显微镜装置以及图像获取方法与流程

本发明的一个方面涉及显微镜装置(microscope apparatus)以及图像获取方法。

背景技术：

在专利文献1中记载有有关能够进行像差校正(aberration correction)的显微镜的技术。在该显微镜中，将激发光照射于标本并将在标本上产生的荧光分支并聚光，通过照相机来拍摄聚光图像。聚光图像的聚光点(spot)在不存在像差的情况下成为衍射极限图像，但是在存在像差的情况下成为伴有变形的形状。因此，在该显微镜中尝试了使用波前(wavefront)像差校正来改善聚光点形状。因此，通过记录下对应于多个聚光点形状的多个像差条件并选择适用像差条件从而谋求高速化。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2013-160893号公报

技术实现要素：

发明想要解决的技术问题

空间光调制器的特长是能够通过控制波前来矫正各种各样的像差。例如，在激光扫描型显微镜中，存在有所谓由观察对象物与周边媒介(例如空气、水、硅油、油等)的折射率的失配(mismatching)而发生球面像差并且在观察对象物的内部照射光的聚光点在光轴方向上伸展的问题，但是通过使用空间光调制器来控制照射光的波前，从而就能够矫正球面像差而抑制在观察对象物内部的聚光点的伸长。因为由这样的像差校正就能够获得精细的图像，因此为了获得例如脑的血管像等生物体试样的内部观察图像，适宜使用这样的显微镜。

然而，在多数情况下，生物体试样的表面不是平坦的。因此，除了上述的像差之外，还发生由生物体试样的表面形状导致的像差。例如，在观察作为生物体试样的斑马鱼(zebrafish)等鱼的情况下，鱼的表面形状可以看作是大致圆筒状，由该圆筒状会发生像散(astigmatism)。另外，例如细胞标本等生物体试样是由血管或细胞组织等构成。因此，存在有被红血球或脂质等的折射率分别不同的的物质。因此，在生物体试样的内部会产生像差。这样，如果照射光受到这些像差的影响，则会产生照射光的聚光强度在生物体试样内部变弱或者聚光形状变宽等问题。

本发明的一个方面是鉴于上述的技术问题而作出的发明，其目的在于提供一种能够抑制在生物体试样内部的照射光的聚光强度的降低以及聚光形状的扩大的显微镜装置以及图像获取方法。

解决技术问题的手段

为了解决上述技术问题，本发明的一个方面所涉及的显微镜装置是一种获取生物体试样的图像的装置，并具备：生物体试样台，其支撑生物体试样；物镜，其与生物体试样台相对配置；光源，其输出通过物镜照射于生物体试样的光；形状获取部，其取得有关生物体试样的表面形状以及生物体试样的表面正下方的结构中的至少一者的信息；全息图制作部，其根据在形状获取部上获取的信息制作用于矫正起因于至少一者的像差的像差校正全息数据；空间光调制器，其呈现基于像差校正全息数据的全息图并调制从光源输出的光；光检测器，其检测在生物体试样上产生的光的强度并输出检测信号；图像制作部，其根据检测信号制作生物体试样的图像。

另外，本发明的一个方面所涉及的图像获取方法是一种获取生物体试样的图像的方法，包括：形状获取步骤，获取有关与物镜相对的由生物体试样台支撑的生物体试样的表面形状、以及生物体试样表面正下方结构中的至少一者的信息的步骤；全息图像制作步骤，根据在形状获取步骤中获取的信息制作用于矫正起因于至少一者的像差的像差校正全息数据的步骤；光照射步骤，将基于像差校正全息数据的全息图呈现于空间光调制器并通过空间光调制器来调制从光源输出的光并向生物体试样照射调制后的光的步骤；光检测步骤，检测在生物体试样上产生的光的强度并输出检测信号的步骤；图像制作步骤，根据检测信号制作生物体试样的图像的步骤。

在上述的显微镜装置以及图像获取方法中，获取有关生物体试样的表面形状以及生物体试样表面正下方的结构中的至少一者的信息。然后，根据该信息生成用于矫正像差的像差校正全息数据。另外，通过基于该数据的全息图调制照射光。由此，因为起因于生物体试样的表面形状、以及生物体试样表面正下方的结构中的至少一者的像差被适宜地矫正，因此能够抑制生物体试样内部的照射光的聚光强度的降低以及聚光形状的扩大。

发明效果

根据本发明的一个方面所涉及的显微镜装置以及图像获取方法，能够抑制生物体试样内部的照射光的聚光强度的降低以及聚光形状的扩大。

附图说明

图1是表示第1实施方式所涉及的显微镜装置的结构的图。

图2是表示显微镜装置的操作的流程图。

图3是示意地表示像差发生的情况的图。

图4示意性地表示在没有被像差校正的平面波的照射光被物镜聚光时，生物体试样与其外侧的边界从相对于光轴垂直的平面倾斜时的照射光的情况。

图5是用于说明计算如光线集中于光轴上的任意点那样的波前的方法的图。

图6示意性地表示了存在2个折射率的边界的情况。

图7是表示使用(a)、(b)反向传播分析求得的波前的图，相位由浓淡表示。

图8是从侧方观察(a)～(d)生物体试样得到的图，并且示意性地表示了照射光通过包含折射率互相不同的媒介的内部结构并且被聚光的情况。

图9是表示第2实施方式的显微镜装置的结构的图。

图10是表示显微镜装置的操作以及根据本实施方式的图像获取方法的流程图。

图11是用于说明第1变形例的操作的图，并且是从光轴方向观察的生物体试样的表面的图。

图12：图12(a)和图12(b)是表示第1变形例的扫描的情况的图。

图13是表示第2变形例所涉及的显微镜装置的结构的图。

图14是表示第4变形例所涉及的显微镜装置结构的图。

图15是表示第5变形例所涉及的显微镜装置的显微镜单元以及形状测量单元的结构的图。

图16是表示第6变形例所涉及的显微镜装置的结构的图。

符号说明

1A～1E……显微镜装置

10、10B……显微镜单元

11……生物体试样台

12……物镜

13……物镜移动机构

14……分束器

15……反射镜

20、20B～20E……形状测量单元

21……相干光源

22……分束器

23……参照光用反光镜

24……检测器

30……图像获取单元

31……激光光源

32……光束扩展器

33……第1空间光调制器

34……分色镜

35……光扫描器

36……第2空间光调制器

37……检测器

40……控制单元

A2……光轴

B……生物体试样

L1……照射光

L2……被检测光

L3……相干光

L4……干涉光

具体实施方式

以下参照附图并详细说明本发明的一个方面所涉及的显微镜装置以及图像获取方法的实施方式。另外，在附图说明中对相同要素标注相同的符号，并省略重复的说明。

(第1实施方式)

