专利名称：透射光学显微镜的样品梯度照明方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明属于显微成像领域，涉及ー种增强显微镜成像对比度的成像方法。
背景技术：
传统上来说，为了观察未经染色的标本和活细胞，増加显微镜成像对比度方面，目前有3种方法，分别是
1.相差显微镜(PhaseContrast Microscopy),由荷兰科学家、诺贝尔奖获得者泽尔尼克于1935年发明。主要是利用物体不同结构成分之间的折射率和厚度的差別，把通过物体不同部分的光程差转变为振幅差，最后通过带有环状光阑的聚光镜和带有相位片的相差物镜实现观测。虽然可以增加成像对比度，但是需要样品厚度很薄，所以并不适合多数的生物 应用；
2.微分干涉显微镜(DifferentialInterference Contrast Microscopy),由波兰物理学家诺玛斯基于1952年在相差显微镜的基础上发明，与前者相比，其可以使用更厚的样品，而且成像的立体感更好，故目前得到了广泛应用；
3.倾斜式照明(Obliqueillumination),为ー种增加成像对比度的最简单方法。通常采用在聚光镜中加ー个大小可调的狭缝，当光线在侧面入射时，可以将样品厚度和密度的不同，用光线的强弱来对比出来。虽然可以通过旋转狭缝来增加对比度，但却明显的降低了分辨率。以上三种方法，用的最多的便是微分干涉显微镜，尤其在广泛使用的动物脑组织切片的电生理记录中。为了增加照明光线对脑组织的穿透性，提高成像深度，现在多采用了对生物组织穿透性更强的红外光来激发，但其缺点是1.使用多个偏振器件，光路复杂，而且造价高；2.对比度不够高，而起光強度低；3.使用了偏振棱镜，使其无法和应用广泛的双光子显微镜光路相兼容。现有的微分干涉显微镜，必须在整个光路上放置起偏器，诺玛斯基棱镜与检偏器，造成使用上的不方便，尤其是其无法和双光子显微镜配套观察。
发明内容
技术问题本发明提供了ー种可方便用户利用透射光寻找样品、可即插即用的透射光学显微镜的样品梯度照明方法，以及实现该方法的透射光学显微镜的样品梯度照明装置。
技术方案本发明的透射光学显微镜的样品梯度照明方法，包括以下步骤
1)在反射镜与红外光源之间的入射光路上放置焦距均为f的第一凸透镜和第二凸透镜，第一凸透镜和第二凸透镜的焦点位于两个凸透镜之间，反射镜设置在光学显微镜上聚光镜的入射光路ー侧，用以将入射光反射进聚光镜，第一凸透镜位于临近红外光源ー侧，第ニ凸透镜位于临近反射镜ー侧，第一凸透镜与第二凸透镜的间距在f至2f之间；
2)调节红外光源与第一凸透镜的间距，直至红外光源通过第一凸透镜形成的共轭平面位于第二凸透镜的焦点处时，固定红外光源和第一凸透镜，在红外光源的共轭平面处放置空间滤波器，在空间滤波器与第一凸透镜焦点之间的光路上放置散射片，空间滤波器包括遮光部分和透光部分，透光部分位于空间滤波器的边缘；
3)保持红外光源、第一凸透镜、第二凸透镜、空间滤波器和散射片之间的位置关系，调节第二凸透镜与反射镜的间距，直至空间滤波器通过第二凸透镜和反射镜形成的共轭平面位于聚光镜的孔径平面上吋，固定第二凸透镜；
4)再次调节红外光源与第一凸透镜的间距，直至红外光源通过第一凸透镜形成的共轭平面再次位于第二凸透镜的焦点处时，固定红外光源和第一凸透镜；
5)开启红外光源，围绕光路轴线旋转调节空间滤波器，观察不同位置样品的三维形态，沿光路轴线水平移动散射片，调节空间滤波器和散射片的间距，观察样品在不同距离下的对比度增强效果。
