简易光束聚焦增强方法与系统与流程

本发明属于光遗传学与光学显微成像领域，特别涉及了一种简易光束聚焦增强方法与系统，并应用于光遗传学光刺激与深穿透光学显微成像。

背景技术：

在生物医学光学领域，光学散射是制约光学成像质量的主要因素。多数深部组织成像的光学技术(例如，激光共聚焦成像，双光子显微镜和光学相干层析扫描)主要利用非散射光子(即弹道光子)成像。弹道光子的数量随深度增加呈指数式衰减，因此将光学聚焦范围限制在了1mm的深度。

光遗传学技术需要对特定的神经元进行光刺激，以研究其神经环路机理。但是传统的光纤植入式光遗传学对活体生物的损伤严重，不利于长期研究。早先应用在天文学中的自适应光学技术，为实现深层生物组织光刺激与成像提供了新的技术支持。

现有的非侵入式自适应光遗传学技术是基于自适应光学的精确相位校正，通过将空间光调制器分成若干分区，依次等间隔改变分区内的光束附加相位，探测其最佳光学聚焦相位。每个分区依次循环迭代，从而获得最终校正相位，对入射光束进行相位补偿，从而校正其畸变相位，形成良好光学聚焦。

但是以上精确相位校正需要消耗大量的时间，为了获得更好地光学校正，就需要划分更多的分区与更细的相位间隔。由于空间光调制器的图像刷新率较低，导致光学校正消耗大量时间，不利于活体生物中进行实时光遗传学刺激与研究，制约了自适应光遗传技术的推广。

技术实现要素：

为了解决背景技术中存在的问题，本发明目的在于利用图像刷新率较高的数字微镜器件解决传统自适应光遗传学中空间光调制器耗时较长的问题。从光学干涉原理出发，将光束分为若干区域，并探测各分区内光束对聚焦中心的干涉作用。通过保留对聚焦中心干涉相长的区域，并去除对聚焦中心干涉相消的区域，从而提升了光学聚焦的质量，缩短了自适应光刺激的校正时间。

绝大部分生物组织样品自身不透明且光学性质不均匀，导致经物镜聚焦后入射光无法在样品内形成理想聚焦光斑，而是畸变的散射光斑。本发明先对未加载样品时，通过无加载分区的数字微镜器件进行理想光学聚焦所形成的聚焦光斑中心位置进行标定；然后加载实验样品，在样品内激发出的荧光被光电倍增管接收，记此时聚焦中心光强为阈值；然后将数字微镜器件至于物镜后瞳面，并对其进行分区，每个分区依次将该区入射光束反射到旁侧光路，使其不参与聚焦，同时保持其他分区光束不变；光电倍增管记录去除对应分区光束后的聚焦中心光强；接着去除光强大于等于阈值的分区，获得筛选分区；数字微镜器件加载筛选分区后光束再次聚焦，在样品内形成中心光强更强的光斑。

为了实现上述目的，本发明的具体技术方案包括以下步骤：

一、一种简易光束聚焦增强方法，包括以下步骤：

1)物镜的焦平面处不放置实验样品，即不加载实验样品，用无加载分区的数字微镜器件进行光束聚焦，在物镜的焦平面处得到理想聚焦光斑，记录理想聚焦光斑的聚焦中心位置of；

2)将实验样品置于物镜的焦平面处，即加载实验样品，用无加载分区的数字微镜器件进行光强探测，记录获得聚焦中心位置of的光强值，作为光强阈值ith；

3)将数字微镜器件的反射面分为多块区域，以每一区域依次作为目标区域，遍历各个区域用加载分区的数字微镜器件进行光强探测，获得一系列各个区域对应记录到的聚焦中心位置of处的光强值；

