专利名称：大鼠多动症动物模型的构建方法
技术领域：
本发明属于医疗评价、检测技术领域，具体涉及一种用于筛选治疗多动症药物、评价治疗多动症方法的动物模型构建方法。
然而，ADHD病理机制仍然还有许多不明之处，有待于我们进行深入研究，特别是现阶段还没有理想的ADHD动物模型，给彻底了解ADHD病理机制以及完全治疗ADHD带来了很大的困难。如果建立起理想的ADHD大鼠的动物模型，将有利于我们研究ADHD病理机制，有利于我们大规模筛选治疗ADHD的新药(如筛选治疗ADHD的中草药)，评价治疗ADHD的方法，这不仅有重要的理论价值，也有着潜在的应用前景。
现在一般认为，ADHD的产生与人或动物的行为抑制功能低下有关。行为抑制功能为人或动物的行为(特别是较复杂行为)提供保护框架。如果抑制功能低下，人或动物将不能抑制无关的信息(包括外来的和内在的)引起的行为，导致注意力不集中、活动增多等症状，严重时将导致ADHD。神经心理学的研究表明，前额叶皮层在行为抑制中起着关键的作用。大鼠前额叶去甲肾上腺素被耗竭后，其注意力特别容易受干扰，运动量也增多。
动物和临床研究表明，α2受体激动剂有可能是治疗ADHD的有效药物。临床研究已开始用α2受体激动剂clonidine来治疗ADHD。应用选择性更强的α2A激动剂guanfacine，不仅能有效的控制ADHD的症状，还可以避免使患者产生低血压和镇静等由clonidine治疗所产生的副作用。
本发明提出的大鼠多动症动物模型构建方法，是通过在大鼠前额叶局部区域微量注射α2受体的特异性拮抗剂yohimbine(育亨宾)，以阻断α2受体的功能，直接诱导出大鼠的多动症，其步骤如下1、脑外科手术选取适当的大鼠，麻醉后通过脑外科手术在大鼠前额叶双侧埋管，引导管插入颅骨下1.0mm左右，引导管长为8-12mm，直径0.2-0.6mm，手术完成后用配套的钢管芯子插入引导管；2、给药手术4-5天后，通过两侧的引导管给大鼠脑部微量给药。给药深度为2.0-2.5mm。每侧给药为1微升左右，药的浓度为0.1-2.0μg/μl，用灭菌生理盐水配制；3、旷场行为检测给药30分钟左右后，把大鼠放进旷场行为检测盒，检测盒的底部用线条均分成若干方格(如
图1)，每格尺寸为15cm×0.15cm，使大鼠在盒中自由活动，大鼠前后肢在水平方向连续跨过一条线记为水平活动一次，前肢竖起、后肢站立一次记为垂直活动一次用摄像机记录大鼠在30分钟内的活动情况，计数单位时间内大鼠水平活动量和垂直活动量；4、数据分析根据单位时间段内大鼠的水平和垂直活动量，作出活动量对时间段的分布图；同时，计算30分钟内的总活动量。比较yohimbine组和生理盐水组大鼠的总活动量，用非配对的t检验，对大鼠活动量进行统计分析。
根据上述实验步骤，对不同周龄组的大鼠进行分析对比，实际试验结果证明，前额叶注射α2受体拮抗剂yohimbine后，大鼠在旷场中的活动量明显增加，并且yohimbine对大鼠活动量的影响表现出明显的剂量效应关系。从而说明本发明以实验手段在大鼠上建立了多动症动物模型，该模型可以用于筛选治疗多动症的药物，评价治疗多动症的方法。
选择SD大鼠，雄性，断奶鼠(出生第21天)，从复旦大学医学院动物中心购得。动物购回后，随机分组，分笼饲养。饲养期间保持安静舒适的环境，让其自由饮水和进食。手术后，实验开始前的两天实验者每天上下午各抚摸、抓握大鼠一次，并让大鼠适应实验装置及所用仪器，以求尽可能排除实验环境对大鼠造成的应激刺激、确保实验结果的准确性。
1.脑外科手术动物称重后，腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg体重)麻醉。将动物头部固定，剪开头部皮肤，暴露颅骨，以前囱点(Bregma)0点作为参考点，确定埋管位点(Bregma+3.2mm，左右旁开1mm)，双侧埋管，引导管长10mm，直径0.4mm。引导管插入颅骨下1.0mm。手术钻孔时，不可伤及硬脑膜。手术完成后用配套的钢管芯子插入引导管。实验结束后，对注射位点进行组织学切片检查。
2.给药手术5天后，通过引导管微量给药。注药管内径为0.2mm，每侧给药体积为1微升(浓度0.1-2.0μg/1μl)。整个给药时间约需3分钟左右，给药结束后等2分钟左右，然后拔出注药管。注药管比引导管长1.0-1.5mm。注射所用的药品yohimbine(Sigma公司产品)用灭菌生理盐水配制。
