针对细胞或组织不同深度超分辨率显微成像的照明系统的制作方法

本发明涉及生物显微技术领域，尤其涉及一种可对细胞或组织切片不同深度进行四色超分辨率荧光定位显微成像的照明系统。

技术背景

超分辨率荧光定位显微技术为2006年由庄小威，埃里克贝齐格(Eric Betzig)先后提出的一种可以突破光学成像分辨率极限的一种方法。埃里克贝齐格通过这项技术在2014年被授予诺贝尔化学奖。超分辨率荧光定位显微技术由其使用的荧光标记分子的种类不同可分为两种，一种是庄小威发明的随机重构光学显微技术，这种技术利用荧光染料分子(Alexa系列和Atto系列等)特异性的标记所观察样品的结构，通过荧光染料分子在特殊的缓冲液中具有的“开”“关”效应来进行超分辨率成像；另一种为埃里克贝齐格发明的使用荧光蛋白分子标记样品结构。

传统荧光显微镜的分辨率由显微镜系统的数值孔径及成像时所使用的荧光波长所限制(其中λ为荧光波长，NA为显微镜系统数值孔径)，所以无法突破200nm的分辨率极限，而荧光定位显微技术的分辨率则由分辨率极限和在一次定位过程中系统所收集到的光子数量所决定，所以收集到的光子数量越多，荧光定位显微镜的分辨率也就越高，具体数值可以达到20nm甚至更小。

为了尽可能的在一次定位过程中收集到更多的光子，人们使用了很多方法，其中比较有效也是普遍采用的方法是使用全内反射的照明方式，如附图1(c)所示，这种照明方式将照明光限制在细胞底层几百纳米的范围内，这样就可以避免细胞焦平面以外的其他荧光分子被照亮，尽可能的减小背景光，从而增加图片清晰度。这种方法在对细胞底层结构成像时可以获得很好的效果，但是在细胞或组织切片深层成像时便无能为力。对样品深层结构进行成像时往往需要使用宽场照明(附图1(a))或半全内反射照明(附图1(b))，这两种照明方法的成像结果往往背景光强度很高，影响定位精确度，有时甚至无法进行定位，所以超分辨率荧光定位显微技术在样品深层成像领域中很难实现。

图1为传统商业荧光定位显微照明系统的光路图，这种照明系统直接将由光纤((d)中1)中发出的光准直，然后聚焦在物镜6的后焦平面上，通过按图中箭头标注的方向移动光纤端点的位置，照明模式可以选择(a)宽场照明，(b)半全内反射照明，或(c)全内反射照明。这种照明系统虽然结构简单，但是具有如下的缺点：(1)第一个问题就是之前提出的这种照明方式无法对样品深层进行超分辨率荧光定位成像的问题。(2)照明光束的位置由平面镜3及二向色镜5决定，而二向色镜5通常置于商用显微镜系统的滤波片模块中，方向无法调节，所以照明光束的位置和方向完全通过平面镜3来调节，很容易使得照明光束位置不准确，装置照明效果变差；(3)对同一样品进行不同颜色的荧光定位显微成像时，需要更换光纤1中发出的激光波长，这要么通过更换光纤来实现，要么可通过将不同波长的激光器耦合到一条光纤中来实现，若使用第一种方法需要在成像过程中手动更换光纤，这不仅操作麻烦，容易破坏显微镜系统的稳定性，而且会使得实验过程变长；使用第二种方法的困难是，超分辨率荧光显微镜使用的激发光波长通常在405nm到750nm的范围内，而市场上很难找到对如此大范围激光波长均使用的光纤产品，即使可以定做这种光纤，光纤耦合器的参数也只能对某种波长的激光器进行优化，这必然使得其他波长的激光耦合效率降低，而超分辨率荧光显微成像技术要求激发光强度较高，这就只能选择功率很高的激光器，这不仅使得光纤耦合系统效率下降，而且使成本大大提升。

技术实现要素：

针对现有技术的缺陷，本发明提出一种针对细胞或组织不同深度超分辨率显微成像的照明系统。

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种针对细胞或组织不同深度超分辨率显微成像的照明系统，它包括激光器，激光器产生的光束依次经过用于准直的初始透镜，再进入初始反射镜，由初始反射镜将光束传递到反射镜组，其特征在于，初始反射镜与反射镜组之间设有柱面镜，光束以Z轴向穿过柱面镜进入反射镜组中，穿过柱面镜后的光束截面的X、Y轴其中一个方向变焦，使光束变为薄片光束，薄片光束经反射镜组进入物镜，所述薄片光束能通过调节形成半全内反射照明模式。

所述照明系统以激光器的初始透镜入射位置不同，来改变薄片光束的照明形式，通过准直的初始透镜和初始反射镜的入射角来调节。

所述的激光器包括三组波长的光纤，其中波长750nm光束耦合进第一光纤中，通过第一透镜进行准直，第一透镜对应的初始反射镜为全反射镜；波长647nm和561nm光束耦合进第二光纤中，通过第二透镜进行准直，第二透镜对应的初始反射镜为二向色镜；波长488nm和405nm光束耦合进第三光纤中，通过第三透镜进行准直，第三透镜对应的初始反射镜为二向色镜，所述的第一光纤、第二光纤、第三光纤由全反射镜和两块二向色镜引入光路中，第一光纤、第二光纤、第三光纤进入光路后共焦，并且光束具有相同光域直径。

