使用图案化疏水性表面进行的自组装图案化的制作方法

一般而言，本公开涉及光刻术图案化工艺领域，以产生用于多核苷酸测序应用的微图案化或纳米图案化的表面。更具体地，本申请涉及制备用于流动池或数字射流装置的图案化表面的自组装方法。

发明概述

流动池是允许流体流过基板内的通道或孔的装置。在核酸分析方法中有用的图案化流动池包括在惰性间隙区内具有活性表面的离散孔。流动池的表面通常使用以下步骤制造：(1)孔最初被蚀刻成均匀的基板；(2)孔和间隙区用硅烷和凝胶材料官能化；(3)经由抛光工艺去除覆盖间隙区的过量凝胶材料；以及(4)然后用单链引物dna对孔中的凝胶材料进行接枝，用以为下游测定应用提供流动池表面。在这种情况下，一些凝胶材料在制造工作流的抛光步骤中被浪费。此外，间隙区的表面能很大程度上取决于起始基板。

实施方案涉及制备用于测序应用的图案化表面的自组装方法。图案化表面可包括，例如用于数字射流装置的图案化流动池或图案化表面。在一些实施方案中，该方法利用光刻术来创建具有由疏水性间隙区分隔的多个微米尺度或纳米尺度轮廓的图案化表面，同时在光刻胶沉积之前，消除对氧等离子体表面或其它处理的需要。此外，一些实施方案避免在凝胶材料沉积在轮廓上方之后使用化学或机械抛光步骤。

本文所述的一些实施方案涉及通过以下步骤制备具有凝胶涂覆的轮廓的图案化表面的方法：提供包括表面的固体支撑物，所述表面包括连续的疏水性涂覆层；在固体支撑物的疏水性涂覆层上配置光刻胶以覆盖疏水性涂覆层；和通过光刻术(或本领域已知的和/或本文所述的其它适合的方法)图案化光刻胶层以在表面形成微米尺度或纳米尺度轮廓；和在微米尺度或纳米尺度轮廓内沉积凝胶材料层，其中凝胶材料能够共价键合至寡核苷酸。在一些实施方案中，微米尺度或纳米尺度轮廓通过蚀刻掉疏水性涂覆层的部分而形成。在一些实施方案中，微米尺度或纳米尺度轮廓通过包括疏水性涂覆层的疏水性间隙区彼此分隔开。在一些实施方案中，至少一部分的微米尺度或纳米尺度轮廓不含疏水性涂层。在一些实施方案中，该方法不需要在配置光刻胶之前对表面进行等离子体表面改性处理(如，清除浮渣或氧等离子体处理、电晕处理、加热、化学或液体活化或用于增加表面能和改善粘合特性的其它处理)。在某些实施方案中，轮廓是孔。

本文所述的一些实施方案涉及制备用于分析应用的图案化表面的方法，该方法包括：提供包括表面的固体支撑物，所述表面包括连续的疏水性涂覆层；在固体支撑物的疏水性涂覆层上配置光刻胶以覆盖疏水性涂覆层；由光刻术(或其它适合的方法)图案化光刻胶层以在由疏水性间隙区分隔的表面上形成微米尺度或纳米尺度轮廓；去除光刻胶；并涂敷粘合材料层诸如硅烷层至表面，以覆盖至少一部分的轮廓和一部分的疏水性间隙区。在一些实施方案中，该方法还包括共价附接凝胶材料至粘合材料层诸如硅烷层。在一些实施方案中，该方法还包括共价附接寡核苷酸至凝胶材料。在一些实施方案中，该方法还包括非共价附接凝胶材料至粘合材料层诸如硅烷层。在一些实施方案中，该方法包括涂敷凝胶材料层至结合材料层或硅烷层。

本文所述的一些实施方案涉及制备用于分析应用的图案化表面的方法，该方法包括：提供包括表面的固体支撑物，该表面包括连续的疏水性涂覆层；在固体支撑物的疏水性涂覆层上配置光刻胶以覆盖疏水性涂覆层；由光刻术(或其它适合的方法)图案化光刻胶层以在由疏水性间隙区分隔的表面上形成微米尺度或纳米尺度轮廓；涂敷硅烷层至表面以覆盖至少一部分的轮廓和一部分的疏水性间隙区；以及共价附接凝胶材料至结合材料层或硅烷层。在一些实施方案中，该方法还包括去除光刻胶以暴露疏水性间隙区中的疏水性层。

在一些实施方案中，粘合材料将凝胶材料共价或非共价地粘附到疏水性涂覆层和/或固体支撑物。在一些实施方案中，凝胶材料共价结合至粘合材料，如硅烷。

本文所述的一些实施方案涉及制备多核苷酸阵列的方法，该方法包括提供包括图案化表面的固体支撑物，该表面包括涂敷有能够共价键合至寡核苷酸的凝胶材料的微米尺度和/或纳米尺度轮廓，所述表面通过本文所述的任何方法制备；和共价附接多个第一寡核苷酸和多个第二寡核苷酸至凝胶材料。