图1是表示本发明的一个实施方式所涉及的显微镜装置1A结构的图。显微镜装置1A是用于获取生物体试样B的图像的装置。显微镜装置1A如图1所示具备显微镜单元10、形状测量单元20、图像获取单元30以及控制单元40。

显微镜单元10随着将来自后述的形状测量单元20以及图像获取单元30的照射光L1照射于生物体试样B，并且分别向形状测量单元20以及图像获取单元30输出来自生物体试样B的被检测光L2。被检测光L2为照射光L1的反射光、照射光L1的高次谐波、或者被照射光L1激发的荧光。显微镜单元10具有生物体试样台11、物镜12、物镜移动机构13以及分束器14。

生物体试样台11是用于支撑生物体试样B(或者是容纳生物体试样B的容器)的板状部件。生物体试样台11例如是由能够透过照射光L1以及被检测光L2的材质构成，并且是由例如玻璃或塑料等构成。生物体试样台11例如是载玻片、玻底培养皿(bottom dishes)、微板(microplate)等。在本实施方式中，照射光L1被照射于生物体试样台11的背面，透过生物体试样台11被照射于生物体试样B。另外，来自生物体试样B的被检测光L2透过生物体试样台11从生物体试样台11的背面输出。

物镜12与生物体试样台11相对配置，并将照射光L1聚光于生物体试样B的内部。另外，物镜12对来自生物体试样B的被检测光L2实施聚光。

另外，在本实施方式中，用于照射光L1的物镜和用于被检测光L2的物镜是相同的透镜，但也可以分开个别设置用于照射光L1的物镜和用于被检测光L2的物镜。例如，也可以为照射光L1而使用数值孔径(NA：numerical aperture)高的物镜并通过像差校正来进行局部聚光。另外，也可以为了被检测光L2而使用光瞳大的物镜并成为能够取出更多的光的形式。也可以以夹着生物体试样B的方式配置用于照射光L1的物镜和用于被检测光L2的物镜，从而获取照射光L1在生物体试样B中的透射光作为被检测光L2。

物镜移动机构13是一种用于在照射光L1的光轴方向上使物镜12移动的机构。物镜移动机构13例如是由步进马达或者压电致动器等来构成。

分束器14分割以及合成与图像获取单元30之间的光路、与形状测量单元20之间的光路。具体地来说分束器14向物镜12反射从图像获取单元30到达显微镜单元10的照射光L1。另外，分束器14向图像获取单元30反射被物镜12聚集的被检测光L2。另一方面，分束器14透过来自形状测量单元20的光L32以及生物体试样B中的光L32的反射光。分束器14例如可以由半透半反镜(half mirror)或分色镜(dichroic mirror)构成。另外，显微镜单元10进一步具有变更光L32的光轴方向的反射镜15。

形状测量单元20是本实施方式所涉及的形状获取部。形状测量单元20包含检测器24并且与物镜12光学结合。形状测量单元20获取有关生物体试样B的伴有折射率分布的形状的信息即有关生物体试样B的表面形状[伴随于由生物体试样B和周围(空气)产生的折射率差的形状]的信息。形状测量单元20例如也可以是使用了迈克尔逊干涉仪(Michelson interferometer)的测量生物体试样B的表面形状的干涉光测量单元。在此情况下，形状测量单元20如图1所示具有相干光源21、分束器22、参照光用反光镜23以及检测器24。

相干光源21发生被照射于生物体试样B的相干光L3。相干光源21例如由半导体激光元件来适当地构成。

分束器22将来自相干光源21的相干光L3分支成参照光L31和射向显微镜单元10的光L32。另外，分束器22使在参照光用反光镜23上反射的参照光L31反射并使光L32的来自生物体试样B表面的反射光透过。由此，分束器22合成这些光并生成干涉光L4。干涉光L4被输入到检测器24。另外，参照光用反光镜23既可以以能够相对于参照光L31的光轴方向移动的方式构成，也可以被固定。

检测器24检测由分束器22合成的干涉光L4，并输出检测信号S1。检测器24包含例如CCD图像传感器和CMOS图像传感器等二维光检测元件。

另外，形状测量单元不限于本实施方式的结构。例如，形状测量单元也可以具有米劳(Mirau)型以及林尼克(Linnik)型等干涉测量方式。或者，形状测量单元既可以具有共焦反射显微镜(confocal reflectance microscopy)，也可以具有共光路径干涉仪(common path interferometer)。由这样的显微镜能够使用聚焦信息来适当地测量生物体试样B的表面形状。另外，形状测量单元也可以是使用瞬逝光(evanescent light)的形状测量单元。由此，所谓生物体试样B是否接地到生物体试样台11等的形状把握变得容易了。

图像获取单元30检测来自生物体试样B的被检测光L2并制作出图像。另外，以下说明被检测光L2为来自生物体试样B的荧光的情况下的荧光光学系统的例子，但是图像获取单元不限定于此，也可以是在被检测光L2为来自生物体试样B的反射光的情况下的反射光系统或者在被检测光L2为来自生物体试样B的透射光的情况下的透射光光学系统。本实施方式的图像获取单元30具有激光光源31、光束扩展器32、第1空间光调制器(Spatial Light Modulator：SLM)33、分色镜34、光扫描器35、第2空间光调制器(SLM)36、检测器37、以及滤光片38。

激光光源31为本实施方式中的光照射部，对生物体试样B通过物镜12照射光L5。激光光源31为输出通过物镜12被照射于生物体试样B的光L5的光源。激光光源31与物镜12光学结合。光L5例如是包含生物体试样B的激发波长的激光。激光光源31例如通过包含半导体激光元件来构成。光束扩展器32例如通过包含被排列配置于光L5的光轴上的多个透镜32a、32b而构成，并调整相对于光L5的光轴垂直的截面的大小。

第1空间光调制器33与激光光源31光学结合。第1空间光调制器33呈现包含用于矫正起因于生物体试样B的表面形状的像差的像差校正全息图的全息图。第1空间光调制器33通过调制来自激光光源31的光L5从而生成照射到生物体试样B的照射光L1。另外，生物体试样B的表面形状是由前面所述的形状测量单元20来进行测量的。第1空间光调制器33既可以是相位调制型，也可以是振幅(强度)调制型。另外，第1空间光调制器33也可以是反射型以及透射型中的任何一种。此外，关于像差校正全息图的详细情况将在后面叙述。

分色镜34透过来自第1空间光调制器33的照射光L1以及来自显微镜单元10的被检测光L2中的一者并反射另一者。在图1所表示的例子中，分色镜34透过照射光L1并反射被检测光L2。

