专利名称：显微镜及聚焦方法
技术领域：
本发明涉及显微镜及聚焦方法。
背景技术：
众所周知，存在一种在更换物镜的操作中自动执行控制的电操作显微镜。该控制包括对聚光透镜、视场光阑、孔径光阑、用于在物镜光轴方向上驱动样品台的机构、滤波器及用于调节光源产生的光的电源进行调节。细节参见作为专利文献1的日本专利公开第 Hei 11-133311 号。
发明内容
顺便地，当使用显微镜观察多个样品时，通过使用在厚度方向上具有差异的盖玻片和载玻片来制备该样品。因此，如果在将照明光投射至样品的操作中作为照明目标的样品位于某个位置，则照明目标与物镜之间的光程会因为载玻片厚度变化而发生不期望的改变。结果，设置在照明光学系统中的照明视场光阑在光轴方向上在与样品表面的观察位置分离的位置处形成图像，引起包括图像对比度劣化的问题。在包括专利文献1所披露显微镜的现有显微镜中，焦点调节通常执行如下。收缩视场光阑校正环，调节照明光学系统中采用的聚光透镜的光轴方向位置，用眼观察或在摄像元件处观察视场光阑校正环边缘的成像状态并进行调节。但是，为了构建能够自动观察多个样品的系统，需要自动为系统提供自动高速地对照明视场光阑执行焦点调节的能力。本发明欲解决上面的问题，则需要提供能够对照明视场光阑自动执行焦点调节的显微镜及聚焦方法。为了解决上述问题，提供了根据本发明实施方式的显微镜。该显微镜采用照明光学系统，设有照明视场光阑以及作为被配置为将照明光投射至镜台上所放置的样品的光学系统的一个或多个照明光学元件；第一成像光学系统，设有被配置为基于透过样品的透射光来获取图像的第一摄像元件以及被配置为基于透射光在第一摄像元件上使该图像成像的一个或多个第一光学元件；第二成像光学系统，设有被配置为将第一成像光学系统中传播的透射光进行分离以从透射光中获取部分光束的光束分离部、被配置为基于该部分光束获取相差图像的第二摄像元件以及被配置为基于该部分光束在第二摄像元件上使相差图像成像的一个或多个第二光学元件；照明视场光阑焦点调节部，被配置为调节使照明视场光阑的图像成像的成像位置；以及特征量计算块，被配置为根据由第二摄像元件所生成的输出信号来计算表示照明视场光阑的焦点偏移度的特征量。照明视场光阑焦点调节部根据特征量计算块所计算的特征量来调节照明视场光阑的成像位置。相差图像包括根据照明视场光阑的形状成像在第二摄像元件上的第一和第二图像。特征量计算块可以通过使用在第二摄像元件上各个像素上的第一图像的输出信号与第二图像的输出信号之间的强度差来计算特征量。
期望特征量计算块在透过样品的透射光没有被聚焦在第一摄像元件的状态下计算特征量。期望照明光的强度被调节成使得成像在第二摄像元件上的相差图像的输出信号的强度处于饱和状态。可将显微镜构造成这种结构，其中，显微镜进一步采用位置控制部，被配置为控制镜台的位置；以及厚度变化量计算块，被配置为计算装载有样品的载玻片的厚度变化量。 相差图像包括根据照明视场光阑的形状成像在第二摄像元件上的第一图像和第二图像。厚度变化量计算块通过使用第二摄像元件的各个像素上的第一图像的输出信号与第二图像的输出信号之间的强度差来计算厚度变化量。位置控制部根据由厚度变化量计算块所计算的厚度变化量将镜台的位置朝着照明光学系统移动。可将显微镜构造成这种结构，其中，显微镜进一步采用位置控制部，被配置为控制镜台的位置；以及厚度变化量计算块，被配置为计算装载有样品的载玻片的厚度变化量。 相差图像包括根据照明视场光阑的形状成像在第二摄像元件上的第一图像和第二图像。厚度变化量计算块通过使用在合焦状态下所获取的第一图像与在实际状态下所获取的第一图像之间的边缘位置差和/或在合焦状态下所获取的第二图像与在实际状态下所获取的第二图像之间的边缘位置的差值来计算厚度变化量。位置控制部根据由厚度变化量计算块计算的厚度变化量将镜台的位置朝着照明光学系统移动。厚度变化量计算块可以针对第一图像或第二图像根据第一图像或第二图像中的照明视场光阑的形状所在一侧的边缘位置来计算厚度变化量。厚度变化量计算块可以针对第一图像和第二图像的每一个根据第一图像和第二图像中的每一个中照明视场光阑的形状所在一侧的边缘位置来计算厚度变化量。厚度变化量计算块可以针对第一图像和第二图像中的每一个根据第一图像和第二图像中的每一个中照明视场光阑的形状所在的两侧的边缘位置的和来计算厚度变化量。特征量计算块可以通过使用输出信号的边缘位置来计算特征量。可将显微镜构造成这种结构，其中，显微镜进一步采用亮度校正块，被配置为校正成像在第一摄像元件上的图像的亮度。亮度校正块使用预先准备的作为在亮度校正中使用的模式的亮度校正模式，在照明视场光阑焦点调节部调节了照明视场光阑的成像位置以使照明视场光阑的图像处于合焦状态之后，校正在第一摄像元件上成像的图像的亮度。可将显微镜构造成这种结构，其中，显微镜进一步采用亮度校正块，被配置为校正成像在第一摄像元件上的图像的亮度。亮度校正块根据计算出的载玻片厚度变化量从均预先设定的作为亮度校正中要使用的模式的多个亮度校正模式中选择一个，并且使用所选择的亮度校正模式对图像的亮度进行校正。为了解决上述问题，提供了根据本发明另一个实施方式的聚焦方法。该聚焦方法包括对作为具有照明视场光阑的照明光学系统所投射的部分照明光并且已透过镜台上所放置的样品的透射光进行分离以获得来自透射光的部分光束，并且使摄像元件基于部分光束获取相差图像；根据摄像元件所生成的输出信号来计算表示照明视场光阑的焦点偏移度的特征量；并且根据所计算的特征量来驱动照明视场光阑焦点调节机构以调节照明视场光阑成像的成像位置。根据本发明，能够自动执行照明视场光阑的焦点调节。
