基于双孤子脉冲产生的相干反斯托克斯拉曼显微成像系统的制作方法
本发明属于非线性光学显微成像技术领域，特别涉及一种基于双孤子脉冲产生的相干反斯托克斯拉曼显微成像系统。
背景技术：
相干反斯托克斯拉曼散射(Coherent anti-Stokes Raman Scattering，CARS)是一种三阶非线性光学过程，可以实现对分子振动能级的共振激发和相干探测。一般而言CARS的信号强度比普通的拉曼过程提高了104-105倍；与此同时，与荧光显微术相比CARS信号来源于分子的本征特性，不需要引入任何外部标记，因此CARS技术可以实现无需标记、高灵敏度以及三维成像；在快速动态的生命科学研究中具有重要的意义。然而，在产生CARS信号的同时，还会产生不含有分子振动能级信息的非共振信号，其来源于分子内电子对激发光的不同形式的响应。由于共振与非共振电场的耦合叠加，造成了CARS光谱的峰形与峰位都产生了严重的畸变。特别是对于指纹区的分子振动而言，非共振背景强度远大于振动信号，这使得对CARS信号的提取变得异常困难。与此同时，非共振背景极大地降低了CARS显微成像中图像的对比度，甚至引入虚假的图像衬度。这些问题都极大地制约了相干反斯托克斯拉曼散射技术在实际中的应用。
为了实现对CARS信号中非共振背景的抑制或消除，从而准确地提取出分子能级的振动信息，一种称之为调频法的技术被提了出来，其是基于拉曼振动与非共振背景对外差电场频差的依赖程度不同而提出的。在一定的范围内，荧光光谱几乎不会随着外差电场的变化而变化，相反分子振动却会紧密跟随外差电场的变化而发生移动。若采用两个不同频率的外差电场对样品分子进行共振激发，得到两组具有微小频移的CARS光谱信号，再利用差分方法，得到两个散射谱的差值谱，则在该差值谱中非共振的背景信号几乎被完全消除，而拉曼信号却能够保留下来。为了获得多个不同频率的外差电场，目前的调频CARS技术至少需要三列不同的飞秒脉冲序列，因此需要多个固体脉冲激光器，或者改造复杂的固体光参量震荡器(OPO)以获得两列不同的飞秒脉冲序列。这极大地增加了CARS光源的复杂性和探测成本；同时固体的脉冲激光器对环境的变化极其敏感，难以保证稳定的成像系统。除此之外，快速的波长调谐性在固体激光器中也难以实现。
技术实现要素：
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于双孤子脉冲产生的非共振背景抑制的相干反斯托克斯拉曼显微成像系统，用于获得高非共振背景下的CARS光谱及其显微图像，在使用单一光纤飞秒激光器的基础上，采用强双折射、高非线性产生双孤子脉冲的技术，可以显著抑制CARS光谱中的非共振背景，提高CARS显微成像中的图像对比度，同时克服相干拉曼激发光源的复杂性，提高对环境的抗干扰能力。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种基于双孤子脉冲产生的相干反斯托克斯拉曼显微成像系统，包括：
用于产生原始飞秒脉冲11的光纤激光器1；
用于产生双孤子脉冲12的双孤子脉冲产生与拓谱单元4；
用于实现脉冲时域扫描的光学脉冲扫描单元5；
用于调节飞秒脉冲11进入双孤子脉冲产生与拓谱单元4和光学脉冲扫描单元5比例的功率比例控制单元；
用于对待检测样品进行聚焦激发和信号光子收集的显微成像系统；
以及，
用于对信号光子进行探测、提取处理以及显微图像显示部分。
所述双孤子脉冲12为时域上相互分离，同时频谱成分具有微小的差异的线性啁啾脉冲，所述双孤子脉冲产生与拓谱单元4包括依次设置的反射镜一4-1、二分之一波片4-2、双折射高非线性光纤4-3、低通滤光片4-4、反射镜二4-5以及色散元件4-6。