本发明的实现上述方法的透射光学显微镜的样品梯度照明装置，包括壳体，以及设置·于壳体内的、均位于同一轴线上的第一凸透镜、第二凸透镜、空间滤波器和散射片，第一凸透镜和第二凸透镜的焦点位于两个凸透镜之间且焦距均为f，空间滤波器包括遮光部分和透光部分，透光部分位于空间滤波器的边缘，空间滤波器位于第二凸透镜的焦点处，散射片位于空间滤波器和第一凸透镜焦点之间，空间滤波器能够围绕光路轴线旋转调节，散射片能够沿光路轴线水平移动调节。本发明的透射光学显微镜的样品梯度照明装置中，空间滤波器连接有旋转调节装置，用以围绕光路轴线旋转调节空间滤波器，散射片连接有轴向调节装置，用以沿光路轴线水平移动调节散射片。本发明的透射光学显微镜的样品梯度照明装置中，第一凸透镜和第二凸透镜的间距可以是能够调节的。本发明通过光学元件的组合，将光通过样品后的不可见相位变化，转换成可见的光強度梯度变化。本发明中，红外光源通过第一凸透镜，在第二凸透镜的焦点处形成一个共轭平面，并在此处放置空间滤波器，空间滤波器又通过散射片、第二凸透镜和反射镜，在聚光镜的孔径平面上形成另ー个共轭平面。通过在第二凸透镜的焦点处形成的共轭平面上放置空间滤波器，对入射的光束进行时域傅里叶变换，从而达到频域的空间滤波。在空间滤波器后面，放置ー个位置可调的散射片，其与空间滤波器之间的距离，最近为紧邻空间滤波器，最远为第一凸透镜焦点所在平面。在使用过程中，可以对空间滤波器的方向、空间滤波器与散射片之间的距离进行调节，从而可以对入射光的強度和強度的梯度变化进行调节。有益效果本发明与现有技术相比，具有以下优点
相对于现有的微分干渉方法，本发明梯度照明方法在不改变光束高斯属性的情况下，使得光束的高斯强度分布更为均匀。在聚光镜的孔径平面上，形成了光強度的梯度变化，而且由于空间滤器放置在了共轭平面上，使得高斯光束的低频部分频率成分未受影响，从而基本保留了样品的固有形貌特征。对于多数动物脑组织切片的电生理观察，该梯度照明方法可有助于实验者找到切片不同层次的轴突和树突走向。本发明方法相对于传统的利用起偏器和检偏器的偏振原理来实现微分干涉的方法，对比度有所提高，适用于所有的生物观察样品，而微分干渉方法对于某些对光程差不敏感的样品并不适用。本发明方法不但减轻了系统的复杂度，提高了光源強度和对比度，更为重要的是，将为双光子辅助的电生理记录中所无法使用的微分干涉对比度增强方法，提供了很好的补充。相对于现有的微分干渉装置，本发明梯度照明装置中空间滤波器的应用，使得出射的光強度在上下、左右垂直方向上产生了梯度变化。由于空间滤波器阻挡了大部分入射光束，使得只利用了部分最重要的垂直入射的圆锥体光束，因此明显的減少了偏离轨道的光线，使光线变得更加集中。通过这种方法所増加的对比度，让我们甚至可以用眼睛直接看到脑组织切片中的神经元，而无需借 助于任何其他装置。
本发明装置是在已有的显微镜和红外光源之间进行的对比度增强方法，而不是需要对显微镜进行修改，因此可以应用于Zeiss、Leica、Olympus、Nikon等公司所有不同型号的产品。本发明装置对显微镜的整体部分不做任何改动，只是添加了ー个即插即用装置，方便实现，造价低，而且适用于双光子显微镜；传统的微分干渉方法则需要在已有显微镜的基础上进行改动，添加起偏器和检偏器等装置，明显增加了实现的难度和普遍性，尤其对于双光子显微镜，则根本无法应用这些装置。
图1是本发明的光路原理图。图2是本发明方法的梯度照明示意图。图3是采用本发明装置和荧光显微镜联合进行电生理记录时的结构示意图。图4是采用本发明方法进行电生理记录时的对比度增强图。图5是是将图4放大以后的图像。图中有反射镜1、红外光源2、第一凸透镜3、第二凸透镜4、空间滤波器5、散射片6、汞灯光源7、光纤8、梯度照明装置9、相机10、ニ向色镜11、电极12、红外滤波器13、膜片钳14、显示器15、膜片钳记录的信号16、聚光镜孔径平面17、聚光镜18、样品19、显微镜20。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进ー步说明。本发明的透射光学显微镜的样品梯度照明方法，包括以下步骤
1)在反射镜1与红外光源2之间的入射光路上放置焦距均为f的第一凸透镜3和第二凸透镜4，第一凸透镜3和第二凸透镜4的焦点位于两个凸透镜之间，反射镜1设置在光学显微镜上聚光镜的入射光路ー侧，用以将入射光反射进聚光镜，第一凸透镜3位于临近红外光源2 —侧，第二凸透镜4位于临近反射镜1 ー侧，第一凸透镜3与第二凸透镜的间距在f至2f之间；
