一种消除残留农药的复合酶制剂及应用的制作方法

专利名称：一种消除残留农药的复合酶制剂及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种复合酶制剂,特别涉及消除蔬菜、茶叶和瓜果中残留农药的复合酶制 剂及其应用。
背景技术：
我国需以占世界7%的土地养活占世界20%的人口，因而非常依赖农药。特别是为了 减少因病虫害造成的损失，使用了大量的杀虫剂。但农药一方面抑制病虫害的发生；另一 方面，它也带来了极大的生态和社会问题。
绝大多数农药均具毒性，且缺乏选择性，常对非靶标生物造成直接的毒害。此外，由 于农药较难降解，有部分残留在作物、牧草、土壤和水体中，并随食物链转移和富集作用， 使处于食物链的最高位置的人类受到的农药危害最严重。
农药对人的危害主要有急性中毒、慢性中毒、迟发性神经中毒、致癌、致畸和致突 变、生殖毒性，如损害精子，使受孕和生育能力降低，并可导致胚胎发育障碍、子代发育 不良或死亡等。
我国蔬菜、水果的农药残留问题相当严重，甚至有因食用含残留农药的蔬菜、水果造 成急性中毒的报道。现在通常采用清水洗涤、浸泡或者用清洗剂清洗的方法清除蔬菜、水 果表面残留的农药。农药一般难溶于水，仅用清水清洗不能得到满意的效果。
清洗剂虽可较有效地去除残留农药，但并未真正清除残留农药，农药随污水再次进入 环境循环并积累。也可采用碱水洗涤，农药在碱性条件下容易分解，但碱性过强容易破坏 蔬菜、水果的营养和风味，另外碱对农药的分解也相对有限。
目前，应用最广泛三类农药是有机磷、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯，它们都对哺乳动物 有神经毒作用。与已禁用的有机氯相比，它们较易自然降解或被酶水解。
有机磷农药多为磷酸酯类或硫代磷酸酯类，含有三个磷酯键。其致毒机理是磷酰化乙 酰胆碱酯酶，使机体丧失分解乙酰胆碱的能力。蓄积的乙酰胆碱使胆碱能神经受到持续冲 动，导致先兴奋后衰竭的一系列神经系统中毒症状，严重时可导致死亡。只要断裂一个磷酯键，有机磷农药就失去抑制乙酰胆碱酯酶的能力，丧失或大大降低对动物的毒性作用。 氨基甲酸酯类农药的结构基于毒扁豆碱，骨架为氨基甲酸，常用的是N-甲酰氨基甲 酸酯。其毒理机制也是抑制乙酰胆碱酯酶活性，阻断正常神经传导。但同有机磷类的机制 有所不同1.它不需经代谢活化，可直接与乙酰胆碱酯酶形成疏松复合体，抑制后者的 活性。2.与乙酰胆碱酯酶可逆结合，形成的复合物可迅速分解，故症状较轻，恢复较快。 酯键断裂后氨基甲酸酯类农药失去毒性作用。
拟除虫菊酯类农药是在天然除虫菊酯结构的基础上开发的高效、广谱、快速击倒、神 经致毒性杀虫剂。传统拟除虫菊酯均为羧酸酯，由醇和菊酸縮合而成。菊酸部分通常为含 不同侧链分子的二甲基环丙烷，醇部分通常为带氰基的芳香环。拟除虫菊酯的致毒机制是 通过延迟神经元电压门控性钠通道的关闭，导致中枢神经细胞钠、钙离子流增加，引起胞 内钠、钙离子浓度增高，膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性和功能改变，造成中枢神 经系统损伤。同氨基甲酸酯类农药一样，酯键断裂后拟除虫菊酯类农药即失去毒性作用。 从中国学术期刊数据库、万方数据库和维普全文数据库收集1998 - 2006年度所有关 于蔬菜、水果农药残留的文章。剔除重复文献，抽出其中定量分析农药残留的文章，对其 中数据进行统计，归纳。中国现阶段蔬菜、水果中农药残留的大致现状为(见表1):检 出率最高的三种有机磷农药是甲胺磷、氧乐果和对硫磷；检出率最高的两种氨基甲酸酯类 农药是呋喃丹和西维因；检出率最高的三种拟除虫菊酯农药是氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰 菊酯。检出率均为相对检出率，以每类农药中检出率最高的那种为IOO计。