光扫描器35通过在垂直于照射光L1光轴的面内使照射光L1的光轴移动从而扫描生物体试样B上的照射光L1的照射位置。光扫描器35例如是由检流计反射镜(galvanometer mirror)、共振镜、MEMS反光镜或者多面反射镜(polygon mirror)构成。另外，来自生物体试样B的被检测光L2通过光扫描器35被检测。由此，能够使照射光L1的光轴与被检测光L2的光轴互相一致。

第2空间光调制器36与物镜12以及检测器37光学结合。第2空间光调制器36呈现用于矫正起因于生物体试样B的表面形状的像差的像差校正全息图。第2空间光调制器36调制来自分色镜34的被检测光L2。另外，生物体试样B的表面形状可以由前面所述的形状测量单元20来进行测量。第2空间光调制器36既可以是相位调制型也可以是振幅(强度)调制型。另外，第2空间光调制器36可以是反射型以及透射型中的任何一种。

另外，在将针孔配置于检测器37的前面的情况下，除了像差矫正全息图之外优选将用于被检测光L2聚光于针孔的全息图呈现于第2空间光调制器36。由此，就能够获得共焦效应。还有，在利用双光子吸收等双多光子吸收效应来检测由生物体试样B发生的荧光等被检测光L2的情况下，通过将用于被检测光L2聚光于检测器37的全息图与像差矫正用全息图合从而将其呈现于第2空间光调制器36，从而就能够获得共焦效应。另外，关于像差矫正全息图的细节将在后面进行陈述。

检测器37是本实施方式所涉及的光检测部。检测器37与物镜12相光学结合。检测器37检测从生物体试样B通过物镜12被输出的被检测光L2的光强度，并输出检测信号S2。检测器37可以是PMT(光电倍增管)、光电二极管以及雪崩光电二极管等的点式传感器。或者，检测器37也可以是CCD图像传感器、CMOS图像传感器、多阳极PMT、光电二极管阵列等的面图像传感器(area image sensor)。另外，也可以在检测器37的正前面配置聚光镜37a。

滤光片38被配置于分色镜34与检测器37之间的光轴上。滤光片38从输入到检测器37的光中滤去照射光L1的波长以及观察所不需要的荧光等的波长。另外，滤光片38可以被配置于聚光镜37a的前面或后面的任意位置。

另外，本实施方式的图像获取单元30除了上述结构之外还进一步具有反光镜39a以及反射部件39b。反光镜39a为了使光扫描器35与显微镜单元10的分束器14光学结合而使照射光L1以及被检测光L2的光轴弯曲。反射部件39b为具有2个反射面的棱镜，与第2空间光调制器36相对配置。反射构件39b在一个反射面上向第2空间光调制器36反射来自分色镜34的被检测光L2，并在另一个反射面上向检测器37反射来自第2空间光调制器36的被检测光L2。

在物镜12与第1空间光调制器33的距离较长的情况下，也可以将至少一个4f光学系统设置于照射光L1以及被检测光L2的光轴上。作为一个例子，图1中表示了2个4f光学系统51以及52。4f光学系统51以及52具有向物镜12的后侧焦点转送在第1空间光调制器33上生成的照射光L1的波前的作用。另外，4f光学系统也可以包含远心转像光学系统(telecentric relay optical system)。另外，在物镜12和第1空间光调制器33为极为接近的情况下，也可以省去4f光学系统。

控制单元40包含处理器(processor)。控制单元40控制显微镜单元10、形状测量单元20以及图像获取单元30。例如，控制单元40在显微镜单元10上使用物镜移动机构13来控制物镜12的光轴方向的位置。另外，控制单元40在与光轴方向相交叉的方向上使支撑生物体试样B的生物体试样台11移动。另外，控制单元40实行形状测量单元20的相干光源21、检测器24以及参照光用反光镜23的控制。进一步，控制单元40控制图像获取单元30的激光光源31、第1空间光调制器33、光扫描器35、第2空间光调制器36以及检测器37。本实施方式的控制单元40通过包含鼠标或键盘的输入装置41、显示装置(显示器)42以及计算机43来构成的。

另外，控制单元40构成本实施方式中的形状获取部的一部分。控制单元40与形状测量单元20的检测器24电结合。控制单元40输入从形状测量单元20的检测器24输出的检测信号S1。控制单元40根据该检测信号S1使用运用了傅立叶变换的方法或λ/4相移干涉法，并获取有关生物体试样B表面形状的信息。另外，控制单元40为本实施方式中的全息图制作部。控制单元40基于所获得的信息制作用于矫正起因于生物体试样B表面形状的像差的像差校正全息数据。像差校正全息数据被提供给第1空间光调制器33以及第2空间调制器36。

另外，控制单元40为本实施方式中的图像制作部。控制单元40根据来自检测器37的检测信号S2以及由光扫描器35得到的光照射位置的信息制作有关生物体试样B的图像。被制作好的图像被显示在显示装置42。另外，控制单元40既可以用相同的处理器也可以用不同的处理器来实现控制各个单元的功能、作为形状获取部的功能、作为全息图制作部的功能以及作为图像制作部的功能。

图2是表示上述的显微镜装置1A的操作的流程图。参照图2并就本实施方式所涉及的图像获取方法作如下说明。

首先，将生物体试样B载置于生物体试样台11上。接着，从形状测量单元20的光源21输出光L3，在检测器24上检测来自生物体试样B表面的反射光与参照光L31的干涉光L4。由此，观测生物体试样B表面上的干涉条纹。然后，根据该干涉条纹在控制单元40上获取有关生物体试样B的表面形状的信息(形状获取步骤S11)。

接下来，根据在形状获取步骤S11获取的信息，通过控制单元40制作用于矫正起因于生物体试样B的表面形状的像差的像差校正全息数据(全息图制作步骤S12)。接下来，基于像差校正全息数据的全息图被呈现于第1空间光调制器33以及第2空间光调制器36。然后，由第1空间光调制器33来调制从激光光源31输出的光L5，并向生物体试样B照射调制后的照射光L1(光照射步骤S13)。

接着，在检测器37上检测在生物体试样B上产生的被检测光L2的强度(光检测步骤S14)。此时，被检测光L2在由第2空间光调制器36调制之后输入到检测器37。另外，在本实施方式中，一边通过光扫描器35来扫描照射光L1一边重复进行光照射步骤S13以及光检测步骤S14(或者同时连续进行)。之后，根据光检测步骤S14中的检测信息在控制单元40上制作生物体试样B的图像(图像制作步骤S15)。