3.旷场行为检测旷场行为检测盒为一45cm×30cm×20cm白色塑料筐，底部画三条线等分隔成6格，每小格为15cm×15cm(见图1)。大鼠放入旷场中，自由活动。前后肢连续跨过一条线记为水平活动一次，前肢竖起、后肢站立一次记为垂直活动一次。打药30分钟后将大鼠放入旷场行为检测盒中，用摄像机记录其活动情况，计数单位时间(以5分钟为一单位)内大鼠水平活动量(爬格次数)和垂直活动量(站立次数)，将大鼠在30分钟内活动情况的摄像记录作离线分析。
4.数据分析每5分钟计数该时间段内大鼠的水平和垂直活动量，作出活动量对时间段的分布图；同时，计算30分钟内的总活动量。比较yohimbine组和生理盐水组大鼠的总活动量，用非配对的t检验，对大鼠活动量进行统计分析。
对上述模型的测试结果1)4周龄组大鼠4周龄组大鼠在出生后第23天接受手术，第28天接受yohimbine(1.0μg/μl)或生理盐水注射。注射后30分钟，将大鼠放入旷场行为检测盒中进行测试。从水平活动的情况来看，大鼠刚进入旷场的第1个5分钟内，yohimbine组和生理盐水组的活动次数都比较多，但yohimbine组的活动量(50.2±3.8次，n＝7)显著高于生理盐水组(30.0±2.9次，n＝6，p＜0.001)。从第2个5分钟开始，活动量逐渐减少，但yohimbine组的活动量在每一时间段都多于生理盐水组。两组在30分钟内的水平活动总量分别为98.2±12.1次和65.1±7.9次(p＜0.001)。垂直活动的情况与水平活动的情况类似。第1个5分钟内，yohimbine组的活动量(34.2±5.6次，n＝7)显著地高于生理盐水组(18.7±3.6次，n＝6；p＜0.05)。两组在30分钟内的垂直活动总量分别为78.6±13.2次(n＝7)和45.5±9.2次(n＝6，p＜0.001)。
2)6周龄组大鼠6周龄大鼠在出生第37天接受手术，第42天注射yohimbine或生理盐水。共注射了4种剂量的yohimbine(YOH I组，2.0μg/μl；YOH II组，1.0μg/μl；YOHIII组，0.5μg/μl和YOHIV组，0.1μg/μl)。注射后30分钟，将大鼠放入旷场行为检测盒中进行测试。
从水平活动的情况来看，第1个5分钟内，4种剂量的yohimbine组的活动次数分别为52.2±5.3次、53.3±5.5次、36.3±3.3次、34.0±5.1次；生理盐水组的活动次数为36.9±2.7次。高剂量yohimbine组(I、II组)的活动量高于生理盐水组(YOH I组，p＜0.001；YOH II组，p＜0.001，unpaired t-test)，低剂量yohimbine组(III、IV组)的活动量与生理盐水组没有显著性差别(YOHIII组，p＞0.05；YOHIV组，p＞0.05；unpaired t-test)。5组大鼠在30分内的水平活动总量分别是129.0±7.3次、131.8±6.6次、87.0±2.6次、82.8±6.1次和83.3±3.1次。高剂量yohimbine组(I、II组)在30分钟内的水平活动总量高于生理盐水组(YOH I组，p＜0.001；YOHII组，p＜0.001，unpaired t-test)，低剂量yohimbine组(III、IV组)的水平活动总量与生理盐水组没有显著差异(YOHIII组，p＞0.05；YOHIV组，p＞0.05；unpairedt-test)。Yohimbine对旷场行为水平活动量的影响，无论是第5分钟的活动量还是30分钟的总活动量均表现出明显的剂量效应关系。
就垂直活动的情况来看，第1个5分钟内，高剂量yohimbine组(I、II组)的活动量显著高于生理盐水组(YOH I组，p＜0.01；YOH II组，p＜0.01；unpaired t-test)，低剂量YOH组(III、IV组)的活动量与生理盐水组没有显著差别(YOHIII组，p＞0.05；YOHIV组，p＞0.05；unpaired t-test)。Yohimbine对垂直活动量的影响也表现出明显的剂量效应关系。4种剂量yohimbine组在30分钟内的垂直活动总量分别是96.5±3.2次、99.7±7.4次、66.7±2.4次和62.2±2.7次。高剂量yohimbine组(I、II组)的活动量显著地高于生理盐水组(YOH I，p＜0.001；YOH II组，p＜0.001，unpaired t-test)，而低剂量YOH组(III、IV组)的垂直活动总量分别是64.2±4.5次和36.7±3.5次，与生理盐水组没有显著差别(YOHIII组，p＞0.05；YOHIV组，p＞0.05，unpaired t-test)。