表1. 1998 - 2006年度中国蔬菜水果农药检出率统计
有机磷类氨基甲酸酯类拟除虫菊酯类甲胺磷氧乐果对硫磷呋喃丹西维因氯氰溴氰氰戊
10065.958.510066.710091.641.6
降解农药使其失效的方法主要有化学降解、光降解和微生物降解。常用的化学降解法 有氧化法、碱水解法和酸水解法，化学法虽然能有效降解农药，但仅适用于农药厂生产废 水的处理，且酸、碱容易腐蚀管道，成本高，具有一定危险性。光降解是利用日光降解植 物表面、.土壤表面和空气中的农药。不同的化合物在光照下稳定性不同，光照强度、土壤类型也会影响降解效果，因而光降解的作用较为有限。环境中的微生物能降解和转化农药。 事实上，农药在环境中的降解和转化主要由微生物引起。微生物对农药的代谢多通过一系 列酶促反应完成，包括水解作用。
不过，上述方法无一适合蔬菜和瓜果上残留农药的清除。化学法所需的酸、碱及氧化 条件已足以破坏蔬菜瓜果的营养成分；光降解法需要很长时间；微生物处理降解农药，对 蔬菜瓜果也有损害。即使没有影响，这样处理的蔬菜瓜果估计很难被人们所接受。
因此，迫切需要能够简便、安全的清除蔬菜、瓜果上残留农药的方法和产品，以满足 人们日常生活的需要。

发明内容
本发明目的之一是为了提供一种降解谱广的清除蔬菜和瓜果上残留农药的复合酶制 剂,将残留在蔬菜和水果上农药分解为无毒或低毒的产物，降低其对人和非靶标生物的毒 害及对环境的污染。
本发明目的之二在于提供上述复合酶制剂的应用。
本发明的第一方面，提供了一种消除残留农药的复合酶制剂，包含有机磷水解酶、氨 基甲酸酯水解酶、拟除虫菊酯水解酶，所述的有机磷水解酶、氨基甲酸酯水解酶、拟除虫 菊酯水解酶的质量比例为l:27 40: 120 240。所述的复合酶制剂为水溶液或缓冲溶液， 反应体系的pH值为7.5 8.5。
优选地，有机磷水解酶，氨基甲酸酯水解酶和拟除虫菊酯水解酶的比例为1:40:240。
所述的有机磷水解酶、氨基甲酸酯水解酶和拟除虫菊酯水解酶是由来源于微生物的基 因表达的，有机磷水解酶选自opd基因、opdA基因、mpd基因、ophC2基因表达产物的 一种或组合；氨基甲酸酯水解酶选自cehA基因、caha基因产物中的一种或组合；拟除虫 菊酯水解酶为estP基因表达产物。
较优地，有机磷水解酶由opd基因及/或ophC2基因表达，氨基甲酸酯水解酶由cehA 基因及/或caha基因表达，拟除虫菊酯水解酶由estP基因表达。
最优地，有机磷水解酶由opd基因(genbank登录号M20392)表达，氨基甲酸酯 水解酶由cehA基因(genbank登录号Ab069723)表达，拟除虫菊酯水解酶由estP基因 (genbank登录号AY995176)表达。所述的复合酶制剂，其反应体系还含有终浓度为万分之零至二的烷基酚聚氧乙烯醚 (op-10)及/或终浓度为万分之零至万分之一点五的椰子油烷基二乙醇酰胺(6502)。 本发明的复合酶制剂，通常含有有效量的农药降解酶以及可接受的载体或赋形剂。这
类载体包括但不限于水、缓冲液、甘油、蔗糖、淀粉……及其组合。本发明的复合制剂 可被制成液态或固态。液态制剂可用水或磷酸缓冲溶液通过常规方法进行制备，例如，可 以制成浓縮溶液，使用时加水稀释到使用浓度。固态制剂可以将水解酶、淀粉等混合后通 过常规方法制备成片剂、颗粒剂，也可以将水解酶溶解后冻干，制备成冻干粉剂等。本发 明的复合酶制剂的添加剂，包括但不限于去污剂、二价金属离子等，可以预先与降解酶混 合，也可独立包装，在使用时混合。本发明并不限于某一种具体的制剂类型。