附图说明

图1是显示三种类型的全氟化合物(cytop-a、cytop-m和cytop-s)的示意图，其可用于在基板的图案化表面上创建疏水性间隙区。

图2a是包括多个孔和疏水性间隙区的玻璃基板的图案化表面的横截面局部视图。

图2b是图2a的放大视图，示出了在载玻片顶部上的三层材料。

图2c是来自typhoon仪器的三个接枝玻璃表面的荧光图像。

图3示出了化学处理之前和之后，与对照表面相比，cytop-m和cytop-s处理的玻璃表面的接触角。

图4示出了用于创建图案化表面的典型的工作流程的横截面视图。

图5示出了用于创建图案化表面的改进的工作流程的一个实施方案。

图6a和6b是具有14μm微孔的图案化装置表面的荧光图像。

图6c是在700nm直径微孔中的图案化dna簇的荧光图像。

图7示出了用于创建图案化表面的改进的直接图案化工作流程的一个实施方案。

图8a示出了用于使用剥离方法创建图案化表面的改进的图案化工作流程的一个实施方案。

图8b示出了使用图8a中例示的剥离工作流程在14μm直径微孔结构中的图案化pazam和dna簇的荧光图像。

图9a示出了液相回流工艺的实例。

图9b示出了汽相回流工艺的实例。

图10a是在o2等离子体处理之后pazam涂覆的cytop-s纳米孔(直径为700nm至1.1μm)的光学显微术图像。

图10b是液相溶剂回流后图10a中pazam涂覆的cytop-s纳米孔的光学显微术图像。

图10c是在用荧光模具润湿/去润湿水滴之后，图10b的pazam涂覆的cytop-s纳米孔的荧光图像。

图11a描绘了亚微米尺寸的孔中的dna簇图案化。亮点为荧光染料标记的dna簇。在“t”-形区域中，材料是没有图案化的sio2，并且簇是随机分布的。使用图11b中描绘的拓扑结构生成图像。

图11b描绘了图案化基板的横截面图示。所述孔的直径为0.7微米，以1.75微米的间距排列。

图11c显示了呈流式细胞形式的图案化基板组件，以促进生物试剂的交换。使用图11b中描绘的拓扑结构生成图片。

图12a和图12b显示了dna簇尺寸和强度可以用不同的孔尺寸调节。图12a显示了在0.7微米直径的孔中和以1.75微米的间距生长的-染色的簇，其中表面层如图11b所示。图12b显示了在0.9微米直径的孔中和以1.75微米间距生长的-染色的簇。

图13a-图13c显示来自cytop图案化表面(孔直径0.7微米；间距1.75微米)的测序结果。图13a是第一碱基图像，其显示使用无抛光图案化方法所获得的叠加的c和t通道和指示cytop纳米孔内的簇的图案化的圆形基准。图13b显示了该运行的读取1和读取2的错配率(错误率)，各自150个循环。实现的错误率类似于从miseq运行所预期的错误率(在150个循环结束时约为2％)。该图还表明，双末端转向与无抛光图案化方法相兼容。图13c显示了作为运行循环的函数的读取的q评分(质量评分)，同时提供了碱基输出的质量的度量。cytop图案化显示与测序化学相容并且稳健，减慢了数千个流量交换以完成2x150bps测序。实施例3中描述了这些实验的细节。

发明详述

实施方案涉及制备图案化表面的方法，所述图案化表面可用于分析和合成目标分析物，诸如生物组分，包括但不限于细胞、亚细胞组分和分子。示例性生物分子包括但不限于核酸、寡核苷酸、核苷酸、氨基酸、肽、蛋白、多糖、糖、代谢物、酶辅因子等。可以使用图案化表面的尤其有用的分析工艺包括例如核酸测序应用。在一个实施方案中，图案化表面是流动池或电润湿射流装置的一部分。在一些实施方案中，使用纳米制造技术，诸如光刻蚀、光雕刻或光刻术，或其它图案化方法诸如电子束微影术、纳米压印微影术、纳米冲压或直接烧蚀，以创建具有由疏水性间隙区分隔开的多个微米尺度或纳米尺度轮廓的图案化表面。当本文提到光刻术作为图案化技术时，这些其它方法也可以用于对表面进行图案化。可以在光刻术之前制造图案化表面而不需要基板表面的氧等离子体处理。可以在表面上沉积凝胶材料，并且可以利用表面上轮廓和间隙区的差异疏水性/亲水性特征以方便地从表面的一些区域去除凝胶材料，同时保留凝胶材料在所需的特征处。例如，凝胶材料可以保留在硅烷化的孔中，并从孔周围的疏水性间隙区移除。通过避免使用苛刻的化学或机械抛光步骤以在凝胶材料沉积在表面上方之后从间隙区移除凝胶材料，此类实施方案是特别有利的。在一些实施方案中，疏水性间隙区包含全氟化聚合物诸如cytop-s。

本文使用的章节标题仅用于组织目的，并不应解释为限制所描述的主题。

表面制备

本文所述的一些实施方案涉及制备被配置成在预定位置结合分析物诸如核酸分子的图案化表面的方法，并且涉及图案化表面。例如，图案化表面可具有区域或轮廓，所述区域或轮廓具有差异疏水性和亲水性特征。这可以允许表面化学物质差异性地应用于表面上。例如，轮廓、孔或在表面上形成的其它特征可以被处理以含有反应性硅烷和/或凝胶材料，其不存在于将轮廓、孔或其它特征彼此分隔开的间隙区中。在一个实施方案中，轮廓或孔涂覆有能够结合至或已结合至分析物诸如核酸分子的凝胶或类似的聚合物材料。在这个实施方案中，可以通过以包括具有连续的疏水性涂覆层的表面的固体支撑物起始来创建图案化表面。然后可以将光刻胶层沉积在固体支撑物的疏水性涂覆层上，以覆盖疏水性涂覆层。然后，光刻胶层可以通过光刻术使用包括多个微米尺度和/或纳米尺度图案的光掩模进行图案化，使得微米尺度或纳米尺度图案被转移到表面以在疏水性涂覆层上形成微米尺度或纳米尺度轮廓。然后可以在微米尺度或纳米尺度轮廓内沉积凝胶材料层，其中凝胶材料能够共价键合至寡核苷酸。