图1是示出根据本发明第一实施方式的显微镜的结构的说明图；图2是示出根据同一实施方式的整体控制部的结构的框图；图3是粗略示出在根据同一实施方式的显微镜中所采用的光学系统的说明图；图4是粗略示出在根据同一实施方式的显微镜中所采用的光学系统的另一个说明图；图5A是示出载玻片的厚度与照明视场光阑的图像被成像的成像位置之间的关系的说明图；图5B是示出载玻片的厚度与照明视场光阑的图像被成像的成像位置之间的关系的另一说明图；图6是在对示出照明视场光阑的焦点偏移度的特征量公式化中所使用的参数的描述中要参照的说明图；图7是在示出照明视场光阑的焦点偏移度的特征量的公式化中所使用的参数的描述中要参照的另一个说明图；图8A至图8C是在描述用于检测相差图像上的照明位置的方法中要参照的说明图；图9是在描述根据同一实施方式的聚焦方法中要参照的说明图；图10是在描述根据本发明第二实施方式的聚焦方法中要参照的说明图；图11是在描述根据同一实施方式的聚焦方法中要参照的另一说明图；图12是在描述根据同一实施方式的聚焦方法中要参照的再一说明图；图13是在描述根据同一实施方式的聚焦方法中要参照的又一说明图；以及图14是在描述根据同一实施方式的聚焦方法中要参照的又一说明图。
具体实施例方式通过参照如下附图详细说明本发明的优选实施方式。需要注意的是，在本发明的此说明书和附图中，用相同的参考符号表示具有基本上相同功能结构的结构元件，并且为了避免重复描述，对由相同参考符号表示的结构元件仅说明一次。还应注意的是，以按如下顺序排列的章节来说明实施方式。(1)第一实施方式(1-1)显微镜的结构(1-2)照明视场光阑的焦点调节处理(1-3)调节镜台位置的处理(1-4)校正亮度不均勻性的处理(1-5)典型变形例(第一实施方式)<显微镜的结构>首先，参照图1说明根据本发明第一实施方式的显微镜1的结构。图1是示出根据第一实施方式的显微镜1的结构的说明图。
[整体结构]如图1中所通常示出的，根据第一实施方式的显微镜1采用缩略图像成像部10和放大图像成像部20。缩略图像成像部10获取生物样品SPL被放置在其上的整个制备玻片 PRT的图像。在下面的描述中，整个制备玻片PRT的图像被称作缩略图像。放大图像成像部 20通过以预先所确定的放大倍率放大图像来获取生物样品SPL的图像。在下面的描述中， 以放大倍率被放大的图像简称放大图像。另外，放大图像成像部20设置有用于检测存在于放大图像成像部20中的照明视场光阑的散焦量的散焦量检测部30。制备玻片PRT是通过采用预先确定的固定技术被固定在载玻片上的生物样品 SPL0生物样品SPL可以为组织切片或涂抹细胞。组织可以是血液等的联络组织、上皮组织、 或联络组织和上皮组织两种。如果需要，可将各种染色法的其中任意一种应用于组织切片或涂抹细胞。各种染色法包括普通染色法和荧光染色法。普通染色法的典型实例为HE (苏木精-曙红)染色法、吉式(Giemsa)染色法及柏式(Papanicolaou)染色法。荧光染色法的典型实例为FISH(荧光原位杂交)法和氧抗体法。另外，在制备玻片PRT上黏贴标签。标签示出用于识别制备玻片PRT的生物样品 SPL的特定信息。该特定信息包括制备样品者的姓名、样品获取时间和样品获取日期以及染色法类型。根据此实施方式的显微镜1还设置有镜台40，该镜台上安装了与上述制备玻片 PRT类似的制备玻片PRT。另外，显微镜1还设置有用于在各个方向上移动镜台40的镜台驱动机构41。更具体地，镜台驱动机构41能够在平行于镜台40表面的方向上以及垂直于表面的方向上以很高的自由度移动镜台40。平行于镜台40表面的方向被称作X轴和Y轴方向，而垂直于表面的方向被称作Z轴方向。另外，放大图像成像部20设置有作为典型照明视场光阑焦点调节部的聚光透镜驱动机构42。[缩略图像获取部]如图1所示，缩略图像成像部10设置有诸如光源11、物镜12及摄像元件13的主要组件。光源11相对于镜台40被设置在与制备玻片PRT相对的一侧。光源11能够投射亮视场照明光或暗视场照明光，并从一种光切换至另一种。亮视场照明光是用于照明已经经受普通染色的生物样品SPL的光。亮视场照明光也被简称为视场照明光。另一方面，暗视场照明光是用于照明已经经受特殊染色的生物样品SPL的光。另外，光源11也可以是能够投射亮视场照明光或暗视场照明光的光源。在这种情况下，设置两个光源11。两个光源 11的其中一个能够投射亮视场照明光，而另一个光源能够投射暗视场照明光。除此之外，缩略图像成像部10也可以具有分开设置的标签光源。图1中未示出的标签光源投射用于获取写在被黏贴在制备玻片PRT上的标签上的特定信息的图像的光。具有预先确定的放大倍率的物镜12采用与镜台40的制备玻片放置表面正交并通过缩略图像成像部10中心的线作为光轴SRA。物镜12关于镜台40被设置在与制备玻片 PRT相同的一侧。透过被放在镜台40的制备玻片放置表面上的制备玻片PRT的透射光被物镜12会聚，在物镜12后面设置的摄像元件13上成像。表述为“在物镜12后面设置的摄像元件13”的陈述意味着摄像元件13被设置在光传播方向上与物镜12分开的位置处。