本发明的第二方面，提供了上述复合酶制剂的应用，用于降解蔬菜和瓜果上残留农药， 所述的农药包括但不限于，有机磷类农药及/或氨基甲酸酯类农药及/或拟除虫菊酯类农 药。
本发明根据国内农药使用状况，有针对性地选择降解谱广，降解活性强的三种来源于 微生物的农药降解酶，优选了三种酶的配比、水解酶和添加剂的配比，制备成复合酶制剂。 其有益效果体现在
(1) 该复合酶制剂降解谱广，覆盖性强，能同时降解目前国能使用最广泛的三种类 型的农药，可以给家庭、餐馆等用户提供一种方便的清除农药残留的方案；
(2) 三种酶可产生协同作用，通过有机磷水解酶对有机磷农药的降解，克服了有机 磷农药对氨基甲酸酯和拟除虫菊酯水解酶的抑制；
(3) 通过对三种酶的比例优化、添加剂的优选、反应条件的优选，使得本发明的复 合酶制剂酶活高，清除农药残留效果优异；
(4) 本发明的复合酶制剂，所采用的微生物降解酶采用基因工程手段制备，产量高， 成本低，有利于大规模推广。
(5) 本发明的复合酶制剂，采用酶发降解农药残留，不仅清除效果好，而且简单、 安全、所需反应条件温和且极易随蔬菜水果清洗而去除，不沾染蔬菜瓜果也不影响其的口 味和营养。


图1是有机磷水解酶的活性与pH的关系。
图2是拟除虫菊酯水解酶的活性与pH的关系。
图3是氨基甲酸酯水解酶的活性与pH关系。
图4是添加去污剂对有机磷农药水解酶的影响。
图5是添加去污剂对氨基甲酸酯水解酶活性的影响。
图6是添加去污剂对拟除虫菊酯水解酶活性的影响。
具体实施例方式
农药降解酶
酶法降解农药残留具有反应条件温和，降解效率高的特点。可选择的农药降解酶包括: 微生物来源、昆虫来源、动物来源的农药降解酶。
可通过模拟昆虫解毒机制开发降解农药的酶产品，即重构昆虫的解毒体系。昆虫参与
解毒的酶类主要有混合功能氧化酶(MFO)、酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)等，其中 MFO的作用需要NADPH，而GST发挥作用则需谷胱甘肽。在氨基甲酸酯类农药抗性的 昆虫如按蚊、小菜蛾和蚜虫中，羧酸酯酶是造成抗药性的原因。但昆虫羧酸酯酶水解农药 的能力十分有限(马拉硫磷例外)，抗性昆虫不是通过表达水解活性大大提高的羧酸酯酶， 而是通过表达大量的羧酸酯酶与杀虫剂结合，使杀虫剂不能到达靶标，从而保护体内靶标 -乙酰胆碱酯酶免受抑制。此外，羧酸酯酶能也在一定程度上降解拟除虫菊酯，但昆虫对 拟除虫菊酯类的抗性机制主要是因为神经膜上Na+通道的敏感性降低。因而重构昆虫的解 毒体系来清除残留的农药并不经济。
从动物体内获得的磷酸三酯酶也能分解有机磷农药，获得的酯酶也有水解氨基甲酸酯 和拟除虫菊酯的能力，但相比之下，它们对农药的分解能力比较低。
相比之下，微生物来源的水解酶具活性高、易筛选等优点，成为寻找农药降解酶的热 点。即从自然界中筛选能降解特定农药的菌株，并从中分离相应的水解酶基因。研究较多 且卓有成效的是有机磷农药水解酶opd是最早发现且研究最为透彻的有机磷水解酶基 因，后来又陆续发现许多能水解有机磷的基因，如opaA、 opdA等。国内也有发现有机磷 水解酶基因的报道，如范云六等发现ophC2，李顺鹏等发现mpd基因。还有氨基甲酸酯 类农药水解酶基因，如pcd、 cehA、 mcd、 cahA等和一些拟除虫菊酯水解酶，如estP。复合酶制剂