在光刻术期间，通过使用图案化的光掩模将光刻胶暴露于光(例如，uv光)的图案中。暴露于光引起了化学变化，该化学变化允许暴露的光刻胶部分被显影剂溶液去除以暴露下面的疏水性涂覆层的斑块。光刻胶显影(例如，通过遵循该工艺中使用的特定光刻胶产物的标准配方)后，微米尺度或纳米尺度轮廓由蚀刻掉表面暴露的疏水性涂覆层的部分形成。在一些实施方案中，微米尺度或纳米尺度轮廓通过包括疏水性涂覆层的疏水性间隙区彼此分隔开。在一些实施方案中，至少一部分的微米尺度或纳米尺度轮廓不含疏水性涂层。在一些实施方案中，轮廓包括凹陷，诸如通道或孔(例如，微孔或纳米孔)。在另一个实施方案中，轮廓包括突起，诸如脊、柱或锥体(例如，纳米柱或纳米锥)。

在本文所述的方法的一些实施方案中，疏水性涂覆层包含氟化聚合物、全氟化聚合物或硅聚合物或其混合物。聚合物主链可以是碳或硅或其组合。在一些实施方案中，氟化聚合物为，例如无定形氟聚合物(任选地，2,3-连接的全氟化thf单体，任选地，具有悬突官能团诸如羧基、甲硅烷基化酰胺或三氟甲基末端，如cytop-m、cytop-s、cytop-a，参见图1)、聚四氟乙烯(诸如teflon)、派瑞林(如，a、f、ht级)、氟化烃、氟丙烯酸共聚物(诸如cytonixfluoropel)、氟硅烷或等离子体沉积的氟碳。在一些实施方案中，硅聚合物是聚二甲基硅氧烷或硅氧烷。在一些实施方案中，疏水性涂覆层包含全氟化聚合物。在一些特定的实施方案中，全氟化聚合物选自cytop-m、cytop-s或cytop-a。在一个实施方案中，全氟化聚合物包括或是cytop-s。在另一个实施方案中，全氟化聚合物包括cytop-m。在另一个实施方案中，全氟化聚合物是cytop-s和cytop-a的混合物。在一些实施方案中，疏水性涂覆层与表面直接接触。直接接触可以经由共价键合或非共价键合实现。在一些其它的实施方案中，疏水性涂覆层经由第一粘附促进层与表面接触。在一个实例中，第一粘附促进层包含官能化的硅烷或粘附促进剂；示例性的第一粘附层包含cytop-a、(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(aptms)或(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(aptes)或其组合。

为了光刻术而将光刻胶设置在疏水性涂覆层上，往往需要在疏水性涂覆层和待沉积在其上方的光刻胶层之间的表面能有一定程度的匹配。在一些实施方案中，使用氧等离子体处理制备疏水性涂覆层以用于光刻胶应用。在一些情况下，氧等离子体处理(诸如清除浮渣处理)可能破坏疏水性涂覆层的化学结构。本发明的方法通过提供两种替代方法，在配置光刻胶之前去除或减少对表面预处理的需要。

在一个替代方案中，可以使用光刻胶，使其在没有氧等离子体预处理的情况下与疏水性涂覆层直接接触。在一些实施方案中，光刻胶是正性光刻胶。在其它实施方案中，光刻胶是负性光刻胶。在一些实施方案中，光刻胶选自shipleys1800^tm系列光刻胶，例如shipleys1818(microposit^tms1818^tm)和shipleys1805(microposit^tms1805^tm)。

在另一个替代方案中，粘附促进层可用于减少疏水性涂覆层和光刻胶层之间的表面能错配。在一些实施方案中，粘附促进层包含氟化表面活性剂。在一些此类实施方案中，氟化表面活性剂选自surflons-651、novecfc-4430、novecfc-4432、novecfc-4434、novecfc-5210、zonylfsn-100、zonylfs-300、zonylfs-500、capstonefs-10、capstonefs-30、capstonefs-60、capstonefs-61、capstonefs-63、capstonefs-64或capstonefs-65或它们的组合。在一个实施方案中，氟化表面活性剂包括surflons-651。

直接凝胶图案化

本文所述的一些实施方案涉及通过直接凝胶图案化方法制备用于分析应用的图案化表面的方法。在直接凝胶图案化方法中，具有表面的固体支撑物提供有连续的疏水性涂覆层。光刻胶设置在疏水性涂覆层上。然后通过光刻术使用包括多个微米尺度或纳米尺度图案的光掩模对光刻胶层进行图案化，使得将微米尺度或纳米尺度图案转移至表面以在表面上形成由疏水性间隙区分隔开的微米尺度或纳米尺度轮廓。在一些实施方案中，微米尺度或纳米尺度轮廓通过蚀刻掉疏水性涂覆层的部分形成，并且微米尺度或纳米尺度轮廓通过包括疏水性涂覆层的疏水性间隙区而彼此分隔开。然后去除光刻胶，并将硅烷层涂覆至表面，以覆盖至少一部分的轮廓和一部分的疏水性间隙区。然后将凝胶添加至表面。在将凝胶附接至表面之前、之后或期间，核酸可以附接至凝胶。这些方法也称为直接图案化方法。

在本文所述的直接图案化方法中，未暴露于光的剩余光刻胶不需要经历任何化学变化并且可以在显影工艺之后保留在疏水性间隙区上。可以通过各种试剂去除剩余的光刻胶，这取决于所用光刻胶的类型。例如，光刻胶剥离抗蚀剂(lor)可以通过microchemremoverpg去除。在一些实施方案中，通过丙酮(例如，通过在丙酮溶液中超声处理)去除剩余的光刻胶。第二粘附促进层可以同时用光刻胶去除。可替代地，在光刻胶之后使用不同的去除试剂去除第二粘附促进层。在去除覆盖疏水性间隙区的剩余光刻胶后，暴露的疏水性涂覆层可以经历随后的硅烷沉积。