针对由具备以上所述结构的本实施方式的显微镜装置1A以及图像获取方法所得的效果进行说明。

在多数情况下，生物体试样B的表面不是平坦的。因此，发生起因于生物体试样B的表面形状的像差。例如，在观察作为生物体试样B的斑马鱼等鱼的情况下，如果鱼的表面形状被假定为大致圆筒形状，则在聚光过程的照射光L1通过其表面的时候，强烈发生像散。物镜12的数值孔径(NA)小或者如果是生物体试样B的浅位置的观察的话则其影响小，在数值孔径(NA)大或者深位置的观察的情况下就不能忽略像差的影响。于是，如果照射光L1受到了这样的像差的影响，则会产生在生物体试样B内部照射光L1的聚光强度变弱或者聚光形状扩大等的问题。由此，例如会发生由激发区域的伸长引起的光学分辨率的变差、荧光强度的降低、由背景噪声的增加引起的SN比(信噪比，signal to noise ratio)的降低等。

图3是示意性地表示像差发生的情况的图。在图3A中曲线B1表示生物体试样B的表面即生物体试样B与其外侧的边界。另外，将生物体试样B的外部的折射率设定为n1，将生物体试样B的内部的折射率设定为n2(≠n1)。照射光L1由物镜12聚光于生物体试样B的内部(表面正下方)。此时，照射光L1当中的通过物镜12的光轴A2附近的光L11基本上不会受到生物体试样B的表面形状的影响，并且向聚光点C一直前进。另一方面，照射光L1当中的通过从物镜12的光轴A2分开的位置的光L12受到生物体试样B表面形状的影响而折射，脱离聚光点C。由如此现象，在生物体试样B内部照射光L1的聚光强度变弱并且聚光图像D扩大。

在本实施方式的显微镜装置1A以及图像获取方法中，获取有关生物体试样B的表面形状的信息。然后，根据该信息生成用于矫正像差的像差校正全息数据。另外，通过基于该数据的全息图调制照射光L1。由此，因为起因于生物体试样B的表面形状的像差被适当地矫正，所以能够抑制生物体试样B内部的照射光L1的聚光强度的降低以及聚光图像D的扩大。

另外，也可以如本实施方式那样基于像差校正全息数据的全息图被呈现于第2空间光调制器36，并且在生物体试样B上产生的被检测光L2被第2空间光调制器36调制。由此，因为由起因于生物体试样B的表面形状的像差引起的对被检测光L2的影响被矫正，所以在实施使用了针孔的共焦的情况下，通过针孔的被检测光L2增加，从而能够使生物体试样B的图像更加鲜明。

在此，针对像差校正全息图的设计方法的细节叙述。图4示意性地表示了在没有被像差校正的平面波即照射光L6被物镜12聚光的时候，生物体试样B与其外侧的边界B1从相对于光轴A2为垂直的平面H仅倾斜角度α的时候的照射光L6的情况。在此，图中的光线L6a、L6b是通过物镜12的中心附近的光线，称为近轴光线。另外，图中的光线L6c、L6d是通过物镜12的边缘附近的光线，并且被称为外周部光线。

在光线通过生物体试样B与其外侧的边界的时候，根据由下述式(1)表示的斯涅耳定律(Snell's law)求得光线向边界B1入射的入射角θ₁以及出射角θ₂的关系。

n₁sin(θ₁±α)＝n₂sin(θ₂±α) (1)

关于近轴光线因为入射角小所以入射角以及出射角的变化量小。另外，关于外周部光线因为入射角大所以入射角以及出射角的变化量大。另外，因为边界B1相对于垂直于光轴A2的面倾斜，所以近轴光线以及外周部光线在光轴上不会重叠。由此，就会发生各种像差，其结果聚光图像成为与衍射极限图像不同的失真图像。

图5是用于说明计算如光线集中于光轴A2上的任意点O’的那样的波前的方法的图。圆弧Q、Q’为平面波通过焦点距离f的物镜12之后的波前，例如是半径一定的球冠。假如，在生物体试样B不存在的情况下，如以图中的两点划线所示照射光L6A聚光于光轴A2上的别的点O。在此，线段OQ(或者OQ’)与线段OT所成的角θ_max如下述式(2)所示。但是，NA(numerical aperture)为物镜12的数值孔径。另外，T为圆弧Q、Q’与光轴A2的交点。

θ_max＝sin^-1(NA/n₁) (2)

照射光L6A的光线从纸面的左侧输入到物镜12，并作为汇聚光向纸面的右侧行进。将该方向定义为正的传播方向，例如通过逆传播求得从点O’经过边界B1上的点V到达圆弧QQ’上的点W的光路。在本实施方式中，例如使用以下说明的逆光线跟踪、波前传播以及电磁场分析等方法并通过逆传播求得上述光路。

＜逆光线跟踪＞

在本实施方式中，在光路计算的前阶段做好使用干涉仪测量的生物体试样B的结构把握。在此，从生物体试样B的结构推定生物体试样B内的折射率分布，并求得折射率的边界B1。通过将该折射率的边界B1实施多项式近似法或者测图化从而以能够特定位置。

接下来，决定光线从点O’经过折射率边界B1上的点V到达圆弧QQ’上的点W的路径以及光路长。如果使来自点O’的光线逆传播则到达折射率边界B1上的点V。点V可由上述的多项式近似等来求得。光线由在边界B1前后的折射率差根据斯涅耳定律在点V处折射。在本实施方式中，因为设想有不均匀(具有不规则的凹凸)的边界B1，所以适用下式(3)所示的使用了向量和外积(vector and outer product)的三维斯涅耳定律。

n₁·m×VW＝n₂·m×O’V (3)

上述数式(3)中的×表示外积。另外，数式(3)中，m为在点V上的法线向量，VW、O’V分别为通过边界后以及通过边界前的方向向量。折射后再次使光线逆向传播并使其向圆弧QQ’上的点W传播。然后，查寻从点O’到点W的光路并计算出光路长L。光路长L例如由下式(4)来求得。

L＝n₁|VW|+n₂|O’V| (4)

相对于多根光线实行上述计算，并求得到达球冠的光线的所有光路长。从这些光路长经光路差求得相位差，去掉该相位差的模式成为像差校正模式即像差校正全息数据。另外，因为实际上折射率的边界B1存在有多个，所以也可以每个折射率的边界B1实行折射并使光线跟踪。此时，变更数学式(4)。

＜波前传播＞

使用菲涅耳衍射和菲涅耳-基尔霍夫(Fresnel-Kirchhoff)的衍射等，从聚光预定位置(点O’)使其渐渐地向物镜12作逆向传播。此时，在传播上加上折射率的边界B1来进行计算。该方法也可以与前所的逆光线跟踪或者与后所的电磁场分析相结合。例如，也可以相对于去除折射率的边界B1的部分进行逆光线跟踪，并相对于包含折射率的边界B1的部分进行波前传播。由此，就能够减轻计算负担。