所述三组波长的光纤，以光纤与三组初始透镜的入射距离不同来控制光束的相同光域直径。

反射镜组包括第二透镜、两块相对反射的反射镜、第三透镜、第四透镜，以及终端反射镜，所述的光束经过第二透镜变焦后再进入两块相对反射的反射镜，两块相对反射的反射镜能机械旋转调节对射角度，然后光束再进入第三透镜、第四透镜，经第三透镜、第四透镜变焦后光束进入照射场，并形成多种照明模式，最后光束进入物镜中。

本发明解决了在对样品深层进行荧光定位显微成像时使用半全内反射或宽场照明所导致的背景光强过高使得定位过程无法进行的问题，成像深度可达几个微米，且结构简单紧凑，适用于商业超分辨率荧光定位显微系统。

附图说明

图1为荧光定位显微系统的三种照明模式：(a)宽场照明，(b)半全内反射照明，和(c)全内反射照明，及传统商业荧光定位显微照明系统光路图。

图2为对传统商业荧光定位显微照明系统的一种改良。

图3为本发明所使用的四色超分辨率荧光定位显微照明系统光路图，将光线传播方向定义为z方向，在宽场照明时x和y方向上光束的传播。

图4为半全内反射照明时，四色超分辨率荧光定位显微照明系统x和y方向上光束的传播。

图5为四色超分辨率荧光定位显微照明系统全内反射和半全内反射照明效果。

图6为光束进入柱面镜的示意图。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

第一步的改良，先将激光器的光束波长涵盖所有荧光定位显微技术中使用的染料，提高激光使用效率，图2所示我们选择了三组光纤，波长750nm光束耦合进光纤1中，通过第一透镜2进行准直；波长647nm和561nm光束耦合进光纤4中，通过第二透镜5进行准直；波长488nm和405nm光束耦合进光纤7中，通过第三透镜8进行准直。光纤1光束穿过第一透镜2被全反射镜3全反射；光纤4光束穿过第二透镜5至二向色镜6，被二向色镜6反射；光纤7第三透镜8至二向色镜9，被二向色镜9反射，全反射镜3反射的光纤1的光束由二向色镜6引入到光路中，由二向色镜9引入到光路中，光纤1、光纤2、光纤3光束分别与透镜10共焦。以光纤1、光纤2、光纤3与第一透镜2、第二透镜5、第三透镜8的入射距离不同来控制光束的相同光域直径。这就将波长405nm，488nm，561nm，647nm，750nm激发光同时引入到照明系统中供选择，波长范围几乎涵盖了所有荧光定位显微技术中使用的染料，提高光束使用效率，降低成本。并且，我们在光路中加入了一组相对的反射镜11，反射镜12来调节，通过反射镜11，反射镜12可以精确地调节光束的方向及位置，可方便地获得最优化的照明效果。光束穿过透镜10后进入反射镜11，反射镜12，之后又经过一块透镜13和一块透镜14，最后进入终端反射镜15，终端反射镜15的反射光形成全内反射照明模式，光束最终进入物镜16。

进一步的，为解决细胞或组织的照明深度问题，我们先是拷贝了图2的权欲波长的设置模式，然后再加上一块柱面镜来解决问题。图3所示，设置三组光纤1、光,2、光纤3，通过第一透镜2、第二透镜5、第三透镜8准直以上光纤发出的光束。全反射镜3反射的光纤1的光束由二向色镜6引入到光路中，由二向色镜9引入到光路中，光纤1、光纤2、光纤3光束分别与柱面镜10共焦。图6所示，经过柱面镜10的光束设其方向为Z向，那么光束的截面有X向和Y向。其中X向光束的宽度不变，Y向光束的宽度变窄，使光束变为薄片光束。光束经柱面镜10后又经过透镜11、反射镜12、反射镜13、透镜14、透镜15、终端反射镜16最后进入物镜。X向和Y向光路的定义如图3，柱面镜10由可调节的机械转镜控制，可以选择放入或不放入光路中。将系统中光束的传播方向定义为z，则加入柱面镜10后，柱面镜平面方型一面的光束传播不受影响，将此方向定义为X方向，而柱面镜10凸型一面的方向定义为Y方向。在对样品深层进行成像时，可选择半全反射照明模式，如图4所示，将光纤端口沿Y方向进行移动，使得宽场照明模式变为半全内反射照明模式，这样在X方向光束仍为一个平面，而在Y方向则变成了倾斜的光薄片照明。图5为物镜和样品池及照明光束的结构，图5(a)为全内反射照明，图5(b)为普通的半全内反射照明，图5(c)为本发明中的半全内反射照明。当对样品底部结构进行成像时，控制机械转镜将柱面镜10移出照明系统中，使用(a)全内反射进行照明，当对样品深层进行成像时，将柱面镜10置入照明系统中，使用(c)半全内反射进行照明。经过柱面镜10压缩后，半全内反射照明(c)的照明范围可以被压缩为(b)中照明范围的1/10，约为1个微米，这就大大减少了定位过程中背景光的影响，使得超分辨率定位荧光显微镜的成像深度可以达到几个微米。