4)将每一光强值与光强阈值ith进行比较，并采用以下方式处理得到筛选结果：

若光强值小于光强阈值ith，则该光强值对应的区域保留；

若光强值大于等于光强阈值ith，则该光强值对应的区域去除；

5)将根据筛选结果调整后的分区加载到数字微镜器件上并进行光强探测，在实验样品内形成最终光学聚焦校正光斑，在聚焦中心位置为of处激发出更强的荧光。

所述步骤1)中的光束聚焦具体是：激光器发射出光束，经过准直扩束后，在数字微镜器件上反射，然后经过物镜聚焦。

所述步骤2)、3)、5)中的光强探测具体是：激光器发射出光束，经过准直扩束后，在数字微镜器件上反射，然后经过物镜聚焦到样品上，样品带有荧光材料，在样品内产生畸变散射光斑并激发出荧光，激发出的荧光再经透镜聚焦后由光电倍增管和振镜配合进行扫描探测获得散射光斑激发出的荧光图像，记录聚焦中心位置of的光强值。

所述由光电倍增管和振镜配合进行扫描探测具体是以光电倍增管的探测区域为单位通过振镜逐行逐列扫描获得完整的荧光图像。

所述步骤3)用加载分区的数字微镜器件进行光强探测具体是指光强探测时，数字微镜器件上的目标区域将自身接收的入射光束调整反射角度，使反射光束到旁侧光路而不参与物镜聚焦，同时除目标区域以外的其他区域保持反射光束的反射角度与所述步骤2)光强探测时反射光束的反射角度相同。

所述步骤5)将根据筛选结果调整后的分区加载到数字微镜器件上并进行光强探测具体指的是：经过数字微镜器件时，筛选后去除的区域将自身接收的入射光束调整反射角度，使反射光束到旁侧光路而不参与物镜聚焦，同时筛选后保留的区域保持反射光束的反射角度与所述步骤2)光强探测时反射光束的反射角度相同。

所述步骤3)中的聚焦中心位置of为无实验样品散射时，光束在焦平面形成的理想聚焦斑的光强最强点，即光斑的中心，代表光学聚焦的目标靶点，其位置坐标不随散射光斑的偏移而改变。

所述的荧光材料包括荧光蛋白、荧光小球或者荧光染料。

所述实验样品为但不限于活体生物组织、离体生物组织、含小球的琼脂块等。

所述光强阈值ith为散射光斑中of所处位置的光强值，即散射后在原聚焦中心of处的光强值。

所述步骤对数字微镜器件的反射面分为多块区域具体是指将数字微镜器件的微镜像素元以n×n方式均匀分区，从而将准直扩束后的入射光束分为对应的n×n个光束单元。

光强探测时，一个分区内的微镜同时向同一方向偏转，将该区光束反射至旁侧光路，使其无法进入物镜参与聚焦，与此同时，其他分区内的微镜保持不变，使得其光束形成光学聚焦，即仅去除一个分区内的光束，而保持其余n×n-1个分区的光束不变，由光电倍增管记录在of处的荧光光强值；由此所有分区重复步骤可以记录所有分区对应的光强值。

二、一种简易光束聚焦增强系统：

系统包括激光器、光束准直扩束模块、数字微镜器件、光挡、缩束模块、扫描模块、二向色镜、显微物镜、实验样品和光强探测模块；光束准直扩束模块布置在激光器出射端，激光器发射出光束经准直扩束模块平行扩束并空间滤波后入射到数字微镜器件，数字微镜器件旁侧出射端前方置有光挡，数字微镜器件正侧出射端置有缩束模块，前方设有二向色镜，光束经二向色镜反射后经过扫描模块进入显微物镜聚焦，实验样品位于显微物镜焦平面上，实验样品内激发出的光经过显微物镜与扫描模块后透过二向色镜被光强探测模块接收进行光强探测。

所述的光束准直扩束模块包括前光束准直扩束模块透镜、光束空间滤波器和后光束准直扩束模块透镜；前光束准直扩束模块透镜、光束空间滤波器和后光束准直扩束模块透镜依次平行布置在激光器出射端的前方，入射光束依次经前光束准直扩束模块透镜、光束空间滤波器和后光束准直扩束模块透镜平行扩束后入射到数字微镜器件；

所述的缩束模块包括前缩束模块透镜和后缩束模块透镜；前缩束模块透镜和后缩束模块透镜依次平行布置在数字微镜器件的前侧，数字微镜器件反射的光束依次经前缩束模块透镜和后缩束模块透镜平行缩束后入射到二向色镜的斜侧；