当前许多有关解决农药残留问题的专利主要集中在筛选农药水解酶基因，尤其是有机 磷农药水解酶基因，并用得到的基因清除蔬菜、水果中残留的农药。仅用有机磷水解酶对 残留的氨基甲酸酯和拟除虫菊酯类几乎没有清除效果。也有用有机磷水解酶和昆虫的酯酶 复配使用的，但如前所述，昆虫的酯酶解毒的机理主要是结合，水解是次要的。
由于蔬菜水果品种多样，生产过程中使用的农药种类各不相同，因此日常生活中遇到 的农药残留往往不是一种，而是不同种类的多种农药。因而采用单一降解一种或一类农药 的方法并不能很好解决农药残留问题，必须采用具有降解广谱性的复合制剂。
据调查1998-2006年间，在我国蔬菜、水果中检出率最高的3种有机磷农药为甲胺 磷，氧乐果和对硫磷；两种氨基甲酸酯类农药为呋喃丹和西维因；三种拟除虫菊酯类农药 为氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯，因此，应将这些农药作为优先分解的对象。
本发明的复合酶制剂选择包括机磷水解酶，氨基甲酸酯水解酶，拟除虫菊酯水解酶。 较优地，三种酶来源微生物的有机磷水解酶、氨基甲酸酯水解酶和拟除虫菊酯水解酶。
可选择的酶种类很多，比如有机磷水解酶就有Opd， Opda， OphC2等选择。不同的 酶具有不同的底物谱和活性，没有一种酶能很好水解所有的农药。因此，应优先选择对最 常见的残留农药种类有降解优势的酶或酶组合。同时，由于不同的酶需要不同的反应条件， 协调这些条件也绝非易事。需要在酶的广谱性和活性之间找个平衡点，用一种或少数几种 酶实现对某一类或几类残留农药的分解。
本发明的发明人通过大量的研究工作，发现用现有的opd(genbank登录号M20392)、 ceha (genbank登录号Ab069723)和estp (genbank登录号AY995176)三种酶组合能 很好降解所列的需优先降解的农药。这样组合的原因不是简单地将能分解三类农药的酶混 合，其最大的优势之一是能消除有机磷农药对氨基甲酸酯和拟除虫菊酯水解酶的抑制。作 为优选实施例，本发明选择来源于微生物的opd、 ceha和estp基因组合来实现对所列需优 先降解农药的清除。
由于各种酶比活不同，各种农药的使用剂量也不同，因而不能简单地将几种酶混合。 按农药的实际残留量来确定酶的比例在理论上是最佳的，但由于各种农药的稳定性不同， 蔬菜水果的上市时间不同，农药的实际残留比例千差万别，很难得出一个具有一般性的 数据。农药的施用剂量相对固定，因而，可以其为参考来计算复合酶制剂中各种酶的比 例。据调查，农药的施用剂量均在同一数量级，至少我们所考虑的这几种农药如此，因而决定各种酶比例的主要因素是酶的比活。本发明中所采用的有机磷水解酶(opd表达)、 氨基甲酸酯水解酶(ceh表达)和拟除虫菊酯水解酶(estP表达)以本发明所列三类农药 为底物时，其平均比活约分别为1000—1200IU/mg， 30—45IU/mg禾H 5— 10IU/mg。因 而，在本发明中三种水解酶的比例为l:27—40:120—240。
此外，农药多为水不溶性物质，常吸附在蔬菜、水果表面，不易与水解酶相互作用。 添加去污剂有助于农药从蔬菜、水果表面脱离，还有助于农药分散在水溶液中，促进农药 与水解酶相互作用。因而，复合酶反应体系中还含有能促进农药消除的去污剂。较优地， 选择允许在食品洗涤剂中使用的去污剂。更优地，添加的去污剂为垸基酚聚氧乙烯醚 (叩-lO)和椰子油垸基二乙醇酰胺(6502)。 农药降解酶的制备
微生物来源的农药降解酶，可以通过培养产生该种酶的微生物得到，也可以通过基因 工程方法制备。例如，可通过将编码农药降解酶的基因克隆在原核表达载体如大肠杆菌表 达载体或真核表达载体如酵母表达载体中进行重组蛋白的生产，这是本领域工作人员熟知 的。
