一种降解呋虫胺的方法与流程

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种降解呋虫胺的方法。

背景技术

呋虫胺(dinotefuran)，化学名称为1-甲基-2-硝基-3-(四氢-3-呋喃甲基)胍，分子中不含卤素和芳环而以四氢呋喃基为取代基，是由日本三井化学公司研发的第三代烟碱类杀虫剂，具有杀虫谱广、内吸渗透作用强、杀虫活性高、持效期长、对动植物安全性高等特点，并能克服一二代烟碱类杀虫剂引起的抗性风险，应用前景广阔。该药于2013年在我国获准登记，可用于水稻田防治稻飞虱、水稻小绿叶蝉等害虫。目前，国内外已有关于呋虫胺在农产品、水稻田、水体中的残留检测研究的报道。虽然烟碱类杀虫剂的毒性较低，但随着在农业生产中的广泛使用，其在环境介质中的残留受到越来越多的重视，开发降解呋虫胺的方法也会显得愈发重要。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种降解呋虫胺的方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种降解呋虫胺的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将白腐真菌(phanerochaetesordidayk-624，以下简称yk-624)进行液体培养；

(2)将液体培养后的白腐真菌及液体培养基与呋虫胺混合，24～30℃静置。

所述液体培养的液体培养基包括以下重量份的组分：9-11份葡萄糖，0.2-0.3份酒石酸铵，1.5-1.7份无水乙酸钠和95-105份kirk盐溶液。

其中，所述kirk盐溶液包括以下重量百分比的组分：1.8-2.2％磷酸二氢钾，0.4-0.6％七水合硫酸镁，0.11-0.15％二水合氯化钙，0.0009-0.0011％盐酸硫胺，1.5-1.8％kirk微量元素溶液。

所述kirk微量元素溶液包括以下重量比组分：0.8-1％nitrilotriacetate，0.2-0.4％七水合硫酸镁，0.3-0.5％一水硫酸锰，0.5-0.7％氯化钠，0.04-0.07％七水合硫酸亚铁，0.09-0.12％七水合硫酸钴，0.09-0.12％七水合硫酸锌，0.05-0.07％二水合氯化钙，0.005-0.007％五水合硫酸铜，0.009-0.012％十二水合硫酸铝钾，0.005-0.007％硼酸，0.006-0.008％二水合钼酸钠。

优选地，所述液体培养的液体培养基包括以下重量份的组分：10份葡萄糖，0.221份酒石酸铵，1.64份无水乙酸钠和100份kirk盐溶液。

优选地，所述kirk盐溶液包括以下重量百分比的组分：2％磷酸二氢钾，0.5％七水合硫酸镁，0.13％二水合氯化钙，0.001％盐酸硫胺，1.67％kirk微量元素溶液。

所述kirk微量元素溶液包括以下重量比组分：0.9％nitrilotriacetate，0.3％七水合硫酸镁，0.42％一水硫酸锰，0.6％氯化钠，0.06％七水合硫酸亚铁，0.11％七水合硫酸钴，0.11％七水合硫酸锌，0.06％二水合氯化钙，0.006％五水合硫酸铜，0.011％十二水合硫酸铝钾，0.006％硼酸，0.007％二水合钼酸钠。

优选地，所述白腐真菌(yk-624)进行液体培养方法是：取在土豆葡萄糖琼脂培养基(pda)培养基上活化的白腐真菌菌丝片接种在所述液体培养基，24～30℃进行液体培养，其中，所述土豆葡萄糖琼脂培养基包括以下组分：土豆20％，葡萄糖2％，琼脂2％。

优选地，步骤(2)中所述静置温度为30℃。

优选地，步骤(1)中培养的时间为3～5天。

优选地，步骤(1)中液体培养的温度为24-30℃。

优选地，所述呋虫胺在液体培养基中的浓度为0.05-0.15mmol/l。

优选的，步骤(2)中所述静置的时间为20天以上。

发明人将降解后的液体培养基与白腐真菌分离，向分离后的液体中加入乙酸乙酯萃取，得到上清液；浓缩上清液，并用硅胶色谱法进行梯度洗脱、制备液相色谱进一步分离纯化，得到高纯度的一种化合物。

所述化合物经质谱、核磁鉴定，结构式如式(ⅰ)所示：

分子式c7h12n4o3，分子量200，命名为：n-((4as，7as，e)-1-甲基六氢呋喃[2,3-d]嘧啶-2(1h)-亚基)硝酰胺，英文命名为：n-((4as,7as,e)-1-methylhexahydrofuro[2,3-d]pyrimidin-2(1h)-ylidene)nitramide。

本发明还提供一种降解水中呋虫胺的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将白腐真菌进行液体培养；

(2)将液体培养后的白腐真菌及液体培养基加入到含有呋虫胺的水中，混匀，保持水温24～30℃。

所述液体培养的液体培养基包括以下重量份的组分：9-11份葡萄糖，0.2-0.3份酒石酸铵，1.5-1.7份无水乙酸钠和95-105份kirk盐溶液。

所述方法可以预防或解决水环境中呋虫胺的积累，防止呋虫胺对水环境的污染。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种降解呋虫胺的方法，发明的方法利用白腐真菌(yk-624)对呋虫胺进行降解，降解效率达到31％，对降解的产物进行了定性分析，制备了一种新的化合物，n-((4as，7as，e)-1-甲基六氢呋喃[2,3-d]嘧啶-2(1h)-亚基)硝酰胺。所述降解水中呋虫胺的方法可以预防或解决水环境中呋虫胺的积累，防止呋虫胺对水环境的污染。