＜电磁场分析＞

使用FDTD(时域有限差分，Finite-Difference Time-Domain)法或RCWA(严格耦合波分析，Rigorous Coupled-Wave Analysis)法来进行从想要聚光的点O’向物镜12侧的分析。此时，将折射率的边界B1加到边界条件。该方法也可以与前面所述的逆光线跟踪或者波前传播相组合。

通过上述的各方法的逆传播分析即使是在存在有2个折射率的边界的情况下其适用也是可能的。图6示意性地表示了存在2个折射率的边界B2、B3的情况。边界B2被做成相对于光轴为垂直。另外，将垂直于光轴A2的面H与边界B3所成的角设定为α。将边界B2的外侧的折射率设定为n1，将边界B2与边界B3之间的折射率设定为n2，将边界B3的内侧的折射率设定为n3。

图7(a)以及图7(b)是表示在该情况下使用逆传播分析来求得的波前的示意图，相位由浓淡色来表示。另外，图7是使用所谓相位折叠的技术来表现的。图7(a)表示作为α＝0°求得的波前。另外，图7(b)表示作为α＝0.3°求得的波前。另外，在这些波前的计算中设定n1＝1；n2＝1.33；n3＝1.38。在此情况下，n1为模拟空气，n2为模拟水，n3为模拟细胞。在n1与n2的边界B2上存在有盖玻片，但是由盖玻片引起的像差被物镜12的玻璃校正功能矫正。

被在光轴上的边界B2和边界B3夹住的区域(即被盖玻片和细胞夹住的区域)例如由磷酸缓冲生理盐水充满。在光轴上的边界B2与边界B3的距离E1例如是30μm。另外，将物镜12的倍率设定在40倍，将数值孔径(NA：numerical aperture)设定在0.75，将在光轴上的点O与边界B3的距离E2设定为300μm，将点O与点O’的距离E3设定在80μm。另外，在上述条件下，除了球面像差之外，波前还包含慧形像差(coma aberration)以及像散。如图7(a)以及图7(b)所示，通过前面所述的逆传播分析正好求得照射光所必要的波前。然后，根据该波前适当地求得像差校正全息图。

另外，作为矫正起因于生物体试样B的表面形状的像差的方法，例如考虑组合相位调制器[主要是可变形反射镜(deformable mirror)]和波前测量仪[夏克-哈特曼传感器(Shack-Hartmann sensor)]，并进一步将大小或形状已知的荧光珠埋入到生物体试样B内部的特定位置的方法。在该方法中，激发光和来自荧光珠的荧光一起受到像差的影响。因此，通过使用波前测量仪来测量荧光强度分布从而就能够测量像差。然后，将矫正了该像差的全息图呈现于相位调制器。此时，将荧光珠作为参照信息来使用。

然而，在这样的方法中，有必要通过外科手术来埋入荧光珠，埋入荧光珠很困难，或者通过埋入荧光珠生物体试样B的状态发生变化的情况下不能适用。相对于此，通过本实施方式的方法则没有必要埋入荧光珠。

另外，也考虑了下述方法，即，将设想为像差减少的多个全息图呈现于空间光调制器，并扫描被该空间光调制器调制后的照射光从而选择所获得的图像的辉度或分辨率提高的全息图等的通过试误法获得像差校正全息图的方法。

然而，在这样的方法中，为了重复实验以及设计需要长时间。另外，所获得的像差校正全息图成为近似解的可能性高，并且精度被抑制得较低。相对于此，在本实施方式的方法中，由于所有像差校正全息数据的运算都是在计算机43中进行，所以与伴有由操作人员进行的试误法的方法相比，能够缩短所需要的时间。另外，在本实施方式的方法中，因为计算机43根据在形状测量单元20上所取得的表面形状的信息制作像差校正全息数据，所以能够提高像差矫正的精度。

另外，也考虑了将生物体试样B上产生的荧光分支并由透镜将分支的一支荧光进行聚光，通过由照相机来拍摄该聚光图像从而矫正像差的方法(参照专利文献1)。在没有由生物体试样B表面形状引起的像差的情况下聚光图像成为衍射极限图像，但是在存在像差的情况下聚光图像成为具有失真的形状。因此，在该方法中通过预先记忆对应于多个聚光图像形状的多个像差的条件并从其中挑选恰当的条件，从而进行像差校正。

然而，在这样的方法中，所获得的像差校正全息图成为近似解的可能性高，并且精度被抑制得较低。在本实施方式的方法中，因为计算机43根据在形状测量单元20所获取的表面形状的信息制作像差校正全息数据，所以能够提高像差校正的精度。

另外，呈现于第1空间光调制器33以及第2空间光调制器36的全息图也可以不是像差校正全息图本身。例如，也可以是重叠了用于控制被照射于生物体试样B的照射光L1的聚光形状或聚光位置的全息图等其他的全息图和像差校正全息图的全息图。

(第2实施方式)

在上述第1实施方式中已叙述了针对起因于生物体试样B表面形状的像差的矫正，但是也会由生物体试样B的表面正下方的内部结构而发生像差。以下针对这样的现象进行详细说明。

即使是将具有一定光强度的照射光照射于生物体试样B上的情况，在生物体试样B的深位置和浅位置上观察到的荧光强度也不同。这是由起因于生物体试样B的内部结构的照射光或荧光的散射以及像差产生的结果。这样的散射以及像差的发生的原因之一是由宏观上血管等的结构、微观上构成细胞的器官的折射率差而产生的光路变化。特别是在生物体试样B的深位置上，光路由内部结构而发生变化并且照射光的聚光形状大大变化。由此，就会发生被观察到的荧光强度以及分辨率的降低、由背景噪声引起的S/N比的降低。

因此，在本实施方式中，测量在生物体试样B表面正下方的伴随折射率差的内部结构，将包含用于矫正起因于该内部结构的像差的像差校正全息图的全息图呈现于第1空间光调制器33以及第2空间光调制器36。由此，就能够抑制被检测光L2的强度以及分辨率的降低、由背景噪声引起的S/N比的降低。

图8是从侧方观察生物体试样B的示意图，并且示意性地表示了照射光通过包含折射率互相不同的媒介Ba以及Bb的内部结构并被聚光的情况。图8(a)以及图8(b)表示了假定无像差时的照射光L7的聚光的情况，并且表示了分别聚光于生物体试样B的浅位置和深位置的情况。如图8(a)所示在聚光于浅位置的情况下，存在于光路上的折射率的边界比较少，如图8(b)所示越是聚光于深位置则存在于光路上的折射率的边界越是增加。因此，在此情况下，实际上如图8(c)所示照射光会受到由生物体试样B的内部结构产生的影响。