所述双孤子脉冲产生与拓谱单元4中，反射镜一4-1和反射镜二4-5用于转折光路，二分之一波片4-2控制进入双折射高非线性光纤4-3的脉冲偏振态，双折射高非线性光纤4-3的双折射特性使得产生两个时域分开的脉冲，双折射高非线性光纤4-3的高非线性与负色散特性使得实现对两个脉冲的波长红移，并保证出射脉冲为孤子脉冲；低通滤光片4-4滤除掉原始波长分量，只留下孤子脉冲的波长成分，保证相干拉曼激发中对分子能级选择的单一性；色散元件4-6为产生的双孤子引入线性啁啾，将其展宽为啁啾Stokes脉冲即双孤子脉冲12，包括啁啾Stokes脉冲一12-1与啁啾Stokes脉冲二12-2。
所述光学脉冲扫描单元5包括：
用于转折光路的反射镜三5-1和反射镜四5-3；
用于实现原始飞秒脉冲11时域延迟的光学延迟导轨5-2；
以及用于对时域延迟后的原始飞秒脉冲11中引入线性啁啾，进而得到啁啾泵浦脉冲13的色散元件5-4。
所述功率比例控制单元包括：
用于调节原始飞秒脉冲11偏振态的二分之一波片2；
用于将偏振态调节后的原始飞秒脉冲11分成两束分别进入双孤子脉冲产生与拓谱单元4和光学脉冲扫描单元5的偏振立方分束体3；
以及，
用于将分别从双孤子脉冲产生与拓谱单元4出射的双孤子脉冲12和光学脉冲扫描单元5出射的啁啾泵浦脉冲13合光的二向色镜6。
所述对待检测样品进行聚焦激发和信号光子收集的显微成像系统包括：
由用于实现聚焦激发的显微物镜、实现信号光子收集的显微物镜以及物镜安装的镜架组成的显微镜系统7；
以及，用于实现相干拉曼显微成像的扫描样品台8。
所述用于对信号光子进行探测、提取处理以及显微图像显示部分包括：
用于对信号光子进行探测的光谱仪器9；
以及，用于运行算法进行非共振背景扣除和显微图像合成、显示的计算机10。
所述算法过程如下：
1)首先得到差分的相干拉曼信号ΔICARS(ω)＝ICARS_1(ω1)-ICARS_2(ω2)，其中，ICARS_1(ω1)为啁啾泵浦脉冲13与啁啾Stokes脉冲一12-1所产生相干反斯托克斯拉曼信号，ω1代表该信号的频率；ICARS_2(ω2)为啁啾泵浦脉冲13与啁啾Stokes脉冲二12-2所产生相干反斯托克斯拉曼信号，ω2代表该信号的频率；
2)对差分的干拉曼信号进行傅里叶变换处理：
其中ICARS(ω)为真实相干反斯托克斯拉曼信号；F表示傅里叶变换，F-1表示傅里叶反变换；
3)最后恢复出真实相干反斯托克斯拉曼信号：
|ICARS(ω)|2＝exp[k×∫Re{ICARS(ω)}dωas]。
k是用于恢复的比例常数；可以根据自发拉曼光谱数据库加以确定。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.采用一段具有双折射和高非线性光纤产生两个不同频率成分的双孤子脉冲，避免了传统调频CARS技术中光源的复杂性和高的探测成本。
2.采用单一光纤激光器作为唯一的激发光源，对具有更好的抵抗外界环境变化的能力，提高了成像系统的稳定性。
3.采用高非线性光纤拓谱的方式，可以同时进行波长的快速调谐和宽带光谱的探测，避免了传统固体脉冲激光器波长调谐的时间成本。
附图说明
图1是本发明相干反斯托克斯拉曼显微光谱与成像系统框图。
图2是传统CARS显微图像示意图。
图3是本发明相干反斯托克斯拉曼显微成像结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例详细说明本发明的实施方式。
本发明在仅仅使用单一光纤激光器的基础上，结合双折射高非线性光纤产生双孤子脉冲，实现了对分子振动能级的调频相干反斯托斯的拉曼探测，基于差分的CARS信号，运用共振信号实部及其模的平方的关系，通过特定的后处理算法获得了真实的CARS光谱信号；极大程度地简化了相干拉曼的激发光源，实现了对非共振背景的抑制与消除。