附图说明

图1为n-((4as，7as，e)-1-甲基六氢呋喃[2,3-d]嘧啶-2(1h)-亚基)硝酰胺的结构式图。

图2为n-((4as，7as，e)-1-甲基六氢呋喃[2,3-d]嘧啶-2(1h)-亚基)硝酰胺的质谱图。

图3为n-((4as，7as，e)-1-甲基六氢呋喃[2,3-d]嘧啶-2(1h)-亚基)硝酰胺的¹h-nmr(cd3od)图。

图4为n-((4as，7as，e)-1-甲基六氢呋喃[2,3-d]嘧啶-2(1h)-亚基)硝酰胺的¹³c-nmr(cd3od)图。

图5为n-((4as，7as，e)-1-甲基六氢呋喃[2,3-d]嘧啶-2(1h)-亚基)硝酰胺抑制人骨髓神经母细胞瘤细胞株sh-sy5y的效果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行具体说明，但不限于此。

实施例1

1.实验材料

将白腐真菌yk-624(phanerochaetesordidayk-624)用土豆葡萄糖琼脂培养基(pda，成分：土豆20％，葡萄糖2％，琼脂2％)进行传代扩大培养，4℃冰箱内保存备用。

2.本发明的一种降解呋虫胺的方法的实施例，所述方法包括以下步骤：

(1)取在pda培养基上活化的两片直径10mm的白腐真菌(yk-624)菌丝片30℃下进行液体培养；

(2)将液体培养后的白腐真菌及液体培养基与呋虫胺混合，呋虫胺在液体培养基中的浓度为0.1mmol/l，30℃静置20天。

所述液体培养的液体培养基包括以下重量份的组分：10份葡萄糖，0.221份酒石酸铵，1.64份无水乙酸钠和100份kirk盐溶液。

所述kirk盐溶液包括以下重量百分比的组分：2％磷酸二氢钾，0.5％七水合硫酸镁，0.13％二水合氯化钙，0.001％盐酸硫胺，1.67％kirk微量元素溶液。

所述kirk微量元素溶液包括以下重量比组分：0.9％nitrilotriacetate，0.3％七水合硫酸镁，0.42％一水硫酸锰，0.6％氯化钠，0.06％七水合硫酸亚铁，0.11％七水合硫酸钴，0.11％七水合硫酸锌，0.06％二水合氯化钙，0.006％五水合硫酸铜，0.011％十二水合硫酸铝钾，0.006％硼酸，0.007％二水合钼酸钠。

(3)静置完成后，液相色谱法定量检测降解结果。

向静置完成后的培养液中添加内标物，加入20-30ml丙酮，用均质机将菌体打碎均质，得到匀浆，过滤后旋转蒸发浓缩，得到上样液。上样液进入高效液相色谱法(hplc，色谱柱：inertsilods-35μm4.6×250mm)分析。

结果表明，在kirk培养基中白腐真菌20天能够降解31％的呋虫胺。

实施例2

降解产物的定性分析。

(1)将静置后液体培养基与白腐真菌分离，向分离后的液体中加入等体积乙酸乙酯萃取3次，合并上清液；

(2)选装蒸发浓缩上清液，并用硅胶色谱法进行梯度洗脱，薄层色谱法进行代谢产物的跟踪；

(3)硅胶色谱分离得到的产物通过制备液相色谱进一步分离纯化。

所述制备色谱的色谱柱的型号为：inertsilc30s-select5m20x250mm。

(4)通过esi-tof-ms分析，其质谱图[m-h]^-如图2所示，[m-h]^-＝199.02知化合物的分子量为200。

(5)通过核磁共振波谱分析，其在cd3od中的氢谱图如图3所示，其在cd3od中的碳谱图如图4所示。对氢谱图位移响应的分析和对碳谱图位移响应的分析，结果如表1所示。

表1

通过对化合物¹h-nmr(cd3od)谱图和¹³c-nmr(cd3od)谱图及质谱图的分析，确认制备得到的化合物的结构式如下：

分子式c7h12n4o3，分子量200，命名为：n-((4as，7as，e)-1-甲基六氢呋喃[2,3-d]嘧啶-2(1h)-亚基)硝酰胺，英文命名为：n-((4as,7as,e)-1-methylhexahydrofuro[2,3-d]pyrimidin-2(1h)-ylidene)nitramide(phpf)。

实施例3

作为本发明的一种降解水中呋虫胺的方法的一个实施例，所述方法包括以下步骤：

(1)将白腐真菌进行液体培养；

(2)将液体培养后的白腐真菌及液体培养基加入到含有呋虫胺的水中，混匀，保持水温30℃。

所述液体培养的液体培养基包括以下重量份的组分：10份葡萄糖，0.221份酒石酸铵，1.64份无水乙酸钠和100份kirk盐溶液。

所述kirk盐溶液包括以下重量百分比的组分：2％磷酸二氢钾，0.5％七水合硫酸镁，0.13％二水合氯化钙，0.001％盐酸硫胺，1.67％kirk微量元素溶液。

所述kirk微量元素溶液包括以下重量比组分：0.9％nitrilotriacetate，0.3％七水合硫酸镁，0.42％一水硫酸锰，0.6％氯化钠，0.06％七水合硫酸亚铁，0.11％七水合硫酸钴，0.11％七水合硫酸锌，0.06％二水合氯化钙，0.006％五水合硫酸铜，0.011％十二水合硫酸铝钾，0.006％硼酸，0.007％二水合钼酸钠。

(3)降解效果检测

取降解反应20天的水样及降解开始前的水样，用液相色谱法检测。结果表明，所述方法20天的时间对水中呋虫胺的降解效率达到了31％。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。