在一些实施方案中，凝胶材料共价附接至硅烷层。在一些实施方案中，该方法还包括固化凝胶材料。固化工艺可以在各种条件下进行，这取决于所用凝胶材料的类型，如本领域普通技术人员所理解的。在一些实施方案中，通过将沉积在硅烷层上的凝胶材料在烘箱中孵育来完成固化。在一些另外的实施方案中，该方法还包括去除过量的凝胶材料，使得疏水性间隙区基本上不含凝胶材料。在一些实施方案中，可以通过在水中冲洗来简单地去除凝胶材料。

在一些实施方案中，在沉积凝胶材料之后，本文所述的方法也消除了对化学或机械抛光的需要。

在一些实施方案中，该方法还包括共价附接核酸(如寡核苷酸)至凝胶材料。

剥离凝胶图案化

本文描述的一些另外的实施方案涉及通过剥离凝胶图案化方法制备图案化表面的方法。该方法可包括使用具有连续的疏水性涂覆层的固体支撑物并在疏水性涂覆层上配置光刻胶层。然后可以通过光刻术使用包括多个微米尺度或纳米尺度图案的光掩模来对光刻胶进行图案化，使得将微米尺度或纳米尺度图案转移至表面以在由疏水性间隙区分隔开的表面上形成微米尺度或纳米尺度轮廓。在一些实施方案中，微米尺度或纳米尺度轮廓通过蚀刻掉疏水性涂覆层的部分形成。然后可将硅烷层涂覆至表面以覆盖至少一部分的轮廓和一部分的疏水性间隙区，并且凝胶材料可以共价附接至硅烷层。这些方法也称为剥离方法。

在所述的剥离方法中，并非如直接图案化工艺中所述在图案转移之后立即去除光刻胶，该方法可以直接将硅烷层涂覆至表面以在光刻胶的存在下覆盖至少一部分的轮廓和一部分的疏水性间隙区。然后，凝胶材料可以共价附接至硅烷层。在一些实施方案中，该方法还包括固化凝胶材料。如本领域普通技术人员所理解的，固化工艺可以在各种条件下进行，这取决于所用凝胶材料的类型。在一些实施方案中，通过在烘箱中将沉积在硅烷层上的凝胶材料孵育来完成固化。

在凝胶材料固定在硅烷层上之后，然后可以移除或“剥离”间隙区域中剩余的光刻胶，从而暴露下面的疏水性涂覆层。可以通过各种试剂去除剩余的光刻胶，这取决于所用光刻胶的类型。例如，光刻胶lor可以通过microchemremoverpg去除。在一些实施方案中，通过丙酮，例如在丙酮溶液中超声处理去除剩余的光刻胶。第二粘附促进层可以同时用光刻胶去除。或者，在光刻胶之后使用不同的去除试剂去除第二粘附促进层。在一个实施方案中，光刻胶和第二粘附促进层均由丙酮去除。

在一些实施方案中，该方法还包括去除未固定至硅烷层的过量凝胶材料。

在一些实施方案中，该方法还包括共价附接核酸(如寡核苷酸)至凝胶材料。

在本文所述的方法或组合物中(例如，表面制备、直接图案化和剥离方法)，本文使用的硅烷可包含与凝胶材料形成共价键合的官能团。硅烷中的官能团的非限制性实例包括乙烯基、丙烯酰基、烯基、环烯基、杂环烯基、炔基、环炔基、杂环炔基、氮宾、醛、肼基、缩水甘油醚、环氧基、卡宾、异氰酸酯或马来酰亚胺或任选取代的变体或它们的组合。例如，本文使用的硅烷可包含氨基基团(诸如aptes或aptms)。在一些优选的实施方案中，本文使用的硅烷包括降冰片烯衍生的硅烷。在一个实施方案中，硅烷包括[(5-双环[2.2.1]庚-2-烯基)乙基]三甲氧基硅烷。硅烷可以经由化学汽相沉积来沉积在固体支撑物的表面上。

在本文所述的方法或组合物中(例如，表面制备、直接图案化和剥离方法)，可使用的凝胶材料包括但不限于水凝胶或聚合物。有用的水凝胶包括但不限于无硅烷丙烯酰胺(sfa)聚合物、聚(n-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(pazam)、由丙烯酰胺和丙烯酸形成的聚丙烯酰胺聚合物、或含有乙烯基基团的丙烯酸，例如在wo00/31148(其通过引用并入本文)中描述；由形成[2+2]光环加成反应的单体形成的聚丙烯酰胺聚合物，例如，wo01/01143或wo03/014392(其中每个通过引用并入本文)中所述；或美国专利no.6,465,178、wo01/62982或wo00/53812中描述的聚丙烯酰胺共聚物(其中每个通过引用并入本文)。这些凝胶材料的化学处理变体也是有用的，诸如具有反应性位点的水凝胶，所述水凝胶能够与具有相应反应性基团的寡核苷酸反应(例如，pazam能够与5'-或3'-炔基改性的寡核苷酸反应)。其它有用的凝胶是通过从液体到凝胶状态的温度依赖性变化形成的那些凝胶。实例包括但不限于琼脂、琼脂糖或明胶。在一些实施方案中，凝胶材料共价附接至硅烷层。

在一些实施方案中，使用的凝胶材料将包含反应性位点。如本文所用的术语“反应性位点”意指本文所述的凝胶上的可用于通过化学反应或分子相互作用的方式将一种或多种分子附接至凝胶材料上和/或将凝胶材料附接至表面的位点。反应性位点的非限制性实例包括叠氮基、任选取代的氨基、boc-保护的氨基、羟基、硫醇、炔基、烯基、卤代基、环氧基、四嗪基或醛。在一些实施方案中，凝胶材料包括具有叠氮基官能团作为反应性位点的聚合物。在特定的实施方案中，凝胶材料包括pazam。pazam能够与降冰片烯衍生的硅烷反应，以经由无催化剂应变促进的环加成反应形成共价键合。在一些实施方案中，凝胶材料的反应性位点也能够与官能化的寡核苷酸形成共价键合，以进行引物接枝(primergrafting)。在一些可替代的实施方案中，凝胶材料在与硅烷层反应之前用引物预接枝。