如图1所示，一种基于双孤子脉冲产生的相干反斯托克斯拉曼显微成像系统，包括：用于产生原始飞秒脉冲11的光纤激光器1；用于产生双孤子脉冲12的双孤子脉冲产生与拓谱单元4；用于产生实现脉冲时域扫描的光学脉冲扫描单元5；用于对待检测样品进行聚焦激发，信号光子收集的显微成像系统；以及用于对信号光子进行探测，提取处理以及显微图像显示部分；其中，光纤飞秒激光器1与双孤子脉冲产生与拓谱单元4以及光学脉冲扫描单元5之间设置调节飞秒脉冲11进入双孤子脉冲产生与拓谱单元4和光学脉冲扫描单元5比例的功率比例控制单元。
光纤激光器1在本实施例中为超短脉冲掺镱激光器(也可以为超短脉冲掺铒激光器)，可获得中心波长在1060nm，光谱带宽50nm，脉冲宽度50fs，脉冲能量20nJ的输出光。
功率比例控制单元是连接脉冲激光器1、双孤子脉冲产生与拓谱单元4、光学脉冲扫描单元5以及显微成像系统的元件；包括二分之一波片2、偏振立方分束体3和二向色镜6。
二分之一波片2调节原始飞秒脉冲11偏振态，偏振立方分束体3将原始脉冲按垂直偏振方向分为两部分，通过旋转二分之一波片2的角度，可以方便地控制这两部分脉冲的功率比例，进而保证最佳的输入功率进入双孤子脉冲产生与拓谱单元4，从而获得满足后续CARS探测要求的双孤子拓谱波长；二向色镜6用于将分别从双孤子脉冲产生与拓谱单元4出射的双孤子脉冲12和光学脉冲扫描单元5出射的啁啾泵浦脉冲13进行合光，进入后续的显微成像系统。
双孤子脉冲产生与拓谱单元4是产生具有合适激发波长的啁啾双孤子脉冲的关键部分。经过偏振立方分束体3分束的一路脉冲经反射镜一4-1后入射进入双折射高非线性光纤4-3；在此之前，二分之一波片4-2精确地调节入射脉冲的偏振态，从而控制入射脉冲在双折射光纤快轴与慢轴上的能量分配比例，进而控制出射的两个孤子脉冲在时域上的间隔，同时也能调节两个脉冲的中心波长的差异；从双折射高非线性光纤4-3出射的两个脉冲在自相位调制和群速度色散的共同作用是符合傅里叶变换极限的孤子脉冲，经过低通滤光片4-4后只保留孤子脉冲的长波分量。在本实施例中，孤子脉冲波长大于1180nm，并且可以在1180nm-1350nm的范围内进行连续的调谐。孤子脉冲经反射镜二4-5反射后进入色散元件4-6。色散元件采用高折射率材料或者光栅对的方式在脉冲中引入线性啁啾；在本实施例中采用肖特玻璃生产的牌号为SF57的玻璃引入啁啾，经过色散元件后，孤子脉冲展宽为皮秒量级的啁啾Stokes脉冲，即双孤子脉冲12，包括啁啾Stokes脉冲一12-1与啁啾Stokes脉冲二12-2。作为相干拉曼显微成像过程中的啁啾脉冲。
光学脉冲扫描单元5用于实现啁啾泵浦脉冲13在时域上对双孤子脉冲12的快速扫描。包括反射镜三5-1和反射镜四5-3、光学延迟导轨5-2以及色散元件5-4。其中，反射镜用于转折光路；光学延迟导轨做往复运动，实现泵浦脉冲对两个啁啾Stokes脉冲的快速时域扫描。在本实例中，采用Newport的UTS150PP导轨，最快的扫描速度可以达到10mm/s。色散元件5-4采用肖特玻璃生产的牌号为SF57的玻璃在原始飞秒脉冲11中引入线性啁啾，展宽为啁啾泵浦脉冲13。
对待检测样品进行聚焦激发，信号光子收集的显微成像单元包括由用于实现聚焦激发的显微物镜、实现信号光子收集的显微物镜以及物镜安装的镜架组成的显微镜系统7；以及用于实现相干拉曼显微成像的扫描样品台8。啁啾泵浦脉冲13和双孤子脉冲12经过二向色镜6合光后进入显微系统中的聚焦物镜，实现对样品分子的共振激发；信号光子通过收集物镜加以收集。与此同时，扫描样品台8做快速的二维扫描运动，实现对整个样品面的二维成像。