3)8周龄组大鼠8周龄大鼠在出生第51天接受手术，第56天注射yohimbine或生理盐水。我们选择了两种yohimbine剂量(1.0μg/μl和0.5μg/μl)。从水平活动的情况来看，第1个5分钟内，3组大鼠的活动次数都很多，高剂量yohimbine组的活动量(51.5±2.2次)显著地高于生理盐水组(43.2±4.8次)(p＜0.001，unpaired t-test)，而低剂量yohimbine组的活动量(39.2±4.5次)与生理盐水组没有显著性差别(p＞0.05，unpaired t-test)。30分钟内，3组大鼠的水平活动总量分别是131.5±5.8次、75.3±5.3次和72.0±5.4次，高剂量yohimbine组的活动量高于生理盐水组(p＜0.001，unpaired t-test)，而低剂量yohimbine组(III、IV组)的活动量与生理盐水组没有显著差别(p＞0.05，unpaired t-test)。垂直活动的情况是第1个5分钟内，3组大鼠的活动量分别为30.7±1.5次、21.2±1.3次和20.6±1.6次。同样地，高剂量yohimbine组的活动量显著地高于生理盐水组(p＜0.001，unpaired t-test)，而低剂量yohimbine组的活动量与生理盐水组比较没有显著差别(p＞0.05，unpaired t-test)。
4)10周龄组大鼠10周龄大鼠在出生第65天接受手术，第70天注射yohimbine或生理盐水。我们仍然选择了2种yohimbine剂量(1.0μg/μl组和0.5μg/μl组)。水平活动的情况为在第1个5分钟和总共观察的30分钟内，高剂量yohimbine组的活动量是56.3±5.5次和140.3±9.5次，显著地高于生理盐水组(40.5±2.8次和86.7±6.9次；p＜0.001，unpaired t-test)，而低剂量yohimbine组的活动量(43.7±4.0次和98.2±16.1次)与生理盐水组没有显著差别(p＞0.05，unpaired t-test)。垂直活动的情况与水平活动相似第1个5分钟和总共观察的30分钟内，高剂量yohimbine组的活动量(35.3±3.0次和94.2±6.5次)显著地高于生理盐水组(20.3±2.1次和52.2±3.2次)(p＜0.001，unpaired t-test)，而低剂量yohimbine组的活动量(22.5±2.6次和58.7±10.8次)与生理盐水组没有显著差别(p＞0.05，unpaired t-test)。
权利要求
1.一种大鼠多动症动物模型的构建方法，其特征在于通过在大鼠前额叶局部区域微量注射α2受体的特异性拮抗剂yohimbine，以阻断α2受体的功能，直接诱导出大鼠的多动症，其步骤如下(1)脑外科手术选取适当的大鼠，麻醉后通过脑外科手术在大鼠前额叶双侧埋管，引导管插入颅骨下1.0mm左右，引导管长为8-12mm，直径0.2-0.6mm，手术完成后用配套的钢管芯子插入引导管；(2)给药手术4-5天后，通过两侧的引导管给大鼠脑部微量给药，给药位点深度为2.0-2.5mm，每侧给药为1微升左右，药的浓度为0.1-2.0μg/μl，用灭菌生理盐水配制；(3)旷场行为检测给药30分钟后，把大鼠放进旷场行为检测盒，检测盒的底部用线条均分成若干方格，使大鼠在盒中自由活动，大鼠前后肢在水平方向连续跨过一条线记为水平活动一次，前肢竖起、后肢站立一次记为垂直活动一次，用摄像机记录大鼠在30分钟内的活动情况，计数在单位时间内大鼠水平活动量和垂直活动量；(4)数据分析根据单位时间段内大鼠的水平和垂直活动量，作出活动量对时间段的分布图；同时，计算30分钟内的总活动量，比较yohimbine组和生理盐水组大鼠的总活动量，用非配对的t检验，对大鼠活动量进行统计分析。
全文摘要
本发明属于医疗评价、检测技术领域,具体涉及一种用于筛选治疗多动症药物、评价治疗多动症方法的大鼠动物模型的构建方法。通过在大鼠前额叶局部区域微量注射α
文档编号G09B23/36GK1379374SQ0211148
公开日2002年11月13日 申请日期2002年4月25日 优先权日2002年4月25日
发明者李葆明, 马朝林, 徐开静 申请人:复旦大学