在一些其它的实施方案中，凝胶形成(如，可聚合的)材料可以以液态提供于表面上，并随后转化成凝胶。可聚合的材料的实例包括但不限于丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸羟乙酯、n-乙烯基吡咯烷酮或其衍生物。此类材料可用于制备水凝胶。在一些实施方案中，可聚合材料可包括两种或更多种形成共聚物的不同种类的化合物。例如，两种或更多种不同种类的丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸羟乙酯、n-乙烯基吡咯烷酮或其衍生物可以起到共聚单体的作用，所述共聚单体聚合形成共聚物水凝胶。

图案化表面和固体支撑物

本文描述了包括固体支撑物的具有凝胶涂覆的轮廓的图案化表面，其包括：

表面，所述表面包括连续的疏水性涂覆层；

固体支撑物的疏水性涂覆层上的光刻胶层，其中所述光刻胶层包括微米尺度或纳米尺度轮廓；和

在微米尺度或纳米尺度轮廓内的凝胶材料层，其中所述凝胶材料能够共价键合至寡核苷酸。

在一些实施方案中，轮廓由疏水性间隙区分隔开，并且还包括覆盖至少一部分的轮廓和一部分的疏水性间隙区的粘合材料层(诸如硅烷层)。在一些实施方案中，至少一部分的微米尺度或纳米尺度轮廓不含疏水性涂层。在一些实施方案中，轮廓包括孔。在一些实施方案中，表面包括疏水性涂覆层、在固体支撑物的疏水性涂覆层上的光刻胶层，其中光刻胶层包括微米尺度或纳米尺度轮廓；粘合材料层或硅烷层，其覆盖至少一部分的轮廓和至少一部分的疏水性间隙区。

在一些实施方案中，疏水性涂覆层包含氟化聚合物、全氟化聚合物或硅聚合物或其混合物。在一些实施方案中，疏水性涂覆层包含无定形氟聚合物、cytop-m、cytop-s、cytop-a、聚四氟乙烯、teflon、派瑞林(parylen)、氟化烃、氟丙烯酸共聚物、cytonixfluoropel、氟硅烷、等离子体沉积的氟碳、硅聚合物、聚二甲基硅氧烷或硅氧烷或其混合物。在其它实施方案中，疏水性涂覆层包含全氟化聚合物。在其它实施方案中，疏水性涂覆层包含cytop-m、cytop-s或cytop-a或其混合物。在其它实施方案中，疏水性涂覆层包含cytop-s。在其它实施方案中，疏水性涂覆层包含cytop-m。在其它实施方案中，疏水性涂覆层包含cytop-s和cytop-a。

在一些实施方案中，疏水性涂覆层与表面直接接触。在其它实施方案中，疏水性涂覆层经由第一粘附促进层与表面接触。在一些实施方案中，第一粘附促进层包含cytop-a、aptms或aptes或其组合。

在一些实施方案中，光刻胶与固体支撑物的疏水性涂覆层直接接触。在其它实施方案中，光刻胶经由第二粘附促进层与固体支撑物的疏水性涂覆层接触。在一些实施方案中，第二粘附促进层包含氟化表面活性剂。在一些实施方案中，氟化表面活性剂是surflons-651、novecfc-4430、novecfc-4432、novecfc-4434、novecfc-5210、zonylfsn-100、zonylfs-300、zonylfs-500、capstonefs-10、capstonefs-30、capstonefs-60、capstonefs-61、capstonefs-63、capstonefs-64或capstonefs-65或其组合。

在一些实施方案中，光刻胶是shipleys1800^tm系列光刻胶。在一些实施方案中，光刻胶选自shipleys1818(microposit^tms1818^tm)和shipleys1805(microposit^tms1805^tm)。

在一些实施方案中，凝胶材料包括pazam。在一些实施方案中，凝胶材料包括附接至核酸的pazam。

在一些实施方案中，该表面还包括(a)结合材料层或(b)硅烷层，其中结合材料层或硅烷层任选地包含降冰片烯衍生的硅烷，并且其中结合材料层或硅烷层覆盖至少一部分的轮廓和一部分的疏水性间隙区。

本文还描述了制备此类图案化表面的方法。

定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。术语“包括(including)”以及其它形式诸如“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制性的。术语“有(having)”以及其它形式诸如“有(have)”、“有(has)”和“有(had)”的使用并不是限制性的。如在本说明书中所使用的，无论是在过渡短语中还是在权利要求的主体中，术语“包括/包含(comprise(s))”和“包括/包含(comprising)”将被解释为具有开放式含义。也就是说，上述术语应与短语“至少具有”或“至少包括”同义地解释。例如，当在工艺的上下文中使用时，术语“包括”意指该工艺至少包括引用的步骤，但可能包括额外的步骤。当在化合物、组合物或装置的上下文中使用时，术语“包括/包含”意指化合物、组合物或装置包括至少所引用的特征或组分，但也可包括另外的特征或组分。