如图8(c)所示在不实行像差校正的情况下，透镜外周部附近的光线L7c、L7d受到内部结构的影响而发生折射。另一方面，光轴A2附近的光线因为折射角小，所以难以受到内部结构的影响。其结果，光轴A2附近的光线的聚光位置和光线L7c、L7d的聚光位置变得互相不同，并且发生像差。图8(d)表示了这样的像差被矫正的情况。通过考虑内部结构的折射率分布来矫正照射光L7的波前，从而光轴A2附近的光线的聚光位置和光线L7c、L7d的聚光位置互相一致，并且照射光L7能够在高密度下聚光。

图9是表示本实施方式的显微镜装置1B结构的图。显微镜装置1B与第1实施方式的显微镜装置1A的不同点为形状测量单元20的有无。即，本实施方式的显微镜装置1B不具备形状测量单元20，取而代之的是显微镜单元10的物镜移动机构13、以及图像获取单元30的激光光源31、光扫描器35以及检测器37构成获取有关生物体试样B的表面正下方的内部结构的信息的形状获取部。于是，在本实施方式中在光轴方向上移动物镜12，计算机43根据所获得的检测信号S2获取有关生物体试样B的内部结构的信息。另外，图像获取单元30包含检测器37并与物镜12相光学结合。

通过本实施方式的结构，可以获取有关生物体试样B的表面正下方的内部结构的信息。即，如果使用恰当的荧光材料，则在所获得的荧光图像中包含有关生物体试样B的内部结构的信息。在此，使用物镜移动机构13来按顺序改变物镜12与生物体试样B的距离。如果使照射光(激发光)L1聚光于生物体试样B内部的深位置，则从存在于照射光(激发光)L1的光路上的生物体试样B内部的结构物发出荧光(包括自发荧光)。因此，通过一边放浅聚光位置一边获取荧光强度，从而就能够把握生物体试样B的折射率分布。于是，通过将考虑了所把握的折射率分布的像差校正全息图呈现于第1空间光调制器33以及第2空间光调制器36，从而就能够减轻像差的影响。

另外，在本实施方式中，生物体试样B如果是由荧光色素、荧光蛋白质、自发荧光、二次谐波产生(SHG)等而从特定部位发出荧光的物质即可。另外，在以下的说明中，将通过物镜移动机构13、激光光源31、光扫描器35以及检测器37的如上述那样的用于内部结构的测量的动作称为预扫描。

在如显微镜装置1B那样的激光扫描型荧光显微镜中，为了观察相对于光轴垂直的面内的荧光图像，进行由光扫描器35[例如XY检流计(galvanometer)]的扫描。于是，通过物镜12或者生物体试样台11在光轴方向上移动，从而获得深度各不相同的多个面内的信息。最终通过组合这些信息从而构筑出三维信息。

另外，形状获取部也可以替代上述结构或者与上述结构一起使用被用于单光子的荧光观察的光片光(light sheet light)或者超声波等来测量折射率分布。由此，可以在观察前预先把握大概结构，并且能够适合地设计为了矫正起因于该结构的像差的像差校正全息图。

图10是表示上述的显微镜装置1B的操作以及本实施方式所涉及的图像获取方法的流程图。首先，将生物体试样B载置于生物体试样台11上。接下来，一边在光轴方向上移动物镜12一边渐渐地将聚光位置从生物体试样B的浅位置向深位置移动。同时，从激光光源31输出光L5并使照射光L1聚光于生物体试样B的表面正下方。由此，在生物体试样B的表面正下方的内部结构中，生成被检测光(荧光)L2。被检测光L2由光扫描器35去扫描(de-scan)，并由分色镜34反射。于是，检测器37检测被去扫描的被检测光L2并输出检测信号S2。

另外，此时不进行通过第1空间光调制器33的像差校正。由此，检测出了起因于生物体试样B表面正下方的内部结构的深度方向的荧光的变化。于是，一边通过光扫描器35来移动照射光L1的光轴一边重复该动作。由此，构筑了有关于生物体试样B的内部结构的三维的信息。然后，从被构筑出的三维信息推定折射率分布(形状获取步骤S21)。

之后，实行与第1实施方式相同的全息图制作步骤S12、光照射步骤S13、光检测步骤S14以及图像制作步骤S15。另外，在深位置上的观测中，由于照射光L1以及被检测光L2通过所推定的折射率分布的一部分乃至全部，所以在全息图制作步骤S12中可以以相对于通过中的照射光L1以及被检测光L2的折射率分布的影响变小的方式制作像差校正全息图。在本实施方式中，像差校正全息图是使用几何光学、波动光学、电磁场分析等并根据由逆传播求得的波前来设计的。几何光学例如是逆光线跟踪，波动光学例如是菲涅耳波前传播或者菲涅耳-基尔霍夫的衍射，电磁场分析例如是FDTD或者RCWA。

另外，在上述第1实施方式中，根据生物体试样B的表面形状制作像差校正全息图，在本实施方式中根据生物体试样B的表面正下方的伴有折射率分布的结构制作像差校正全息图，但是也可以根据生物体试样B的表面形状和生物体试样B的表面正下方的结构两者制作像差校正全息图。

另外，本实施方式的形状获取部使用通过照射照射光L1而获得的荧光来取得有关生物体试样B的表面正下方的结构的信息，形状获取部既可以使用超声波来测量生物体试样B的在表面正下方的折射率分布，也可以使用相位差或微分干涉来测量表面正下方的折射率分布。或者，形状获取部也可以通过摆动光轴的角度或者改变浸液的折射率，并从反射或透过等推定表面正下方的折射率分布或散射程度。由此，就能够推定特别是在生物体试样B表面上的折射率分布。例如在摆动光轴的角度的情况下，从布儒斯特角(Brewster's angle)或角度与反射率的关系推定生物体试样B的表面的折射率或试样内部的折射率分布。

针对通过具备以上结构的本实施方式的显微镜装置1B以及图像获取方法所获得的效果作如下说明。在本实施方式的显微镜装置1B以及图像获取方法中，是获取有关生物体试样B的表面正下方的内部结构的信息。然后，根据该信息生成用于矫正像差的像差校正全息数据。另外，由基于该数据的全息图调制照射光L1。由此，因为起因于生物体试样B的表面正下方的内部结构的像差被适当地矫正，所以能够抑制在生物体试样B的内部的照射光L1的聚光强度的降低以及聚光形状的扩大。