所述的扫描模块包括前扫描振镜、前光束准直透镜、后光束准直透镜、后扫描振镜、前扫描模块透镜和后扫描模块透镜；前扫描振镜、前光束准直透镜、后光束准直透镜、后扫描振镜、前扫描模块透镜和后扫描模块透镜依次布置在二向色镜的前侧，二向色镜反射的光束依次经前扫描振镜、前光束准直透镜、后光束准直透镜、后扫描振镜、前扫描模块透镜和后扫描模块透镜后入射到显微物镜；

所述的光强探测模块包括光学滤波器、聚焦透镜、空间滤波器和光电倍增管；光学滤波器、聚焦透镜、空间滤波器和光电倍增管依次布置在二向色镜的后侧，实验样品发出的荧光依次经显微物镜、后扫描模块透镜、前扫描模块透镜、后扫描振镜、后光束准直透镜、前光束准直透镜、前扫描振镜、二向色镜、光学滤波器、聚焦透镜和空间滤波器后进入光电倍增管进行光强探测。

本发明的有益效果是：

本发明利用数字微镜器件实现了简易的自适应光学聚焦校正，利用数字微镜器件快速的图像刷新速率，克服了以往利用空间光调制器进行串行相位校正时速度慢的问题，提升了光学聚焦与光学刺激的速度。

本发明基于光学干涉成像原理，通过数字微镜器件筛选出对聚焦光斑有干涉相消作用的分区光束，从而使得聚焦中心的光强显著提升，提高了自适应光学聚焦质量。

本发明使用数字微镜器件进行自适应光学校正，降低了实验成本，更利于方法与系统在研究实验中的应用。

并且本发明可方便地与已有的各种显微成像技术相结合，实现同步的光刺激与显微成像，有利于基于光遗传学对行为学与神经环路等面向大脑不同区域的研究发展。

附图说明

图1为本发明系统的结构示意图；

图2为实施例中无数字微镜器件校正时的散射聚焦光斑图像；

图3为实施例中数字微镜器件分区依次去除后所得光强值与阈值的比较图；

图4为实施例中数字微镜器件筛选后需要去除的分区分布图；

图5为实施例中数字微镜器件加载筛选分区进行校正后的聚焦光斑图像。

具体实施方式

以下自适应光学聚焦校正实施例可以更详细的说明本发明，但不以任何形式限制本发明。

本发明的实施例及其具体过程如下：

如图1所示，本发明系统包括激光器1、前光束准直扩束模块透镜2、光束空间滤波器3和后光束准直扩束模块透镜4、数字微镜器件5、光挡6、前缩束模块透镜7和后缩束模块透镜8、二向色镜9、前扫描振镜10、前光束准直透镜11、后光束准直透镜12、后扫描振镜13、前扫描模块透镜14和后扫描模块透镜15、显微物镜16、实验样品17、光学滤波器18、聚焦透镜19、空间滤波器20和光电倍增管21。

(1)激光器1发出的光束依次经过前光束准直扩束模块透镜2、光束空间滤波器3和后光束准直扩束模块透镜4进行扩束后，照射到数字微镜器件5上。在数字微镜器件5无加载图像且不加载实验样品17时，光束被反射经过前缩束模块透镜7和后缩束模块透镜8，照射到二向色镜9的侧面被反射，反射光束经过前扫描振镜10、前光束准直透镜11、后光束准直透镜12、后扫描振镜13、前扫描模块透镜14和后扫描模块透镜15后进入显微物镜16，并在焦平面处形成理想的聚焦光斑，记聚焦光斑中心在焦平面的位置为of。

(2)加载实验样品17，数字微镜器件5无加载图像时，激光器1发出的光束依次经过前光束准直扩束模块透镜2、光束空间滤波器3和后光束准直扩束模块透镜4进行扩束后，照射到数字微镜器件5上，光束被反射经过前缩束模块透镜7和后缩束模块透镜8，照射到二向色镜9的侧面被反射，反射光束经过前扫描振镜10、前光束准直透镜11、后光束准直透镜12、后扫描振镜13、前扫描模块透镜14和后扫描模块透镜15后进入显微物镜16，并在实验样品17内焦平面处形成畸变的散射聚焦光斑，并激发出荧光。