覆盖了镜台40的制备玻片放置表面上所放置的整个制备玻片PRT的在摄像范围中的光在摄像元件13上成像。换句话说，透过制备玻片PRT的透射光在摄像元件13上成像。在摄像元件13上成像的图像是作为获取整个制备玻片PRT的图像的操作结果而获取的显微图像的缩略图像。[放大图像获取部]如图1所示，放大图像成像部20设置有包括光源21、聚光透镜22、物镜23及摄像元件M的主要组件。另外，放大图像成像部20还设置有在图中未示出的照明视场光阑。光源21投射亮视场照明光。光源21关于镜台40被设置在与制备玻片PRT相对的一侧。另外，用于生成暗视场照明光的另一个光源关于镜台也设置在与制备玻片PRT相对的一侧，但在与光源21不同的位置处。图1中未示出此另一个光源。聚光透镜22是用于会聚由光源21投射的亮视场照明光以及由用于生成暗视场照明光的另一个光源投射的暗视场照明光并将会聚的亮视场照明光以及会聚的暗视场照明光导向镜台40上放置的制备玻片PRT的透镜。聚光透镜22采用与镜台40的制备玻片放置表面正交并穿过放大图像成像部20中心的线作为光轴ERA。聚光透镜22被设置在光源 21与镜台40之间。聚光透镜驱动机构42能够驱动聚光透镜22在光轴ERA的方向上移动。 即，聚光透镜驱动机构42能够改变聚光透镜22在光轴ERA上的位置。具有预先确定的放大倍率的物镜23采用与镜台40的制备玻片放置表面正交并穿过放大图像成像部20的中心的线作为光轴ERA。物镜23关于镜台40被设置在与制备玻片 PRT相同的一侧。通过适当更换放大图像成像部20中使用的物镜23，能够以各种放大倍率放大并获取生物样品SPL的图像。透过被放置在镜台40的制备玻片放置表面上的制备玻片PRT的透射光被物镜23会聚，在物镜23后面设置的摄像元件M上成像。表述为“在物镜23的后面设置的摄像元件M”的陈述意味着摄像元件M被设置在光传播方向上与物镜 23分开的位置处。应当注意的是，光束分离器31设置在物镜23与摄像元件M之间的光轴ERA上。 透过物镜23的部分透射光被光束分离器31导向包括稍后描述的光束分离器31的散焦量检测部30的内部。根据摄像元件M的像素大小和物镜23的放大倍率，在摄像元件M上对在镜台40 的制备玻片放置表面上摄像范围内的图像进行成像。摄像范围具有预先确定的宽度以及也被预先确定的高度。应当注意的是，由于物镜23放大了生物样品SPL的一部分，所以摄像范围与摄像元件13上的摄像范围相比非常小。在图1中所示的结构中，用作光轴SRA的穿过缩略图像成像部10的中心位置的法线与用为光轴ERA的穿过放大图像成像部20的中心位置的法线在Y轴方向上偏离了距离 D。距离D被设定为这样一个足够大的值使得用于支撑放大图像成像部20的物镜23的镜筒(未示出)不会被投影在摄像元件13的摄像范围上。但是，距离D可小到足以使得显微镜1的尺寸减小。[散焦量检测部]如图1所示，散焦量检测部30采用包括光束分离器31、聚光透镜32、双目镜33及摄像元件；34的主要组件。如之前所说明的一样，光束分离器31被设置在放大图像成像部20中采用的物镜23与摄像元件M之间的光轴ERA上，并且透过物镜23的一部分透射光被光束分离器31导向包括光束分离器31的散焦量检测部30的内部。换句话说，光束分离器31将透过物镜23 的透射光分离成向摄像元件M传播的透射光和向散焦量检测部30 (稍后进行描述)中所采用的聚光透镜32传播的反射光。S卩，聚光透镜32被设置在由于光束分离器31执行的分离而获取的反射光的传播方向上与光束分离器31分开的位置处。聚光透镜32将由于光束分离器31执行的分离而获取的反射光会聚成光束，并将光束导向在被定义为反射光传播方向的后向方向上在与光束分离器31分开的位置处所设置双目镜33。双目镜33将来自聚光透镜32的光束分离成两个光束。两个光束在被定义为反射光的传播方向的后向方向上在与双目镜33分开的位置处所设置的摄像元件34的成像表面上形成一组观察目标图像。即，穿过双目镜33中的每一个的光在摄像元件34的成像表面上成像。结果，一对观察目标图像被成像在摄像元件34的成像表面上。由于穿过聚光透镜32的在各个方向上的光束到达双目镜33，所以在摄像元件34的成像表面上成像的观察目标图像之间存在相差。在随后的描述中，这对观察目标图像被称作相差图像。根据此实施方式的散焦量检测部30通过使用此相差来检测存在于放大图像成像部20中的照明视场光阑的散焦量。上面的描述说明了一种结构，其中，光束分离器31被放置在物镜23与摄像元件M 之间。但是，用于分离光束的光束分离部不必一定是光束分离器31。例如，可移动反射镜也能够被用作光束分离部。另外，在缩略图像成像部10、放大图像成像部20及散焦量检测部30的每一个中所采用的摄像元件可以为一维摄像元件或二维摄像元件。需要注意，对放大图像成像部20和散焦量检测部30再次详细地作如下说明。[控制部]如图1所示，根据此实施方式的显微镜1采用用于控制显微镜1中所包括的多个组件的多个控制部。具体而言，根据此实施方式的显微镜1采用用于控制显微镜1中所包括的各个光源的照明控制部51。光源包括光源11和光源21。显微镜1还采用用于控制镜台驱动机构41的镜台驱动控制部52和用于控制聚光透镜22的位置的聚光透镜驱动控制部53。显微镜1还采用用于控制被用于获取相差图像的摄像元件34的相差图像获取控制部M和用于控制被用于获取缩略图像的摄像元件13的缩略图像获取控制部55。显微镜1 还采用用于控制被用于获取生物样品SPL的放大图像的摄像元件M的放大图像获取控制部56。照明控制部51、镜台驱动控制部52、聚光透镜驱动控制部53、相差图像获取控制部 M、缩略图像获取控制部阳及放大图像获取控制部56分别通过各种数据通信线被连接至光源11/光源21、镜台驱动机构41、聚光透镜驱动机构42、摄像元件34、摄像元件13及摄像元件24。另外，根据此实施方式的显微镜1采用用于整体控制显微镜1的单独设置的整体控制部50。整体控制部50通过各个数据通信线被连接至照明控制部51、镜台驱动控制部 52、聚光透镜驱动控制部53、相差图像获取控制部M、缩略图像获取控制部55及放大图像获取控制部56。整体控制部50、照明控制部51、镜台驱动控制部52、聚光透镜驱动控制部53、相差图像获取控制部M、缩略图像获取控制部阳及放大图像获取控制部56中的每一个都采用 CPU(中央处理单元)、R0M(只读存储器)、RAM(随机访问存储器)、存储单元、通信单元及处理电路。