另外，在本实施方式中，也可以是基于像差校正全息数据的全息图被呈现在第2空间光调制器36，并且在生物体试样B上生成的被检测光L2被第2空间光调制器36调制。由此，因为由起因于生物体试样B的表面正下方的内部结构的像差引起的对被检测光L2的影响被矫正，所以能够使生物体试样B的图像更鲜明。

(第1变形例)

图11是用于说明第1变形例的操作的图，并且是从光轴方向观察生物体试样B的表面得到的图。在第2实施方式中，形状获取部(在形状获取步骤中)也可以如图11所示通过将生物体试样B的表面分割成格子状的多个区域F1～F4，且分别在各区域F1～F4上并行实行小面积的扫描。在此情况下，分别按各区域F1～F4制作各自的像差校正全息图，并在第1空间光调制器33上呈现具有像差校正以及多点生成的效果的全息图。

图12(a)以及图12(b)是表示与生物体试样B的外侧的边界B1的一个例子的图。如图12(a)所示，在照射光L1扫描宽大区域的情况下，因为物镜12与边界B1的距离以及生物体试样B的表面正下方的内部结构发生较大变化，所以也可以在中途更换像差校正全息图。然而，在此情况下因为空间光调制器的动作迟缓所以会牵涉时间的损失。相对于此，如图12(b)所示，如果分割成多个区域F1～F4以减小扫描区域，则没有必要更换像差校正全息图，并能够实现高精度且高速的扫描。

(第2变形例)

图13是表示第2变形例所涉及的显微镜装置1C结构的图。在本变形例的显微镜装置1C中，形状测量单元20B构成形状获取部。形状测量单元20B具有光源25、分色镜26、光扫描器27、检测器28以及滤光片29。形状测量单元20B包含检测器28并与物镜12光学结合。

光源25输出照射于生物体试样B的激发光L8。另外，在本变形例中，与第2实施方式同样，生物体试样B可以是由荧光色素、荧光蛋白质、自发荧光、SHG等从特定部位发出荧光的物质。于是，激发光L8是包含激发生物体试样B的波长的光。激发光L8既可以是与从激光光源31输出的光L5相同波长的光也可以是不同波长的光。

分色镜26透过来自光源25的激发光L8以及来自显微镜单元10的荧光L9中的一者，并反射另一者。在图13所示的例子中，分色镜26反射激发光L8，并透过荧光L9。

光扫描器27通过在垂直于激发光L8的光轴的面内移动激发光L8的光轴从而扫描生物体试样B上的激发光L8的照射位置。光扫描器27例如由检流计反射镜(galvanometer mirror)、共振镜或者多面反射镜构成。另外，来自生物体试样B的荧光L9通过光扫描器27被检测。由此，能够使激发光L8的光轴与荧光L9的光轴互相一致。

检测器28检测通过物镜12从生物体试样B输出的荧光L9的光强度，并输出检测信号S3。检测器28也可以是PMT(光电倍增管)、光电二极管以及雪崩光电二极管等点式传感器。或者，检测器28也可以是CCD图像传感器、CMOS图像传感器、多阳极PMT、光电二极管阵列等面图像传感器(area image sensor)。另外，也可以通过在检测器28的前面配置针孔来提供共焦效应。

滤光片29被配置于分色镜26与检测器28之间的光轴上。滤光片29从输入到检测器28的光中滤去激发光L8的波长以及观察所不需要的荧光等的波长。

在物镜12与光源25的距离较长的情况下，也可以在激发光L8以及荧光L9的光轴上设置至少一个4f光学系统。作为一个例子，在图13中表示了一个4f光学系统53。4f光学系统53被配置于光扫描器27与分束器14之间的光轴上。

在本变形例中，首先，将生物体试样B载置于生物体试样台11上。接下来，一边在光轴方向上移动物镜12一边渐渐地将聚光位置从生物体试样B的浅位置向深位置移动。同时，从光源25输出激发光L8，并在检测器28上检测来自生物体试样B的表面正下方的内部结构的荧光L9。由此，检测出起因于生物体试样B的表面正下方的内部结构的深度方向荧光的变化。于是，一边由光扫描器27来移动激发光L8的光轴一边重复进行该操作。由此，就构筑出了有关生物体试样B的内部结构的三维信息。然后，从被构筑出的三维信息推定折射率分布。以后的操作与前面所述的第2实施方式相同。另外，在激发光L8的波长包含于从激光光源31输出的光L5的波长的情况下，由激光光源31以及光扫描器35也可以实现光源25以及光扫描器27的功能。在此情况下，不再需要光源25以及光扫描器27、分色镜26。

(第3变形例)

在前面所述的第2实施方式中，重复多次预扫描，在第2次以后的预扫描中也可以根据前一次预扫描的结果由第1空间光调制器33来矫正光L5的像差。由此，就能够在将光L5照射于生物体试样B时减轻起因于生物体试样B的内部结构的像差的影响，从而能够更加正确地把握生物体试样B的结构并获得更高分辨率的图像。

具体而言，在最初的预扫描的时候因为不实施像差校正所以照射光L1成为平面波，在第2次预扫描中将要矫正像差的波前提供给照射光L1。于是，根据由第2次以后的预扫描获得的生物体试样B的结构，设计像差校正全息图。或者，由最初的预扫描来实行大概的像差校正，也可以由第2次以后的预扫描来实行更加细致的像差校正。

(第4变形例)

图14是表示第4变形例所涉及的显微镜装置1D结构的图。在本变形例中，将瞬逝场(evanescent field)用于生物体试样B的表面形状的测量。由此，就容易把握生物体试样B是否接地于生物体试样台11的形状。另外，在变形例中，为了发生瞬逝场而使用产生全反射的物镜12以及生物体试样台11(盖玻片)。

在本变形例的显微镜装置1D中，形状测量单元20C构成形状获取部。形状测量单元20C具有光源25、分色镜26、检测器28、滤光片29以及聚光镜61。另外，光源25、分色镜26、检测器28以及滤光片29的结构与第3变形例相同。形状测量单元20C与物镜12光学结合。

聚光镜61是在激发光L8为面照明的情况下设置的，并且是配置于分色镜26与显微镜单元10之间的光轴上。聚光镜61使激发光L8聚光于物镜12的后侧焦点面上。另外，在激发光L8为点照明的情况下，不需要聚光镜61。在此情况下，也可以例如使作为平面波的激发光L8输入到物镜12的发生全反射的区域，并由光扫描器或者生物体试样台11的平面移动来实行激发光L8的扫描。另外，也可以替代物镜12而使用棱镜或光纤。

(第5变形例)