(3)荧光从实验样品17内发射进入显微物镜16，然后依次经过后扫描模块透镜15、前扫描模块透镜14、后扫描振镜13、后光束准直透镜12、前光束准直透镜11、前扫描振镜10、二向色镜9、光学滤波器18、聚焦透镜19和空间滤波器20后进入光电倍增管21进行光强探测，通过扫描得到无数字微镜器件校正时的散射聚焦光斑图像，如图2所示。记此时of对应位置的光强值ith为光强阈值。在本具体实施案例中由于光强最强点偏移，of对应位置的光强值ith为20.52。

(4)在本具体实施案例中将数字微镜器件的微镜像素元以32×32方式均匀分为1024个区域，从而将准直扩束后的入射光束分为对应的1024个光束单元，针对每个区域进行光强探测。一个分区内的微镜同时向同一方向偏转，将该区光束反射至旁侧光路的光挡6，使其无法进入物镜参与聚焦，与此同时，其他分区内的微镜保持不变，使得其光束形成光学聚焦，即仅去除一个分区内的光束，而保持其余1023个分区的光束不变，由光电倍增管记录在of处的荧光光强值。所有分区依次重复上述步骤直到记录所有分区对应的光强值。

(5)将步骤(4)所得1024个光强值与步骤(3)所得光强阈值ith相比较，得到如图4所示光强比较图。保留光强值小于阈值的分区并去除光强值大于等于阈值的分区，得到筛选分区图像。在本具体实施案例中数字微镜器件分区依次补偿后所得光强值与阈值的比较图如图3所示；所需去除的分区分布图如图4所示。

(6)将筛选分区图像加载到到数字微镜器件5上，入射光束经前光束准直扩束模块透镜2、光束空间滤波器3和后光束准直扩束模块透镜4进行扩束后，照射到数字微镜器件5上，被去除的分区对应的光束被反射至旁侧光路的光挡6上，从而不参与聚焦，被保留的分区对应的光束被反射经过前缩束模块透镜7和后缩束模块透镜8，照射到二向色镜9的侧面被反射，反射光束经过前扫描振镜10、前光束准直透镜11、后光束准直透镜12、后扫描振镜13、前扫描模块透镜14和后扫描模块透镜15后进入显微物镜16，并在实验样品17内焦平面处形成最终的光学聚焦校正光斑，并在聚焦中心位置处能激发出更强的荧光。

(7)经过光学聚焦校正后激发的荧光从实验样品17内发射进入显微物镜16，然后依次经过后扫描模块透镜15、前扫描模块透镜14、后扫描振镜13、后光束准直透镜12、前光束准直透镜11、前扫描振镜10、二向色镜9、光学滤波器18、聚焦透镜19和空间滤波器20后进入光电倍增管21进行光强探测，通过扫描得到数字微镜器件5加载筛选分区进行校正后的聚焦光斑图像，如图5所示，在本具体实施案例中该图像of位置对应的光强值为101.4，相比未调整增强前的光强值20.52提升了近4倍(394.2％)。

相比传统的空间光调制器，本发明的处理速度是提升了近3700倍。

传统的最优化自适应光学聚焦技术采用空间光调制器进行相位的逐次校正。假设将空间光调制器分成32×32个分区，每个分区从0到2π以π/5的间隔依次改变对应光束的相位，从而获得具有最好校正效果的相位值。假设空间光调制器工作时的图像加载速率上限为60hz，则完成一次光学聚焦相位探测所需要的时间为：

而本发明所使用的数字微镜器件的图像刷新率上限为22727hz，同样将其分为32×32个分区，其完成一次光束聚焦增强分区的筛选时间为：

由于最优化自适应光学聚焦技术需要多次迭代运算，完成光束聚焦校正的时间较长。而本发明利用数字微镜器件快速的图像刷新率，极大地减少了光束聚焦增强所需要的处理时间，显著提升了光束聚焦增强的处理速度。

由上述实施例可见，本发明自适应光学聚焦校正方法与系统简单、便捷，能够在简单、快速的串行光束筛选之后，将目标聚焦点的光强提升约394.2％。相比于利用空间光调制器进行逐次相位校正，本发明能够在提升聚焦光斑中心光强的同时缩短校正时间，为光遗传学光刺激与实时成像提供了更低成本更便捷的实验技术，提升了实验效率。