如本文所用，常见缩写定义如下：

apts氨基丙基硅烷

aptes(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷

aptms(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷

aq.水性

azapan-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)乙酰胺

℃以摄氏度计的温度

ca接触角

cvd化学汽相沉积

datp脱氧腺苷三磷酸

dctp脱氧胞苷三磷酸

dgtp脱氧鸟苷三磷酸

dttp脱氧胸苷三磷酸

g克

h或hr小时

ipa异丙基醇

m或min分钟

ml微升

pazam任意丙烯酰胺与azapa之比的聚(n-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)

rt室温

sfa如美国专利公布no.2011/0059865中所定义的无硅烷丙烯酰胺

sbs边合成边测序

shp半-疏水性

ssdna单链dna

如本文所用，术语“附接”是指两个物体彼此连结、紧固、粘附、连接或结合的状态。例如，分析物诸如核酸，可以通过共价键或非共价键附接至诸如凝胶或固体支撑物的材料。共价键的特征在于原子之间共享电子对。非共价键是不涉及共享电子对的化学键，并且可以包括例如氢键、离子键、范德华力(vanderwaalsforces)、亲水性相互作用和疏水性相互作用。

如本文所用，术语“阵列”是指不同探针(例如，探针分子)的群体，所述探针附接至一个或多个基板，使得不同的探针可以根据相对位置彼此区分。阵列可包括不同的探针，每个探针位于基板上的不同的可寻址位置。可替代地或另外地，阵列可以包括各自具有不同探针的单独的基板，其中不同的探针可以根据基板所附接的表面上的基板位置或者根据液体中的基板位置来识别。其中单独的基板位于表面上的示例性阵列包括但不限于包括在例如美国专利no.6,355,431b1、us2002/0102578和pct公布no.wo00/63437中所述的孔中的珠粒的那些阵列。例如，在美国专利no.6,524,793中描述了可用于本发明中例如使用微射流装置诸如荧光活化细胞分选器(facs)以区分液体阵列中的珠粒的示例性形式。可用于本发明中的阵列的另外实例包括但不限于美国专利no.5,429,807；5,436,327；5,561,071；5,583,211；5,658,734；5,837,858；5,874,219；5,919,523；6,136,269；6,287,768；6,287,776；6,288,220；6,297,006；6,291,193；6,346,413；6,416,949；6,482,591；6,514,751和6,610,482；wo93/17126；wo95/11995；wo95/35505；ep742287；和ep799897中所述的那些阵列。

如本文所用，术语“共价附接”或“共价键合”是指形成化学键合，其特征在于在原子之间共享电子对。例如，共价附接的水凝胶是指与经由其它方式(例如，粘附或静电相互作用)附接至表面上相比，与基板的功能化表面形成化学键的水凝胶。应当理解，共价附接至表面的聚合物除了共价附接之外还可以经由工具键合。

如本文所用，术语“涂覆”，当用作动词时，旨在表示在表面上提供层或覆盖物。表面的至少一部分可以提供有层或覆盖。在一些情况下，整个表面可以提供有层或覆盖。在可替代的情况下，仅一部分表面将提供有层或覆盖物。术语“涂覆”当用于描述表面和材料之间的关系时，旨在表示材料作为层或覆盖存在于表面上。该材料可以密封表面，例如，防止液体或气体与表面接触。然而，材料不需要形成密封。例如，该材料可以是多孔至液体、气体，或液体或气体中携带的一种或多种组分。可涂覆表面的示例性材料包括但不限于凝胶、聚合物、有机聚合物、液体、金属、第二表面、塑料、二氧化硅或气体。

如本文所用，术语“分析物”旨在包括待检测、表征、修饰、合成等的各种分析物中的任何一种。示例性分析物包括但不限于核酸(例如，dna、rna或其类似物)、蛋白、多糖、细胞、细胞核、细胞器、抗体、表位、受体、配体、酶(如激酶、磷酸酶或聚合酶)、肽、小分子候选药物等。阵列可包括来自分析物文库的多种不同种类。例如，该物种可以是来自抗体文库的不同抗体，具有来自核酸文库的不同序列的核酸，具有与蛋白质文库不同的结构和/或功能的蛋白，来自小分子的组合文库的候选药物等。

如本文所用，术语“轮廓”旨在意指表面形状的局部变化。示例性轮廓包括但不限于孔、凹坑、通道、柱、墩和脊。轮廓可以表面中的各种凹陷或表面的突起中的任一者出现。全部或部分的轮廓可以作为阵列中的特征。例如，发生在固体支撑物的特定平面中的一部分轮廓可以用作该特定平面中的特征。在一些实施方案中，轮廓以规则的或重复的图案提供在表面上。

当材料在轮廓“内”时，它位于轮廓的空间中。例如，对于孔，材料在孔内，并且对于墩或柱，材料覆盖在表面平面上方延伸的轮廓。

在一个实施方案中，当第二层被称为“覆盖”第一层时，第二层呈第一层顶部上的薄膜形式。

如本文所用，术语“不同的”，当用于涉及核酸时，意指核酸具有彼此不相同的核苷酸序列。两个或更多个核酸可具有沿其整个长度不同的核苷酸序列。或者，两个或更多个核酸可具有沿其长度的大部分不同的核苷酸序列。例如，两个或更多个核酸可具有对于两个或更多个分子不同的靶核苷酸序列部分，同时还具有在两个或更多个分子上相同的通用序列部分。该术语可以类似地应用于基于氨基酸序列差异可区分为彼此不同的蛋白。

如本文所使用，术语“每个”在用于参考项集合时，旨在识别集合中的单个项，但不一定指代集合中的每个项。如果明确的公开内容或上下文另有明确规定，则可能发生例外情况。

如本文所用，术语“特征”意指阵列中的位置，其被配置为附接特定分析物。例如，特征可以是表面上的全部或部分轮廓。特征可以仅含有单个分析物，或者它可以含有多个分析物的群体，任选地，数个分析物可以是相同的物种。在一些实施方案中，特征在附接分析物之前存在于固体支撑物上。在其它实施方案中，通过将分析物附接至固体支撑物来产生该特征。