对上面所提及的部件及其功能作如下说明。照明控制部照明控制部51是用于控制在根据此实施方式的显微镜1中所采用的各个光源的处理部。当照明控制部51从整体控制部50接收到指示对生物样品SPL照明的方法的信息时，根据指示该方法的信息，照明控制部51控制由该信息指示的光源的照明。例如，下面的描述集中于在缩略图像成像部10中所采用的光源11的控制执行上。 在这种情况下，照明控制部51为了确定是否实现亮视场模式或暗视场模式而参照指示对生物样品SPL照明的方法的信息。亮视场模式是用于获取亮视场图像的模式，而暗视场模式是用于获取暗视场图像的模式。随后，照明控制部51根据光源11要实现的模式来设定参数，使得光源11根据该模式来投射照明光。因此，光源11所投射的照明光传播穿过镜台 40上的光圈，并且到达整个生物样品SPL。需要注意，由照明控制部51所设定的参数通常包括照明光的强度及指示光源类型的参数。接下来，下面的描述集中于在放大图像成像部20中所采用的光源21的控制执行上。在这种情况下，照明控制部51为了确定是否要执行亮视场模式或暗视场模式而参照指示对生物样品SPL照明的方法的信息。随后，照明控制部51根据光源21要实现的模式来设定参数，使得光源21根据该模式来投射照明光。因此，光源21所投射的照明光传播穿过镜台40上的光圈，并到达整个生物样品SPL。需要注意，由照明控制部51所设定的参数通常地包括照明光的强度及指示光源类型的信息。建议读者牢记应当在亮视场模式中投射可见光作为照明光。除此之外，也应当将具有包括可激发波长的多个波长的标记生成光作为在特殊染色中所使用的荧光标记。另外，在暗视场模式中，去掉了用于荧光标记的背景部分。镜台驱动控制部镜台驱动控制部52是用于控制用于驱动在根据此实施方式的显微镜1中所设置的镜台40的镜台驱动机构41的处理部。当镜台驱动控制部52从整体控制部50接收到指示用于获取生物样品SPL的图像的方法的信息时，镜台驱动控制部52根据所接收的指示该方法的信息来控制镜台驱动机构41。例如，下面的描述集中于在获取缩略图像的操作上。在这种情况下，当镜台驱动控制部52从整体控制部50接收到作为获取生物样品SPL的缩略图像的指令用的信息时，根据所接收的作为指令用的信息，镜台驱动控制部52控制镜台驱动机构41在镜台表面方向 (也被称作X-Y轴方向)上移动镜台40，使得整个制备玻片PRT被放在摄像元件13的摄像范围内。另外，镜台驱动控制部52还控制镜台驱动机构41在Z轴方向移动镜台40，使得整个制备玻片PRT与物镜12的焦点符合。接下来，下面的描述集中于根据此实施方式的显微镜1为了获取生物样品SPL的放大图像所执行的操作上。在这种情况下，当镜台驱动控制部52从整体控制部50接收到作为获取生物样品SPL的放大图像的指令用的信息时，根据所接收的作为指令用的信息， 镜台驱动控制部52控制并驱动镜台驱动机构41在镜台表面方向(也被称作X-Y轴方向)上移动镜台40，使得生物样品SPL从光源11与物镜12之间的位置被移动至聚光透镜22与物镜23之间的位置。另外，镜台驱动控制部52还控制并驱动镜台驱动机构41以在镜台表面方向(也被称作X-Y轴方向)上移动镜台40，使得生物样品SPL的预定部分被放入摄像元件M的摄像范围内。除此之外，镜台驱动控制部52还控制并驱动镜台驱动机构41在垂直于镜台表面方向的方向上移动镜台40，使得生物样品SPL的预定部分与物镜23的焦点符合。如上所述，生物样品SPL的预定部分已经被放入摄像元件M的摄像范围内。顺便地，垂直于镜台表面方向的方向还被称作Z轴方向或组织切片的深度方向。聚光透镜驱动控制部聚光透镜驱动控制部53是用于控制聚光透镜驱动机构42的处理部，该聚光透镜驱动机构用于驱动在根据此实施方式的显微镜1中的放大图像成像部20中所采用的聚光透镜22。当聚光透镜驱动控制部53从整体控制部50接收到关于在放大图像成像部20中所采用的照明视场光阑的散焦量的信息时，聚光透镜驱动控制部53根据所接收的关于散焦量的信息来控制聚光透镜驱动机构42。如将在随后被描述的一样，如果在放大图像成像部20中所采用的照明视场光阑没有正确地与聚光透镜22的焦点符合，则在摄像元件M上所成像的放大图像的对比度会不合需要地劣化。为了防止放大图像的对比度劣化，根据此实施方式的显微镜1中所采用的整体控制部50基于由散焦量检测部30所生成的相差图像对照明视场光阑的散焦量执行特定处理。随后将对整体控制部50自身进行详细描述。整体控制部50为了使控制聚光透镜驱动控制部53改变聚光透镜22的位置而将表示照明视场光阑的经指定处理的散焦量的信息输出至聚光透镜驱动控制部53，使得聚光透镜22的焦点被置于与放大图像成像部20 中所采用的照明视场光阑相符的状态。具体而言，根据由整体控制部50执行的控制，聚光透镜驱动控制部53驱动聚光透镜驱动机构42以校正光轴ERA上聚光透镜22的位置，使得聚光透镜22的焦点与放大图像成像部20中所采用的照明视场光阑相符。相差图像获取控制部相差图像获取控制部M是用于控制在散焦量检测部30中所采用的摄像元件34 的处理部。相差图像获取控制部M根据摄像元件34中的亮视场模式或暗视场模式来设定参数。另外，当相差图像获取控制部M接收到通过摄像元件34所生成的、作为表示在摄像元件34的成像表面上所成图像的信号的输出信号时，相差图像获取控制部M将输出信号视为表示相差图像的信号。当相差图像获取控制部M接收到表示相差图像的输出信号时， 相差图像获取控制部M将表示输出信号的数据提供至整体控制部50。