体外消除残留农药的酶，其纯度的要求远较蛋白质药品低。为简化纯化工艺，降低成 本，可在蛋白N端或C端加上便于纯化的标签，如FLAG， 6XHis等，其中以6XHis更 为成熟、有效。作为优选，本发明选择在酶的N端引入6XHis标签。
大肠杆菌具有生长速度快、操作简单、技术成熟等优点，因而，较优地，本发明通过 将基因克隆在原核表达载体中，在大肠杆菌中生产水解酶。
本发明opd基因、cehA基因、cehA基因由上海生物工程有限公司合成，表达质粒 pET30a(+)购于Novagen公司，大肠杆菌BL21(DE3)购于Stratagene公司，限制性内切酶 购于上海生物工程有限公司。采用基因工程技术方法，得到上述基因的蛋白酶表达产物。 对硫磷、西维因和氯氰菊酯购于上海市农药研究所，去污剂烷基酚聚氧乙烯醚(op-10)、 椰子油烷基二乙醇酰胺(6502)为国产，其他试剂为国产分析纯试剂。
为了进一步说明本发明的功效和方法，现用具体的实施方式来加以说明。下列实施例 中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，《分子克隆实 验室手册》(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件， 或《国家农业行业标准NY/T761 - 2004》限定的方法和条件，或按照制造厂商所建议的条件。应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
实施例l、 opd基因产物的制备 (1)表达和纯化
A、 按照genbank登录号M20392公布的基因序列，在5'端引入Nde I位点，在终止 密码子后加上Eco RI位点设计opd表达基因；
B、 将基因克隆在pET30a(+)质粒的Nde I和Eco RI位点之间，构建表达质粒；
C、 用CaCl2法将表达质粒转入大肠杆菌BL21 (DE3)菌株，挑选卡那抗性的克隆， 获得工程菌；
D、 接种步骤(2)的工程菌于含50pg/ml卡那霉素的LB培养基中，37 。C摇床培养 过夜。按l: IOO转接于含卡那霉素的新鲜LB培养基中，继续培养至OD600-0.8，加入 IPTG至使用浓度为0.5 mmol/L诱导表达4小时，离心收集菌体备用，弃上清；
E、 用PB (50mmol/L， pH7.5)重悬菌体，超声波破碎细胞，18000Xg离心15分收 集上清，将上清上用PB (50mmol/L， pH7.5)预平衡的Ni - Chelating Sepharose FastFlow 柱，然后以同样的PB再平衡Ni - Chelating Sepharose FastFlow柱，用洗脱缓冲液(50 mmol/L PB， 100mmol/L咪唑，pH7.5)洗脱，收集洗脱峰，将收集的洗脱峰用Sephadex G-25 对50腿ol/LPB， pH8.0脱盐。
本次试验共收获目标蛋白溶液75ml。
(2) 纯度鉴定
凝胶扫描法确定表达产物的蛋白纯度，Bradford法确定其浓度，并用所得浓度乘以 相应的纯度折算纯品的浓度。
经测定，本次制备的opd基因产物纯度为82.0%，浓度为3.2mg/ml。
(3) 活性测定
按如下方法测定活性基本反应体系为lml含2.5mmol/L底物对硫磷的Tris-HCl缓 冲液(50mmol/L， pH9.0)，加入约1吗酶，室温下反应10分钟。加入1 ml 10%的三氯 乙酸终止反应。设立对照组，除不加酶外，别的与试验组完全一致。