如本文所用，术语“流动池”旨在表示容器，该容器具有可进行反应的腔室、用于将试剂递送至腔室的入口和用于从腔室移除试剂的出口。在一些实施方案中，腔室被配置用于检测腔室中发生的反应(例如，在与腔室进行流体接触的表面上)。例如，腔室可以包括一个或多个透明表面，允许光学检测腔室中的阵列、光学标记分子等。示例性流动池包括但不限于核酸测序装置中使用的那些，诸如用于由illumina,inc.(sandiego,ca)商业化的genome或平台的流动池；或者用于由lifetechnologies(carlsbad,ca)商业化的solid^tm或iontorrent^tm测序平台的流动池。示例性流动池及其制造和使用方法也描述于例如wo2014/142841a1；美国专利申请公布no.2010/0111768a1和美国专利no.8,951,781，其每个通过引用并入本文。

如本文所用，术语“凝胶材料”旨在表示可透过液体和气体的半刚性材料。通常，凝胶材料在吸收液体时会膨胀，并且当液体例如通过干燥被去除时会收缩。示例性凝胶包括但不限于具有胶体结构的那些凝胶，诸如琼脂糖；聚合物网状结构，诸如明胶；或交联聚合物结构，诸如聚丙烯酰胺、无硅烷丙烯酰胺(参见，例如美国专利申请公布no.2011/0059865a1)、pazam(参见，例如美国专利no.9,012,022，其通过引用并入本文)，和美国专利公布no.2015/0005447和美国申请no.14/927,252中描述的聚合物，所有这些专利以引用的方式整体并入本文。特别有用的凝胶材料将符合其所在的孔或其它轮廓的形状。一些有用的凝胶材料可以(a)符合其所在的孔或其它轮廓的形状，并且(b)具有基本上不超过其所在的孔或轮廓的容积的体积。在一些特定的实施方案中，凝胶材料是聚合物水凝胶。

如本文所用，术语“间隙区”是指基板中或在表面上分隔基板或表面的其它区域的区域。例如，间隙区可以将一个轮廓或特征与表面上的另一个轮廓或特征分隔开。彼此分隔开的两个区域可以是离散的，彼此之间没有接触。在许多实施方案中，间隙区是连续的，而轮廓或特征是离散的，例如在其它连续的表面中的孔阵列的情况下。由间隙区提供的分离可以是部分的或完全的分离。间隙区通常具有不同于表面上的轮廓或特征的表面材料的表面材料。例如，阵列的轮廓可具有一定量或浓度的凝胶材料或分析物，其超过间隙区处存在的量或浓度。在一些实施方案中，凝胶材料或分析物可以不存在于间隙区处。

如本文所用，术语“核酸”和“核苷酸”旨在与它们在本领域中的用途一致并包括天然存在的物质或其功能类似物。特别有用的核酸功能类似物能够以序列特异性方式与核酸杂交或能够用作特定核苷酸序列复制的模板。天然存在的核酸通常具有含有磷酸二酯键的主链。类似物结构可以具有交替的主链键联，包括本领域已知的各种那些链键联中的任一种。天然存在的核酸通常具有脱氧核糖(如在脱氧核糖核酸(dna)中发现的)或核糖(如在核糖核酸(rna)中发现的)。核酸可含有具有本领域已知的这些糖部分的多种类似物中的任一种的核苷酸。核酸可包括天然的或非天然的核苷酸。在这方面，天然脱氧核糖核酸可以具有一个或多个选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤的碱基，并且核糖核酸可以具有一个或多个选自尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鸟嘌呤的碱基。可以包含在核酸或核苷酸中的有用的非天然碱基是本领域已知的。当用于指代核酸时，术语“探针”或“靶标”在本文所述的方法或组合物的上下文中旨在作为核酸的语义标识符，并且不一定限制核酸的结构或功能，除了明确另外指出的内容之外。术语“探针”和“靶标”可以类似地应用于其它分析物，诸如蛋白、小分子、细胞等。

如本文所用，术语“氟化”是指含有至少一个氟原子的分子。如本文所用，术语“全氟化”是指含有两个或更多个氟原子的分子。在一些实施方案中，全氟化分子是含烃分子，其中sp3-杂化碳上的氢原子被氟原子替代。例如，本文所述的某些全氟化合物含有全氟烷基基团或全氟亚烷基基团部分。

如本文所用，术语“光刻胶”及其衍生物是指在诸如光刻术、光刻蚀或光雕刻的工艺中使用的光敏材料，以在表面上形成图案化涂层。光刻胶材料在暴露于某些波长的光时就显影剂溶液而言改变溶解度。光刻胶层可由正性(暴露区变得可溶)或负性(暴露区变得不可溶)光刻胶材料组成。

如本文所用，术语“间距”，当用于参考表面上的轮廓或特征时，旨在表示相邻特征的中心-至-中心的间距。特征图案可以用平均间距来表征。可以对图案进行排序，使得围绕平均间距的变化系数小或者图案可以是随机的，在这种情况下，变化系数可以相对较大。在任何一种情况下，平均间距可以是例如，至少约10nm、0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、100μm或更大，或由两个前述值中的任一个限定的范围(例如，10至100nm、10至200nm、200至400nm、300至500nm)。可替代地或另外地，平均间距可以是例如至多约100μm、10μm、5μm、1μm、0.5μm、0.1μm或更小，或由两个前述值中的任一个限定的范围。当然，特定特征图案的平均间距可以在从上述范围中选择的较低值之一和较高值之一之间。