需要注意，摄像元件34中由相差图像获取控制部M设定的参数通常地包括曝光开始定时和曝光结束定时。 即，摄像元件34中由相差图像获取控制部M所设定的参数通常地包括曝光时间。缩略图像获取控制部缩略图像获取控制部55是用于控制在缩略图像成像部10中所采用的摄像元件13 的处理部。缩略图像获取控制部55根据摄像元件13中的亮视场模式或暗视场模式来设定参数。另外，当缩略图像获取控制部阳接收到由摄像元件13所生成的、作为表示在摄像元件13的成像面上所成图像的信号的输出信号时，缩略图像获取控制部55将输出信号视为表示缩略图像的信号。当缩略图像获取控制部阳接收到表示缩略图像的输出信号时，缩略图像获取控制部阳将表示输出信号的数据提供至整体控制部50。需要注意，摄像元件13 中由缩略图像获取控制部55设定的参数通常包括曝光开始定时和曝光结束定时。放大图像获取控制部放大图像获取控制部56是用于控制在放大图像成像部20中所采用的摄像元件M 的处理部。放大图像获取控制部56根据摄像元件M中的亮视场模式或暗视场模式来设定参数。另外，当放大图像获取控制部56接收到由摄像元件M所生成的、作为表示在摄像元件M的成像面上所成图像的信号的输出信号时，放大图像获取控制部56将输出信号视为表示放大图像的信号。当放大图像获取控制部56接收到表示放大图像的输出信号时，放大图像获取控制部56将表示输出信号的数据提供至整体控制部50。需要注意，摄像元件M 中由放大图像获取控制部56所设定的参数通常地包括曝光开始定时和曝光结束定时。整体控制部整体控制部50是用于控制包括上述的照明控制部51至放大图像获取控制部56 的整个显微镜的处理部。下面参照图2详细说明根据此实施方式的整体控制部50的结构。 图2是示出根据此实施方式的整体控制部50的结构的框图。如图2所示，整体控制部50采用缩略图像获取块501、相差图像获取块503、放大图像获取块505、特征量计算块507、边缘位置检测块509、厚度变化量计算块511、亮度校正块513、通信块515及存储块517。缩略图像获取块501通常由包括CPU、R0M、RAM及通信单元的组件来实现。当用户对显微镜1操作预先确定的操作时、当制备玻片PRT被安装在镜台40上时或如果发生另一个操作的情况下，缩略图像获取块501请求缩略图像获取控制部55设定摄像元件13中的各种参数，并获取缩略图像。随后，缩略图像获取块501从缩略图像获取控制部55获取缩略图像的数据。在下面的描述中，缩略图像的数据也被称作缩略图像数据。缩略图像获取块501可以将缩略图像数据存储在稍后描述的存储块517中。另外，缩略图像获取块501也可以借助于通信块 515将缩略图像数据通常输出至设置在整体控制部50外部的图像数据存储服务器。相差图像获取块503也通常由包括CPU、R0M、RAM及通信单元的组件来实现。在预先确定的定时中，相差图像获取块503请求相差图像获取控制部M设定摄像元件34中的各种参数并获取相差图像。在这种情况下，请求获取相差图像的操作的定时通常是用户执行操作以请求照明视场光阑的焦点调节的时间、从执行照明视场光阑的焦点调节至过去了一段预定时间段之后的时间、获取放大图像的操作的开始时间或预先设定的另一定时。随后，相差图像获取块503从相差图像获取控制部M获取相差图像的数据。在接下来的描述中，相差图像的数据也被称作相差图像数据。相差图像获取块503将相差图像数据输出至稍后描述的特征量计算块507。相差图像获取块503还可将相差图像数据存储在稍后描述的存储块517。放大图像获取块505通常由包括CPU、R0M、RAM及通信单元的组件来实现。当用户对显微镜1操作预先确定的操作时、当获取制备玻片PRT的缩略图像的操作完成时或如果发生另一个操作的情况下，放大图像获取块505请求放大图像获取控制部56设定摄像元件24的各个参数，并获取放大图像。随后，放大图像获取块505从放大图像获取控制部56获取放大图像的数据。在随后的描述中，放大图像的数据也被称作放大图像数据。放大图像获取块505可以将放大图像数据存储在稍后描述的存储块517中。另外，放大图像获取块505也可以借助于通信块 515将放大图像数据通常输出至设置在整体控制部50外部的图像数据存储服务器。特征量计算块507通常由包括CPU、R0M及RAM的组件来实现。根据由相差图像获取块503获取的相差图像数据，特征量计算块507计算表示放大图像成像部20中设置的照明视场光阑的焦点偏移度的特征量。随后将再次详细描述由特征量计算块507计算的特征量和计算特征量的方法。特征量计算块507将计算的表示照明视场光阑的焦点偏移度的特征量输出至聚光透镜驱动控制部53。随后，聚光透镜驱动控制部53为了消除照明视场光阑的焦点模糊而根据从特征量计算块507所接收的特征量驱动聚光透镜驱动机构42以移动聚光透镜22。需要注意，虽然特征量计算块507正在计算表示照明视场光阑的焦点偏移度的特征量，但是特征量计算块507也能够执行其它操作。例如，特征量计算块507能够向照明控制部51发布关于照明光的光量的请求，并且向镜台驱动控制部52发布关于生物样品SPL 的合焦度(in-focus degree)的请求。另外，如将在随后所描述的一样，存在均被用于计算特征量的多种方法。特征量计算块507也能够与稍后描述的边缘位置检测块509合作计算特征量。需要注意，通过特征量计算块507所计算的特征量和在特征量计算期间所获取的各种数值被用在通过厚度变化量计算块511所执行的处理和通过亮度校正块513所执行的处理中。边缘位置检测块509通常由包括CPU、R0M及RAM的组件来实现。