2)在入射光路上，第二凸透镜4的焦点处放置空间滤波器5，沿入射光路轴线移动红外光源2，调节红外光源2与第一凸透镜3的间距，直至红外光源2通过第一凸透镜3形成的共轭平面位于第二凸透镜4的焦点处时，也即红外光源的共轭平面落在空间滤波器5上吋，固定红外光源2和第一凸透镜3,在空间滤波器5与第一凸透镜3焦点之间的光路上放置散射片6,空间滤波器5包括遮光部分和透光部分,透光部分位于空间滤波器5的边缘,散射片6可以采用磨砂玻璃散射片；
3)保持红外光源2、第一凸透镜3、第二凸透镜4、空间滤波器5和散射片6之间的位置关系，调节第二凸透镜4与反射镜1的间距，直至空间滤波器5通过第二凸透镜4和反射镜1形成的共轭平面位于聚光镜18的孔径平面上吋，固定第二凸透镜4 ；
4)再次调节红外光源2与第一凸透镜3的间距，直至红外光源2通过第一凸透镜3形成的共轭平面再次位于第二凸透镜4的焦点处时，固定红外光源2和第一凸透镜3 ；
5)开启红外光源2，围绕光路轴线旋转调节空间滤波器5，观察不同位置样品的三维形态，沿光路轴线、在空间滤波器5与第一凸透镜3的焦点之间水平移动散射片6，调节空间滤波器5和散射片6的间距，观察样品在不同距离下的对比度增强效果。
本发明的实现上述方法的透射光学显微镜的样品梯度照明装置，包括壳体，以及设置于壳体内的、均位于同一轴线上的第一凸透镜3、第二凸透镜4、空间滤波器5和散射片6，第一凸透镜3和第二凸透镜4的焦点位于两个凸透镜之间且焦距均为f，空间滤波器5的结构如图2中所示，包括遮光部分和透光部分，空间滤波器5的大部分为遮光部分，透光部分位于空间滤波器5的边缘，空间滤波器5围绕中心旋转时，透光部分可沿空间滤波器5的外周移动。空间滤波器5位于第二凸透镜4的焦点处，散射片6位于空间滤波器5和第一凸透镜3焦点之间，空间滤波器5连接有旋转调节装置，用以围绕光路轴线旋转调节空间滤波器5，散射片6连接有轴向调节装置，用以沿光路轴线水平移动调节散射片6。上述的旋转调节装置和轴向调节装置均为现有光学仪器设备中常用的装置，可以是机械调节装置，也可以是机电装置，只要能实现上述功能即可，其具体结构在此不再赘述。本发明装置的一个实施例中，上述旋转调节装置和轴向调节装置均设置在样品梯度照明的壳体上，空间滤波器5和散射片6分别通过所连接的旋转调节装置和轴向调节装置安装在壳体上。本发明在实施时候，只需将本发明的样品梯度照明装置与显微镜和红外光源连接上即可，红外光源经过梯度照明以后，通过反射镜1的反射和聚光镜孔径平面的调节，最后借助于聚光镜18的聚焦，到达样品。该装置有两种梯度照明的调节办法
1.通过旋转空间滤波器的位置，使得观察样品的不同位置依次出现光强度的梯度变化，便于实验者寻找感兴趣的区域；
2.通过调节空间滤波器和散射片的间距，即可以改变透射光束的梯度强度分布，不同实验者可以选择合适的光强梯度值。现有测试方法中，红外光源2不通过任何光学装置，直接设置在反射镜1之前的入射光路上，此时红外光源2设置的位置为显微镜透射光入口。由于不同厂家的显微镜透射光入口和聚光镜孔径平面(aperture plane, AP)的间距会略有差別，为了使第二个共轭平面正好落在聚光镜的孔径平面上，需要调节第一凸透镜3和第二凸透镜4之间的距离，来与上述透射光入口与聚光镜孔径平面的间距相匹配。因此，本发明装置的一个实施例中，第一凸透镜3和第二凸透镜4的间距能够调节，其间距调节装置也是现有光学仪器设备中的常用装置，如机械调节装置，或机电装置，只要能实现上述功能即可。本发明装置在与双光子显微镜联合进行电生理记录时，硬件连接共需要5个部分显微镜，包括红外光源、红外滤波器、物镜、目镜、载物台等，为该系统的主体装置；
梯度照明装置即为本发明的透射光学显微镜的样品梯度照明装置，用于清晰的观察样品中细胞的三维形貌；
荧光装置包括汞灯光源和光纤。在梯度照明中所观察到的细胞的基础上，激发其中具有荧光信号的细胞，即可以进行电生理记录的细胞；
成像装置包括相机和显示器。将梯度照明和荧光图像共同呈现在显示器上，便于操 作；
