连续的0.2M硼酸钠缓冲液(pH8.5)浴中漂洗。室温下，振摇的同时令薄片在存在于0.2M硼酸钠缓冲液(pH8.5)中的5mg/ml NHS-PEG3400-马来酰亚胺中反应1小时。经4个去离子水浴漂洗该薄片(～5-10ml/cm2)。用2个0.01M KH2PO4缓冲液(pH7-7.5)浴漂洗该薄片。单独地将蛋白酶G提纯并且在0.01M KH2PO4缓冲液(pH7-7.5)中浓缩至约1-2mg/mL。室温下振摇的同时令“PEG化”薄片在蛋白酶G溶液(pH7-7.5)中反应1小时。用5个连续的0.01M KH2PO4缓冲液(pH5.5)浴漂洗薄片，除去未反应、未结合的蛋白酶G。干燥薄片。
在适当容器中，室温下将相A的组分混合形成一个分散体并且搅拌下加热至65℃。将相B的组分在另一个适当容器中混合并且加热至65℃。一旦达到相同的温度，将相B的组分混合在含有相A组分的容器中并且随后冷却至45℃。室温下将相C的组分在一个单独容器中混合在一起。随后，室温下将相C混合物加入含有相A和相B的混合物的容器中。将1.5g所得溶液喷涂在各个底物上。另外，底物可以浸渍在所得溶液中。处理的底物在烘箱中干燥至重量恒定。或者，经处理的底物在45℃的对流烘箱中干燥至重量恒定。
在其它实施方案中，其它底物例如是纺织底物、水力缠结底物、天然海绵、合成海绵或聚合物网。其它实施方案可以是个人护肤遮盖剂的形式。
在适当容器中，室温下将相A的组分混合形成一个分散体并且搅拌下加热至65℃。将相B的组分在另一个适当容器中混合并且加热至65℃。一旦达到相同的温度，将相B的组分混合在含有相A组分的容器中并且随后冷却至45℃。随后，室温下将相C的混合物加入含有相A和相B的混合物的容器中。将1.5g所得溶液喷涂在各个底物上。另外，底物可以浸渍在所得溶液中。处理的底物在烘箱中干燥至重量恒定。或者，经处理的底物在45℃的对流烘箱中干燥至重量恒定。
在其它实施方案中，其它底物例如是纺织底物、水力缠结底物、天然海绵、合成海绵或聚合物网。其它实施方案可以是个人护肤遮盖剂的形式。
在适当容器中，室温下将相A的组分混合形成一个分散体并且搅拌下加热至65℃。将相B的组分在另一个适当容器中混合并且加热至65℃。一旦达到相同的温度，将相B的组分混合在含有相A组分的容器中并且随后冷却至45℃。随后，室温下将相C的混合物加入含有相A和相B的混合物的容器中。将1.5g所得溶液喷雾在各个底物上。另外，底物可以浸渍在所得溶液中。处理的底物在烘箱中干燥至重量恒定。或者，经处理的底物在45℃的对流烘箱中干燥至重量恒定。
在其它实施方案中，其它底物例如是纺织底物、水力缠结底物、天然海绵、合成海绵或聚合物网。其它实施方案可以是个人护肤遮盖剂的形式。
在适当容器中，室温下将相A的组分混合形成一个分散体并且搅拌下加热至65℃。将相B的组分在另一个适当容器中混合并且加热至65℃。一旦达到相同的温度，将相B的组分混合在含有相A组分的容器中并且随后冷却至45℃。随后，室温下将相C的混合物加入含有相A和相B的混合物的容器中。将1.5g所得溶液喷涂在各个底物上。另外，底物可以浸渍在所得溶液中。处理的底物在烘箱中干燥至重量恒定。或者，经处理的底物在45℃的对流烘箱中干燥至重量恒定。
在其它实施方案中，其它底物例如是纺织底物、水力缠结底物、天然海绵、合成海绵或聚合物网。其它实施方案可以是个人护肤遮盖剂的形式。
权利要求
1．一种个人护理擦拭组合物，它含有a)水不溶性底物，b)多种蛋白酶G类酶，和c)永久性使各个酶附着在底物上的结合方式；其中该个人护理擦拭组合物在底物上含有约0.01μg/cm2至约1000μg/cm2的所述酶。
2．一种个人护肤遮盖组合物，它含有a)水不溶性底物，b)多种蛋白酶G类酶，和c)永久性使各个酶附着在底物上的结合方式；其中该个人护理擦拭组合物在底物上含有约0.01μg/cm2至约1000μg/cm2的所述酶。
3．按照权利要求1或2所述的个人护理组合物，其中所述水不溶性底物包括一种或多种选自下列的材料丝类、角蛋白类、纤维素类、醋酸酯类、丙烯酸(酯)类、纤维素酯类、改性聚丙烯腈类、聚酰胺类、聚酯类、聚烯烃类、聚乙烯醇类、木(纸)浆、棉、大麻、黄麻、亚麻、丙烯酸(酯)类、尼龙、聚酯类、聚丙烯类、聚乙烯类、聚乙酸乙烯酯类、聚氨酯类、人造丝，和它们的混合物。
4．上述权利要求任一项所述的个人护理擦拭组合物，其中该水不溶性底物包括选自人造丝纤维、纤维素纤维、聚酯纤维及其混合物的纤维的无纺层。
5．上述权利要求任一项所述的个人护理擦拭组合物，其中所述水不溶性底物包括两层或多层分别具有不同质地的纤维。
6．上述权利要求任一项所述的个人护理擦拭组合物，其中结合方式选自物理包埋，链接到聚合物凝胶上，共价结合于活化表面，共价结合地链接于活化表面，和共价结合地链接于涂敷表面。
7．上述权利要求任一项所述的个人护理擦拭组合物，其中所述结合方式是物理包埋在聚合物涂层中。
8．上述权利要求任一项所述的个人护理擦拭组合物，其中所述聚合物涂层是聚丙烯酸2-羟乙酯。
9．上述权利要求任一项所述的个人护理擦拭组合物，其中所述结合方式是链接到聚合物涂层上。
10．上述权利要求任一项所述的个人护理擦拭组合物，其中所述链是聚乙二醇-马来酰亚胺并且所述聚合物涂层含有聚丙烯酸2-羟乙酯。
11．上述权利要求任一项所述的个人护理擦拭组合物，其中所述链是聚乙二醇-马来酰亚胺并且所述聚合物涂层含有聚乙烯亚胺。
12．上述权利要求任一项所述的个人护理擦拭组合物，其中所述结合方式是共价连接到底物的活性位点上。
13．上述权利要求任一项所述的个人护理擦拭组合物，其中共价连接是N-γ-马来酰亚氨基丁酰氧基琥珀酰亚胺酯。
14．上述权利要求任一项所述的个人护理擦拭组合物，其中所述结合方式是共价结合在底物表面的活性位点上的聚合物链。
15．上述权利要求任一项所述的个人护理擦拭组合物，其中所述聚合物链含有聚乙二醇-马来酰亚胺。
16．一种使皮肤增湿的方法，包括令上述任一权利要求的个人护理组合物与需此处理的皮肤接触。
全文摘要
本发明涉及个人护理组合物,其中含有水不溶性底物、多种蛋白酶G类酶以及永久性将各个酶固着在底物上的结合方式,其中该个人护理组合物在底物上含有约0.01μg/cm
文档编号D06M15/263GK1319002SQ99811209
公开日2001年10月24日 申请日期1999年9月14日 优先权日1998年9月22日
发明者D·J·维斯戈博, A·C·奥尔考克 申请人:宝洁公司