根据作为用于检测由相差图像获取块503获取的相差图像的边缘位置的请求、由诸如特征量计算块507和随后描述的厚度变化量计算块511的多个块作出的请求，边缘位置检测块509检测相差图像的边缘位置。边缘位置检测块509所采用的检测相差图像的边缘位置的方法不用特别限定为特定的方法。即，可采用检测相差图像的边缘位置的任意通常所知的方法能够被采用。 随后将具体详细描述由根据此实施方式的边缘位置检测块509执行的、用于检测相差图像的边缘位置的典型处理。如将在随后所描述的一样，在此实施方式中的相差图像是与设置在放大图像成像部20中的照明视场光阑的形状相关的图像。为了检测照明视场光阑的形状的边缘位置，边缘位置检测块509类似于稍后描述的一样通常执行边缘位置检测处理。照明视场光阑的形状是根据照明视场光阑执行的遮挡所得的视场的形状。由边缘位置检测块509所检测的边缘位置通常根据摄像元件34上的像素坐标来表示。边缘位置检测块509将关于所检测的边缘位置的信息提供至请求检测相差图像的边缘位置的那些块。如上所述，那些块的典型实例为特征量计算块507和厚度变化量计算块511。边缘位置检测块509可以通过仅从也被称作二维图像的平面图像中提取出一维图像来检测边缘位置。作为备选，边缘位置检测块509也可以对二维图像本身执行处理以检测边缘位置。
厚度变化量计算块511通常由包括CPU、R0M及RAM的组件来实现。如先前所说明的一样，通过使用均具有被限定为厚度方向上的变化的厚度变化的盖玻片和载玻片来制备该制备玻片PRT。将盖玻片和载玻片的这些厚度变化考虑进去。在这种情况下，载玻片的厚度变化对所得的放大图像的对比度变化的影响比盖玻片的厚度变化的影响更大。厚度变化量计算块511通过使用通过相差图像获取块503获取的相差图像数据来计算其上安装了生物样品SPL的载玻片的厚度变化量。需要注意，在载玻片的厚度变化量的计算中所使用的某些数据及在相同计算中所使用的某些数值可以与在特征量计算中被特征量计算块507所使用的那些相同，并且/或者与在特征量计算期间由特征量计算块507所获取的那些相同。由于这个原因，厚度变化量计算块511可以与特征量计算块507合作有效计算载玻片的厚度变化量。稍后将具体详细描述厚度变化量计算块511所采用的计算厚度变化量的方法。亮度校正块513通常由包括CPU、R0M及RAM的组件来实现。亮度校正块513对在放大图像成像部20中所采用的摄像元件对所输出的放大图像的亮度进行校正。当校正亮度时，亮度校正块513参照作为将厚度变化与亮度校正模式彼此相关的数据库使用的被存储在稍后描述的存储块517中的数据库。亮度校正块513根据厚度变化量计算块511所计算的厚度变化量在数据库搜索与所计算的厚度变化量相关的亮度校正模式。随后，亮度校正块513为了执行对放大图像的亮度进行校正的处理而使用在搜索操作中所发现并选择的亮度校正模式。除此之外，亮度校正块513除了使用亮度校正模式的方法之外还可以控制诸如聚光透镜22的光学元件的位置，以将光学元件移动至光源21后部的这样一个位置处使得聚光透镜22的焦点与照明视场光阑符合。在这种情况下，亮度校正块513请求聚光透镜驱动控制部53执行处理，以驱动聚光透镜22并控制聚光透镜22的位置，使得聚光透镜22的焦点与照明视场光阑符合。通信块515通常由包括CPU、ROM、RAM及通信块的组件来实现。通信块515控制在根据此实施方式的显微镜1与设置在显微镜1外部的各个信息处理装置之间所执行的通信。具体而言，通信块515对在显微镜1中所采用的整体控制部50与外部信息处理装置之间所执行的通信进行控制。通信块515允许根据此实施方式的显微镜1以双向方式与被连接至诸如互联网的公共网络及诸如局域网的私人网络的各个外部信息处理装置进行通信。 外部信息处理装置的典型实例为用于存储生物样品的显微图像的图像数据存储服务器。存储块517是在根据此实施方式的整体控制部50中所采用的典型存储块。存储块517用于存储各种类型的数据，诸如根据此实施方式的显微镜1的各种设计参数及亮度校正模式的数据库。另外，存储块517还可用于存储摄像数据及历史信息。除此之外，存储块517也可用于适当存储当根据此实施方式的整体控制部50正在执行某个处理时要保留的各个参数或者在处理过程中的数据，并且适当存储各种数据库以及各种程序。在整体控制部50中所采用的每个块能够将数据写入存储块517并且能够从存储块517中读出数据。上面已经描述了根据此实施方式的整体控制部50的典型功能。在整体控制部50 中所采用的每个功能部能够被构造为使用通用的组件和通用的电路或为该功能部的功能而特别设计的硬件。另外，每个功能部的所有功能也可通过CPU及其外围组件来执行。因此，能够根据用于实现此实施方式的任意多种技术水平适当改变整体控制部50的结构。建议读者牢记可写入用于实现整体控制部50的功能及在整体控制部50中所采用的功能部的计算机程序。也能够在个人计算机等上执行所述程序。另外，也可存在用于存储这样的计算机程序的记录介质并允许计算机读取该程序。记录介质的典型实例为磁盘、 光盘、光学磁盘及闪存。另外，计算机程序还能够通过网络从程序提供商处下载，而不是被预先存储在记录介质中。上面已经参照图1和图2详细说明了根据此实施方式的显微镜1的整体结构。如上所述，散焦量检测部30中的相差AF(自动聚焦)光学系统采用聚光透镜32、 双目镜33及摄像元件34。但是，需要注意，不意味着相差AF光学系统限于这种光学结构。 例如，一个目镜33取代双目镜33可以被用在边缘检测及载玻片厚度变化量的检测中。艮口， 相差AF光学系统能够具有任意其它结构，只要该其它结构提供与这种光学结构相同的功能即可。另外，在根据此实施方式的显微镜1中所采用的透射照明光学系统可以为Kohler 照明光学系统或其他照明光学系统。