反应结束后，按照国家农业行业标准NY/T761 -2004用气相色谱法分析对照组和试 验组的有机磷峰。按下式计算酶活(1-A1/A0) /酶量X100。/。。其中A1是试验组有机磷 峰面积，AO为对照组有机磷峰面积。经测定，本次制备的opd基因产物的比活为1000_1200IU/mg。 实施例2 、 cehA基因产物的制备
按照genbank澄录号Ab069723公布的基因序列，在5'端引入Nde I位点，在终止 密码子后加上Eco RI位点设计cehA表达基因；
按实施例1相同的方法制备、表征cehA基因表达产物，共获得共收获目标蛋白溶 液67ml.;纯度为85.4%，浓度为2.7mg/ml。
按如下方法测定活性基本反应体系为lml含2 mmol/L相应底物西维因的PB缓冲 液(50mmol/L， pH7.5)，加入约5吗酶，室温反应10分钟后，用稀硫酸终止反应。也同 样设立对照组。反应结束后，按NY/T 761 - 2004用气相色谱法分析对照组和试验组的氨 基甲酸酯峰面积，同实施例1方法计算活性。
本次制备的cehA基因产物的比活为30_45IU/mg。
实施例3、 estP基因产物的制备
按照genbank登录号AY995176公布的基因序列，在5'端引入Nde I位点，在终止 密码子后加上Eco RI位点设计cehA表达基因；
按实施例1相同的方法制备、表征cehA基因表达产物，共收获目标蛋白溶液90ml.; 纯度为74.2%，浓度为1.9mg/ml。
按如下方法测定活性基本反应体系为lml含2mmol/L相应底物氯氰菊酯的Tris-HCl 缓冲液(20mmol/L， pH8.0)，加入约10吗酶，室温反应10分钟后用三氯乙酸终止反应， 也设立对照组。同上，按NY/T 761 -2004用气相色谱法分析对照组和试验组的拟除虫菊 酯农药的峰面积，同实施例1方法计算活性。
本次制备的estP基因产物的比活为5 —10IU/mg。
实施例4、反应体系pH对三种酶活性的影响
按实施例1-3测活方法准备反应体系，不过缓冲液换为50 mmol/L的磷酸盐缓冲液 (pH = 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5， 8.0, 8.5)，底物分别选择对硫磷、西维因和氯氰菊酯，酶分别 为opd， cehA和estP。测定酶活，分别以每个酶得到的最高活性为100绘制活性一pH曲 线，见图l-3。结果显示，三种酶在pH在8.0 — 8.5之间是都具有相对较高的酶活性。 实施例5、去污剂对水解酶活性的影响
同实施例l-3准备反应体系，缓冲液为50mMPB (pH8.0)，除含相应底物(对硫磷， 西维因和氯氰菊酯)，作为对照组；在对照组基础上每管加入去污剂——使用浓度为万分 之一点五的烷基酚聚氧乙烯醚(op-lO)，作为实验组。
每隔五分钟取出一管，终止反应。
同实施例l-3检测残留的农药，以残留农药的峰面积对时间作图，以不加酶管为100， 结果见图4-6。
实施例6、去污剂对水解酶活性的影响
同实施例5，试验组去污剂换成使用浓度为万分之一的椰子油烷基二乙醇酰胺 (6502)，得到与实施例5相似的结果。
实施例7、用复合酶制剂消除蔬菜、瓜果上的残留农药
在体积为1000 ml的50mM PB (pH 8.0)中分别加入实施例1-3制备的酶溶液lpl、 5(Hil、 5ml，使得实施例l-3制备的三种水解酶的质量比1: 40: 240;在上述溶液中加入 使用浓度为使用浓度为万分之一点五的烷基酚聚氧乙烯醚(op-10)，制成复合酶溶液。