记录装置包括电极和膜片钳。记录细胞，尤其是神经元中的电信号。本发明装置与双光子显微镜联合进行电生理记录的试验流程为
首先，通过调节显微镜的焦平面和梯度照明装置，直到找到清晰的细胞形态；然后打开汞灯，找到有荧光信号的细胞；最后，參考显示器的图像确认插入记录电极的位置，并通过膜片钳进行记录。
权利要求
1.一种透射光学显微镜的样品梯度照明方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 1)在反射镜(I)与红外光源(2)之间的入射光路上放置焦距均为f的第一凸透镜(3)和第二凸透镜(4)，所述第一凸透镜(3)和第二凸透镜(4)的焦点位于两个凸透镜之间，所述反射镜(I)设置在光学显微镜上聚光镜(18)的入射光路一侧，用以将入射光反射进所述聚光镜(18)，所述第一凸透镜(3)位于临近红外光源(2)—侧，所述第二凸透镜(4)位于临近反射镜(I) 一侧，第一凸透镜(3)与第二凸透镜(4)的间距在f至2f之间； 2)在第二凸透镜(4)的焦点处放置空间滤波器(5)，调节红外光源(2)与第一凸透镜(3)的间距，直至红外光源(2)通过第一凸透镜(3)形成的共轭平面位于第二凸透镜(4)的焦点处时，固定红外光源(2)和第一凸透镜(3)，在所述空间滤波器(5)与第一凸透镜(3)焦点之间的光路上放置散射片(6)，空间滤波器(5)包括遮光部分和透光部分，所述透光部分位于空间滤波器(5)的边缘； 3)保持红外光源(2)、第一凸透镜(3)、第二凸透镜(4)、空间滤波器(5)和散射片(6)之间的位置关系，调节第二凸透镜(4)与反射镜(I)的间距，直至空间滤波器(5)通过第二凸透镜(4)和反射镜(I)形成的共轭平面位于聚光镜(18)的孔径平面上时，固定第二凸透镜(4)； 4)再次调节红外光源(2)与第一凸透镜(3)的间距，直至红外光源(2)通过第一凸透镜(3)形成的共轭平面再次位于第二凸透镜(4)的焦点处时，固定红外光源(2)和第一凸透镜(3)； 5)开启红外光源(2)，围绕光路轴线旋转调节空间滤波器(5)，观察不同位置样品的三维形态，沿光路轴线水平移动散射片(6)，调节空间滤波器(5)和散射片(6)的间距，观察样品在不同距离下的对比度增强效果。
2.一种实现权利要求I所述方法的透射光学显微镜的样品梯度照明装置，其特征在于，该装置包括壳体，以及设置于所述壳体内的、均位于同一轴线上的第一凸透镜(3)、第二凸透镜(4)、空间滤波器(5)和散射片(6)，所述第一凸透镜(3)和第二凸透镜(4)的焦点位于两个凸透镜之间且焦距均为f，所述空间滤波器(5)包括遮光部分和透光部分，所述透光部分位于空间滤波器(5)的边缘，空间滤波器(5)位于第二凸透镜(4)的焦点处，所述散射片(6)位于空间滤波器(5)和第一凸透镜(3)焦点之间，空间滤波器(5)能够围绕光路轴线旋转调节，散射片(6)能够沿光路轴线水平移动调节。
3.根据权利要求2所述的透射光学显微镜的样品梯度照明装置，其特征在于，所述空间滤波器(5)连接有旋转调节装置，用以围绕光路轴线旋转调节空间滤波器(5)，所述散射片(6 )连接有轴向调节装置，用以沿光路轴线水平移动调节散射片(6 )。
4.根据权利要求2或3所述的透射光学显微镜的样品梯度照明装置，其特征在于，所述第一凸透镜(3)和第二凸透镜(4)的间距能够调节。
全文摘要
本发明公开了一种透射光学显微镜的样品梯度照明方法，和实现该方法的透射光学显微镜的样品梯度照明装置，包括第一凸透镜、第二凸透镜、空间滤波器和散射片。本发明通过空间滤波器的滤波作用和散射片的平滑作用，用产生的梯度光强度照明显微镜，明显的增强了透射光穿过样品成像时的对比度。利用本发明，实验人员可以清楚的识别细胞，精准的定位细胞胞体以及树突与轴突的走向。
文档编号G02B21/08GK102955239SQ20121044897
公开日2013年3月6日 申请日期2012年11月9日 优先权日2012年11月9日
发明者蒋礼阳, 陈成刚 申请人:蒋礼阳, 陈成刚, 南京东利来光电实业有限责任公司