除此之外，在上述的结构中，在被光束分离器31反射的光的传播侧设置散焦量检测部30。但是，散焦量检测部30也可设置在被光束分离器31透射的光的传播侧。<照明视场光阑的焦点调节处理>接下来，参照图3至图9，下面的描述说明了针对照明视场光阑所执行的焦点调节处理的细节。[放大图像获取部及相差AF光学系统的典型结构]首先，参照图3，下面的描述说明放大图像成像部20和散焦量检测部30的典型结构。图3是粗略示出了在根据此实施方式的显微镜1中所采用的光学系统的说明图。具体而言，图3粗略示出了放大图像成像部20和散焦量检测部30的光学系统。如图3所示，根据此实施方式的放大图像成像部20采用在镜台40前部位置处的照明光学系统以及在镜台40后部位置处的成像光学系统211。如先前所述，制备玻片PRT 被放在镜台40上。照明光学系统将照明光投射至制备玻片PRT。照明光学系统也具有在照明视场光阑205前部设置的透射照明前段光学系统201和在照明视场光阑205后部设置的透射照明后段光学系统203。另外，光束分离器31设置在成像光学系统211内部。作为通过光束分离器31执行的光分离的结果而获取的光束朝散焦量检测部30传播。散焦量检测部30包括相差AF光学系统301。需要注意，在下面的描述中，由参考符号MI表示用作第一典型成像光学系统的成像光学系统211的放大倍率，而由参考符号MA表示用作第二典型成像光学系统的相差AF 光学系统301的放大倍率。由光源21投射的用作照明光的光束穿过被机械地固定在固定机构(图3中未示出)上的透射照明前段光学系统201。随后，穿过透射照明前段光学系统201的光束传播至包括在透射照明后段光学系统203中的照明视场光阑205。此处，为了考虑照明视场光阑 205的边缘的成像，考虑从照明视场光阑205的边缘衍射的光束A。照明视场光阑205的边缘是照明视场光阑205形状的边缘。光束A穿过透射照明后段光学系统203中采用的聚光透镜207和209，到达用作折射率为η的载玻片的、被支撑在镜台40上的载玻片A的表面上所放置的生物样品SPL的表面。到达生物样品SPL表面的光束A形成图像。随后，到达生物样品SPL表面的光束A传播至成像光学系统211内部、穿过作为物镜的聚光透镜213和聚光透镜215。穿过聚光透镜215的光束A在放大图像成像部20中所采用的摄像元件M的摄像表面217上成像。因此，用户能够将在摄像元件M上成像的图像A作为表示照明视场光阑205和生物样品SPL 表面两个图像的图像来观察。另外，设置在成像光学系统211内部的光束分离器31反射光束A的一部分。在下面的描述中，技术术语“光束分离器”可以在某些情况下被简单简化为BS。在图3中，光束 A的反射部分被称作光束B。光束B进入相差AF光学系统301。在光束B已经穿过设置在相差AF光学系统301内部的聚光透镜32后，光束B传播至双目镜33。穿过双目镜33的光束B随后在设置在散焦量检测部30中的摄像元件34的摄像表面305上形成图像。在摄像表面305上形成的图像是也被称作相差图像的视场光阑图像B和C。因此，用户能够将视场光阑图像B和C作为一组相差图像来进行观察。[放入不同厚度载玻片的情况]接下来，参照图4至图6，下面的描述说明了折射率为η的载玻片B被放入图3所示的光学系统中的情况。图4中所示的载玻片B与图3所示的载玻片A的厚度的厚度差为 At。图4是粗略示出在根据此实施方式的显微镜中所采用的光学系统的说明图。图5Α和图5Β均是示出载玻片的厚度与照明视场光阑205的图像被形成的成像位置之间的关系的说明图。图6是在对示出照明视场光阑205的焦点偏移度的特征量公式化中所使用的参数的下列描述中所参照的说明图。在图4所示的光学系统中，来自照明视场光阑205的光束Α’穿过设置在透射照明后段光学系统203中的聚光透镜207和209，传播至载玻片B。如果考虑镜台40被设定在与图3中所示位置相同的位置的情况，则由于载玻片B具有比载玻片A大At厚度差的更大厚度，所以照明视场光阑205的图像被成像在载玻片B内部。如图5Α所示，参考符号dl表示在图3所示的状态下成像光学系统211与生物样品SPL的表面之间的距离，而参考符号d2表示在图3所示的状态下透射照明后段光学系统 203与载玻片A之间的距离。参考符号t表示载玻片A的厚度。如果在这种状态下将载玻片A的厚度从t变成(t+ Δ t)，成像光学系统211与生物样品SPL的表面之间的距离减小至 (dl-Δ t)，而透射照明后段光学系统203与载玻片A之间的距离保持在d2。在下面的描述中，生物样品SPL的表面也被简单称作样品表面。在图3和图5A的每一个中所示的光学系统中，成像光学系统211与生物样品SPL 的表面之间的空间被充以空气，而成像光学系统211与载玻片A之间的光程表示如下(空气折射率(=1))X (成像光学系统211与样品表面之间的距离)=dl另一方面，在图4和图5B的每一个中所示的光学系统中，载玻片B内的空间是折射率为η的空间，并且此折射率为η的空间由于厚度差At而增大。因此，成像光学系统 211与载玻片B之间的光程表示如下IX (dl-At)+nX At = dl+(n-l) At从图6中可以明显看出，根据斯内尔定律(Snell law)，下面作为表示sin( θ )= nXsin(9 ‘)的等式所给出的等式101成立。另外，图6中所示的几何关系表示下面作为表示AtXsin(e ’)= (At-D) Xsin( θ )的等式所给出的等式102成立。在这个等式中， 参考符号D表示焦点偏移距离。sin( θ ) = nXsin( θ，)··.(等式 101)AtXsin( θ，)= ( Δ t_D) Xsin( θ )· · ·(等式 102)因此，能够根据等式101和102得出下面作为表示焦点偏移距离D的等式所给出的等式103如下