对信号光子进行探测，算法提取处理以及显微图像显示部分包括用于对信号光子进行探测的光谱仪器9；以及，用于运行算法进行非共振背景扣除和显微图像合成、显示的计算机10。通过收集物镜收集到的CARS信号光子进入光谱仪，进行分光探测后，可以对不同孤子脉冲产生的光谱信号加以区分，进而得到两条CARS光谱，在此基础上，运用特定算法恢复出真实CARS光谱信号；再结合扫描样品台的位置信息，重构出二维的显微图像，并加以显示。
本发明中双孤子相干拉曼激发、非共振背景抑制与信号恢复的步骤如下：
步骤1：
光学延迟导轨5-2按照一定的速度往复运动，完成泵浦脉冲对两个Stokes脉冲的时域扫描；与此同时在考虑导轨运动速度的前提下，光谱仪器9按照一定的积分时间进行信号采集，获得两条分别来自泵浦脉冲13+啁啾Stokes脉冲12-1与泵浦脉冲13+啁啾Stokes脉冲12-2组合的CARS光谱：ICARS_1(ω1)和ICARS_2(ω2)。
步骤2：
在得到两条CARS光谱的基础上按照以下的步骤进行真实相干拉曼信号的算法提取处理：
1)首先得到差分的相干拉曼信号ΔICARS(ω)＝ICARS_1(ω1)-ICARS_2(ω2)，其中，ICARS_1(ω)为啁啾泵浦脉冲13与啁啾Stokes脉冲12-1所产生相干反斯托克斯拉曼信号，ω1代表信号的频率；ICARS_2(ω)为啁啾泵浦脉冲13与啁啾Stokes脉冲12-2所产生相干反斯托克斯拉曼信号，ω2代表信号的频率；
2)对差分的干拉曼信号进行傅里叶变换处理：
其中ICARS(ω)为真实相干反斯托克斯拉曼信号；F表示傅里叶变换，F-1表示反傅里叶变换；
3)最后恢复出真实相干反斯托克斯拉曼信号：
|ICARS(ω)|2＝exp[k×∫Re{ICARS(ω)}dωas]。
k是用于恢复的比例常数；可以根据自发拉曼光谱数据库加以确定。
步骤3：
在恢复出真实相干拉曼光谱的基础上，选择合适的特征峰，作为显微成像的衬度；同时确定光学延迟导轨5-2的最佳扫描范围来采集相应波段的拉曼信号；设定扫描样品台8的平移方向与速度；采集不同位置点的CARS信号；并按照步骤2的处理流程，获得每一个采集点的强度值，进而重构出二维的相干拉曼显微图像。图2和图3中对本发明的相干拉曼显微图像与传统的相干拉曼成像结果做了对比，可以看出本实施例的处理结果具有非常高显微图像对比度，待测目标清晰可见。
综上，本发明中，单一光纤飞秒激光器作为整个系统的泵浦光源具有小巧、低成本的优势；在双孤子脉冲产生部分，通过采用具有双折射特性的高非线性光纤，精确控制入射脉冲功率与偏振方向能够同时实现对原始脉冲波长的拓展和双孤子脉冲的产生，两个孤子脉冲的时域上相互分离，其频谱成分具有微小的差异，通过恰当的啁啾控制元件后，两个孤子脉冲同时作为相干反斯托克斯拉曼成像过程的Stokes脉冲；在光学脉冲扫描单元，通过导轨的高速往复运动实现对泵浦脉冲延迟量的控制，进而在合光后实现泵浦脉冲对两个孤子脉冲在时域上的扫描；从而实现对探测样品的分子能级的两次共振激发，并可通过光谱仪采集到两次具有微小差异的相干反斯托克斯拉曼信号；通过相应差分处理可以从畸变的、强非共振背景的原始信号中提取出真实的拉曼信号，通过对样品台的二维扫描，可以得到不同物质的空间显微图像。因此可实现非共振信号抑制，并显著提高显微图像对比度。
上述各实施例仅用于说明本发明，其中光纤激光器的波长、双折射高非线性光纤的相关参数、信号光子的探测方式、各部件的结构、连接方式等都是可以有所变化的，凡是在本发明技术方案的基础上进行的等同变换和改进，均不应排除在本发明的保护范围之外。
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