有机磷农药、氨基甲酸酯农药和拟除虫菊酯农药按其使用剂量分别混配，每组农药分 别喷生菜6棵，油麦菜6棵，花菜6棵，喷苹果6个。头天下午喷施，次日上午取样。
将上述各类蔬菜平分为两组，一组用前述实施例所确定的复合酶制剂溶液室温浸泡处 理15分钟，另一组则不处理。按照NY/T 761 - 2004进行农药残留分析。
结果表明，未经处理的蔬菜、瓜果检测出强烈的农药残留，而经处理的蔬菜、瓜果未 检测出农药残留或残留很低。
本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原 理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和 改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等 效物界定。
权利要求
1、一种消除残留农药的复合酶制剂，其特征在于，所述的复合酶制剂包含有机磷水解酶、氨基甲酸酯水解酶、拟除虫菊酯水解酶，其质量比例依次为1∶27～40∶120～240。
2、 如权利要求1所述的酶制剂，其特征在于，所述的复合酶制剂为水溶液或缓冲溶 液，反应体系的pH值为7.5 8.5。
3、 如权利要求1所述的酶制剂，其特征在于，所述的有机磷水解酶，氨基甲酸酯水 解酶和拟除虫菊酯水解酶的比例为1: 40: 240。
4、 如权利要求1所述的酶制剂，其特征在于，所述的有机磷水解酶、氨基甲酸酯水 解酶和拟除虫菊酯水解酶由来源于微生物的基因编码表达，有机磷水解酶选自opd基因、 opdA基因、mpd基因、ophC2基因表达产物的一种或组合；氨基甲酸酯水解酶选自cehA 基因、caha基因产物中的一种或组合；拟除虫菊酯水解酶为estP基因表达产物。
5、 如权利要求4所述的酶制剂，其特征在于，有机磷水解酶由opd基因及/或ophC2 基因表达，氨基甲酸酯水解酶由cehA基因及/或caha基因表达，拟除虫菊酯水解酶由estP 基因表达。
6、 如权利要求4所述的酶制剂，其特征在于，有机磷水解酶由opd基因表达，genbank 登录号M20392;氨基甲酸酯水解酶由cehA基因表达，genbank登录号Ab069723;拟 除虫菊酯水解酶由estP基因，genbank登录号AY995176。
7、 如权利要求1所述的酶制剂构成的组合物，其特征在于，所述的酶制剂组合物中 还包含去污剂，包括但不限于为，含终浓度为万分之零至二的烷基酚聚氧乙烯醚，及/或 终浓度为万分之零至万分之一点五的椰子油烷基二乙醇酰胺(6502)。
8、 如权利要求1-7中的任一项所述的复合酶制剂的应用，用于降解蔬菜、茶叶和瓜 果上残留农药，所述的农药包括但不限于，有机磷类农药、氨基甲酸酯类农药和拟除虫菊 酯类农药。
全文摘要
本发明的目的是提供一种降解谱广，可以清除涵盖日常常见的蔬菜和瓜果上残留农药的复合酶制剂，将残留在蔬菜和水果上农药分解为无毒或低毒的产物，降低其对人和非靶标生物的毒害及对环境的污染。本发明还提供了上述复合酶制剂的应用。本发明的一种消除残留农药的复合酶制剂，包括有机磷水解酶，氨基甲酸酯水解酶，拟除虫菊酯水解酶。优选地，上述的三种酶来源于微生物的基因表达。与传统方法比较，此法不仅简单、安全、所需反应条件温和，不影响蔬菜瓜果的口味和营养，复合酶制剂本身极易清洗去除，同时真正意义清除了残留的农药。
文档编号A62D101/04GK101293131SQ20071009380
公开日2008年10月29日 申请日期2007年4月29日 优先权日2007年4月29日
发明者杨柏成, 勇 苏 申请人:上海普天欣生物技术有限公司