权利要求
1.一种显微镜，包括照明光学系统，设有照明视场光阑以及一个或多个照明光学元件，作为被配置为将照明光投射至镜台上所放置的样品的光学系统；第一成像光学系统，设有第一摄像元件，被配置为基于透过所述样品的透射光来获取图像；以及一个或多个第一光学元件，被配置为基于所述透射光在所述第一摄像元件上使所述图像成像；第二成像光学系统，设有光束分离部，被配置为将所述第一成像光学系统中传播的所述透射光进行分离以从所述透射光中获取部分光束；第二摄像元件，被配置为基于所述部分光束获取相差图像；以及一个或多个第二光学元件，被配置为基于所述部分光束在所述第二摄像元件上使所述相差图像成像；照明视场光阑焦点调节部，被配置为调节所述照明视场光阑成像的成像位置；以及特征量计算块，被配置为根据由所述第二摄像元件所生成的输出信号来计算表示所述照明视场光阑的焦点偏移度的特征量，其中，所述照明视场光阑焦点调节部根据所述特征量计算块所计算的所述特征量来调节所述照明视场光阑的所述成像位置。
2.根据权利要求1所述的显微镜，其中，所述相差图像包括根据所述照明视场光阑的形状成像在所述第二摄像元件上的第一图像和第二图像，并且所述特征量计算块通过使用所述第二摄像元件的各个像素上的所述第一图像的输出信号与所述第二图像的输出信号之间的强度差来计算所述特征量。
3.根据权利要求2所述的显微镜，其中，所述特征量计算块在透过所述样品的所述透射光没有被聚焦在所述第一摄像元件的状态下计算所述特征量。
4.根据权利要求2所述的显微镜，其中，所述照明光的强度被调节成使得成像在所述第二摄像元件上的所述相差图像的输出信号的强度处于饱和状态。
5.根据权利要求2所述的显微镜，进一步包括 位置控制部，被配置为控制所述镜台的位置；以及厚度变化量计算块，被配置为计算装载有所述样品的载玻片的厚度变化量，其中， 所述相差图像包括根据所述照明视场光阑的形状成像在所述第二摄像元件上的第一图像和第二图像，所述厚度变化量计算块通过使用所述第二摄像元件的各个像素上的所述第一图像的输出信号与所述第二图像的输出信号之间的强度差来计算所述厚度变化量，并且所述位置控制部根据由所述厚度变化量计算块所计算的所述厚度变化量将所述镜台的位置朝着所述照明光学系统移动。
6.根据权利要求1所述的显微镜，进一步包括 位置控制部，被配置为控制所述镜台的位置；以及厚度变化量计算块，被配置为计算装载有所述样品的载玻片的厚度变化量，其中所述相差图像包括根据所述照明视场光阑的形状成像在所述第二摄像元件上的第一图像和第二图像，所述厚度变化量计算块通过使用在合焦状态下所获取的所述第一图像与在实际状态下所获取的所述第一图像之间的边缘位置的差值和/或在合焦状态下所获取的所述第二图像与在实际状态下所获取的所述第二图像之间的边缘位置的差值来计算所述厚度变化量，并且所述位置控制部根据由所述厚度变化量计算块计算的所述厚度变化量将所述镜台的位置朝着所述照明光学系统移动。
7.根据权利要求6所述的显微镜，其中，所述厚度变化量计算块针对所述第一图像或第二图像根据所述第一图像或第二图像中所述照明视场光阑的形状所在一侧的边缘位置来计算所述厚度变化量。
8.根据权利要求6所述的显微镜，其中，所述厚度变化量计算块针对所述第一图像和第二图像中的每一个根据所述第一图像和第二图像中的每一个中所述照明视场光阑的形状所在一侧的边缘位置来计算所述厚度变化量。
9.根据权利要求6所述的显微镜，其中，所述厚度变化量计算块针对所述第一图像和第二图像中的每一个根据所述第一图像和第二图像中的每一个中所述照明视场光阑的形状所在的两侧的边缘位置的和来计算所述厚度变化量。
10.根据权利要求1所述的显微镜，其中，所述特征量计算块使用所述输出信号的边缘位置来计算所述特征量。
11.根据权利要求5所述的显微镜，进一步包括亮度校正块，被配置为校正成像在所述第一摄像元件上的图像的亮度，其中，所述亮度校正块使用预先准备的作为在亮度校正中使用的模式的亮度校正模式，在所述照明视场光阑焦点调节部调节了所述照明视场光阑的所述成像位置以使所述照明视场光阑的图像处于合焦状态之后，校正在所述第一摄像元件上成像的所述图像的亮度。
12.根据权利要求5所述的显微镜，进一步包括亮度校正块，被配置为校正成像在所述第一摄像元件上的图像的亮度，其中所述亮度校正块根据计算出的所述载玻片的厚度变化量从均预先设定的作为亮度校正中要使用的模式的多个亮度校正模式中选择一个，并且使用所选择的亮度校正模式对所述图像的亮度进行校正。
13.一种聚焦方法，包括对作为具有照明视场光阑的照明光学系统所投射的部分照明光并且已透过镜台上所放置的样品的透射光进行分离以获得来自所述透射光的部分光束，并且使摄像元件基于所述部分光束获取相差图像；根据所述摄像元件所生成的输出信号来计算表示所述照明视场光阑的焦点偏移度的特征量；并且根据所计算的所述特征量来驱动照明视场光阑焦点调节机构以调节所述照明视场光阑成像的成像位置。
全文摘要
本发明公开了一种显微镜及聚焦方法，其中显微镜，包括照明光学系统；第一成像光学系统；第二成像光学系统；照明视场光阑焦点调节部；以及特征量计算块，其中，照明视场光阑焦点调节部根据由特征量计算块所计算的特征量来调节照明视场光阑的成像位置。
文档编号G02B21/06GK102298206SQ201110168058
公开日2011年12月28日 申请日期2011年6月21日 优先权日2010年6月28日
发明者山本隆司, 成泽龙, 林信裕, 田部典宏 申请人:索尼公司