图15是表示第5变形例所涉及的显微镜装置的显微镜单元10B以及形状测量单元20D的结构的图。在本变形例中，通过超声波来测量生物体试样B的弹性，并利用生物体试样B的区域间的弹性差来获得生物体试样B的结构。于是，根据所获得的结构制作像差校正全息图。另外，在图15中省略了图1以及图9所表示的图像获取单元30以及控制单元40的图示。

如图15所示，本变形例的形状测量单元20D具有脉冲发生源62以及作为检测器的信号接收器63。脉冲发生源62发生用于发生超声波的脉冲信号S4。信号接收器63接收包含有关生物体试样B的内部结构的信息的脉冲信号S5。

显微镜单元10B中，替代图1以及图9所示的显微镜单元10的物镜12而具有附有压电薄膜的透镜64。另外，对于其他结构则与显微镜单元10相同。附有压电薄膜的透镜64以与生物体试样B相对的形式配置，通过压电薄膜将脉冲信号S4转换成超声波并将该超声波照射于生物体试样B，另外，将在生物体试样B上反射的超射波转换成脉冲信号S5。此外，在本变形例中，相对于脉冲信号S4和脉冲信号S5使用共同的带有压电薄膜的透镜，但是也可以个别设置脉冲信号S4用的带有压电薄膜的透镜和脉冲信号S5用的带有压电薄膜的透镜。

(第6变形例)

图16是表示第6变形例所涉及的显微镜装置1E结构的图。在本变形例中，将相位差·微分干涉用于生物体试样B的表面形状的测量。在本变形例的显微镜装置1E中，形状测量单元20E构成形状获取部。形状测量单元20E具有光源21、分束器22、检测器24、微分干涉(DIC)棱镜66以及偏振镜67。形状测量单元20E与物镜12光学结合。另外，光源21、分束器22、检测器24的结构与第1实施方式相同。

DIC棱镜66以及偏振镜67排列配置于分束器22与物镜12之间的光路上。DIC棱镜66将来自光源21的光L3分支成2支，另外，使来自生物体试样B的返回光L10重叠。偏振镜67限制光L3以及L10的偏光。从生物体试样B经过DIC棱镜66以及偏振镜67到达分束器22的光L10透过分束器22而输入到检测器24。

本发明的一个方面所涉及的显微镜装置以及图像获取方法不限于上述实施方式，可以是其他各种各样的变形。例如，在上述实施方式中，像差校正全息图呈现于第1空间光调制器以及第2空间光调制器，但是像差校正全息图也可以仅呈现于第1空间光调制器。即使是如此情况，也能够抑制在生物体试样内部的照射光的聚光强度的降低以及聚光形状的扩大。另外，在上述的实施方式中，已针对显微镜单元10为倒立型显微镜的情况作了说明，但是显微镜单元10也可以是正立型显微镜。

上述实施方式所涉及的显微镜装置是一种获取生物体试样的图像的显微镜装置，并且作为构成具备：支撑生物体试样的生物体试样台、与生物体试样台相对的物镜、相对于生物体试样通过物镜照射光的光照射部、获取有关生物体试样的表面形状以及生物体试样的表面正下方的结构中的至少一者的信息的形状获取部、根据在形状获取部上获取的信息制作用于矫正起因于至少一者的像差的像差校正全息数据的全息图制作部、呈现基于像差校正全息数据的全息图并调制从光照射部向生物体试样照射的光的空间光调制器、检测在生物体试样上产生的光的强度的光检测部、根据来自光检测部的输出制作生物体试样的图像的图像制作部。

另外，上述实施方式所涉及的图像获取方法是一种获取生物体试样的图像的方法，作为构成具备下述步骤：获取有关被与物镜相对的生物体试样台所支撑的生物体试样的表面形状、以及生物体试样的表面正下方的结构中的至少一者的信息的形状获取步骤、根据在形状获取步骤中获取的信息制作用于矫正起因于至少一者的像差的像差校正全息数据的全息图制作步骤、将基于像差校正全息数据的全息图呈现于空间光调制器并由空间光调制器来调制从光照射部出射的光并向生物体试样照射调制后的光的光照射步骤、检测在生物体试样上产生的光的强度的光检测步骤、根据在光检测步骤中的检测信息制作生物体试样的图像的图像制作步骤。

另外，上述实施方式所涉及的显微镜装置是一种获取生物体试样的图像的装置，并且作为构成具备：支撑生物体试样的生物体试样台、与生物体试样台相对配置的物镜、输出通过物镜而照射于生物体试样的光的光源、获取有关生物体试样的表面形状以及生物体试样的表面正下方的结构中的至少一者的信息的形状获取部、根据在形状获取部上获取的信息制作用于矫正起因于至少一者的像差的像差校正全息数据的全息图制作部、呈现基于像差校正全息数据的全息图并调制从光源输出的光的空间光调制器、检测在生物体试样上产生的光的强度并输出检测信号的光检测部、根据检测信号制作生物体试样的图像的图像制作部。

另外，上述实施方式所涉及的图像获取方法是一种获取生物体试样的图像的方法，并且作为构成来说具备下述步骤：获取有关由与物镜相对的生物体试样台支撑的生物体试样的表面形状以及生物体试样的表面正下方的结构当中至少一者的信息的形状获取步骤、根据在形状获取步骤所获取的信息制作用于矫正起因于至少一者的像差的像差校正全息数据的全息图制作步骤、将基于像差校正全息数据的全息图呈现于空间光调制器并由空间光调制器来调制从光源输出的光从而向生物体试样照射调制后的光的光照射步骤、检测在生物体试样上产生的光的强度并输出检测信号的光检测步骤、根据在光检测步骤中的检测信号制作生物体试样的图像的图像制作步骤。

另外，上述的显微镜装置也可以做成进一步具备呈现基于像差校正全息数据的全息图并调制在生物体试样上产生的光的第2空间光调制器。另外，上述的图像获取方法也可以作为构成而在光检测步骤中将基于像差校正全息数据的全息图呈现于第2空间光调制器，并由第2空间光调制器来调制在生物体试样上产生的光并检测调制后的光的强度。

由此，因为由起因于生物体试样的表面形状以及生物体试样的表面正下方的结构中的至少一者的像差引起的对在生物体试样上产生的光的影响被矫正，所以能够使生物体试样的图像更加鲜明。

另外，也可以取代激光光源31而使用输出非相干光(incoherent light)的非相干光源。非相干光源例如包括超辐射发光二极管(SLD：super luminescent diode)或发光二极管(LED)、ASE(放大自发辐射，Amplified Spontaneous Emission)光源、灯类光源。

产业上的利用可能性

本发明的一个方面可以作为能够抑制在生物体试样内部的照射光的聚光强度的降低以及聚光形状的扩大的显微镜装置以及图像获取方法来利用。