如本文所用，术语“重复图案”，当用于参考特征时，旨在表示对象的一个区域中的特征或轮廓的子集的相对位置与在对象的至少一个其它区域中的特征或轮廓的子集的相对位置相同。通常，重复发生在x和y维度上。一个区域通常与图案中的其它区域相邻。重复图案的一个区域中的特征的相对位置通常可以根据轮廓在重复图案的另一区域中的相对位置来预测。用于度量的子集通常将包括至少2个特征，但是可以包括至少3、4、5、6、10个或更多个特征。可替代地或另外地，用于度量的子集可以包括不超过2、3、4、5、6或10个特征。示例性重复图案包括正方形格子、矩形格子、菱形格子、六边形格子和倾斜格子。重复模式可以包括子模式的多次重复。

如本文所用，术语“隔离”，当用于参考两个轮廓上(或两个单独的特征处)的凝胶材料时，意指将一个轮廓上(或在其中一个特征处)的凝胶材料与另一个轮廓上(或其它特征处)的凝胶材料分开或分离。因此，第一轮廓上(或第一特征处)的凝胶材料不与另一个孔中(或另一个特征处)的凝胶材料直接接触。在一些实施方案中，术语“隔离”参考两个孔中的凝胶材料来使用，并且意指将一个孔中的凝胶材料与另一个孔中的凝胶材料分开或分离。在一些实施方案中，两个孔中(或两个特征处)的凝胶材料经由接触两个孔(或特征)的溶液间接接触。或者，两个孔中(或两个特征处)的凝胶材料甚至没有间接接触。通过缺少凝胶材料，表面上的间隙区可以将凝胶材料隔离在两个孔中(或在两个特征处)。在特定的实施方案中，凝胶材料可以在表面上是不连续的，存在于特征诸如孔处，但不存在于特征之间的间隙区处。

如本文所用，术语“表面”旨在表示固体支撑物或凝胶材料的外部或外层。表面可以与另一种材料诸如气体、液体、凝胶、聚合物、有机聚合物、类似的或不同的材料的第二表面、金属或涂层接触。表面或其区域可以是基本上平坦的或平面的。表面可以具有表面轮廓诸如孔、凹坑、通道、脊、凸起区域、钉、柱等。

如本文所用，术语“固体支撑物”是指不溶于水性液体中的刚性基板。基板可以是无孔的或多孔的。基板可任选地能够吸收液体(如，由于孔隙率)，但通常具有足够的刚性，使得基板在吸收液体时基本上不溶胀，并且当通过干燥去除液体时基板不会显著收缩。无孔固体支撑物通常是液体或气体不可渗透的。示例性固体支撑物包括但不限于玻璃和改性或官能化玻璃、塑料(如丙烯酸树脂，聚苯乙烯和苯乙烯与其它材料的共聚物，聚丙烯，聚乙烯，聚丁烯，聚氨酯，teflon^tm，环烯烃，聚酰亚胺等)，尼龙，陶瓷，树脂，zeonor，二氧化硅或基于二氧化硅的材料，这包括硅和改性硅、碳、金属、无机玻璃、光纤束和聚合物。对于一些实施方案特别有用的固体支撑物是流动池的组件或位于流动池装置内。

如本文所用，术语“孔”是指固体支撑物中的离散轮廓，其具有完全被表面的一个或多个间隙区围绕的表面开口。孔在其表面中的开口处可具有各种形状(包括但不限于圆形、椭圆形、正方形、多边形、星形(具有任意数量的顶点)等)中的任一种。与表面呈正交取向的孔的横截面可以是弯曲的、正方形的、多边形的、双曲线的、圆锥形的、角形的等。在一些实施方案中，孔是微米孔或纳米孔。

鉴于以上定义，可以理解本文所述和权利要求中所引用的实施方案。

图1显示了三种类型的氟聚合物，它们可用于产生基板的图案化表面的疏水性间隙区域。cytop-a、cytop-m和cytop-s是可商购获得的无定形全氟化聚合物，其各自具有以下主链结构：

以及聚合物链两端处的不同官能团。cytop-a具有-c(o)oh末端官能团。cytop-m具有-c(o)nh-si(or)n官能团。cytop-s具有-cf3官能团。图1还显示了每种类型的cytop聚合物与表面之间可能的相互作用的类型。这表明由于-cf3官能团的惰性，，cytop-s与金属表面、硅烷加工面或si/sin表面没有化学相互作用。

图2a是玻璃基板10的图案化表面的示意性横截面局部视图。如所示，玻璃基板10具有顶表面15和底表面20。顶表面15具有形成于顶表面15中的多个孔25a-25d。孔25a-25d的每一个具有衬在孔内壁上的聚合物材料或凝胶30a-30d。一系列疏水性间隙区35a-35e显示在位于孔25a-25d的各个之间的顶表面15上。如所示，聚合物材料或凝胶30a-30d沉积在孔25a-25d的底部上，并且dna簇40a-40d共价附接至凝胶材料30a-30d。

图2b是本文描述的表面的更详细的图解实例。如图所示，表面包括在载玻片顶部的三层材料。底部cytop层与底部玻璃表面直接接触。沉积在cytop材料顶部上的是降冰片烯衍生的硅烷层。降冰片烯层顶部是包含pazam的顶层。一组附接有荧光团tet^tm的接枝p5/p7寡核苷酸引物与pazam材料层结合。p5和p7引物的序列列于美国专利no.8,969,258中，其通过引用并入本文。

图2c是三个接枝玻璃表面的荧光图像。对cytop-s和cytop-m进行化学惰性测试。左表面用作对照，并且未涂覆任何cytop聚合物。中间表面涂覆有cytop-m并且右表面涂覆有cytop-s。然后，用降冰片烯衍生的硅烷处理每个表面，然后将pazam偶联并接枝p5和p7寡核苷酸至pazam。通过荧光标记的tet寡核苷酸(与p5和p7互补)的杂交并在typhoon荧光成像仪上检测来评价pazam附接的寡核苷酸的存在或不存在。在cytop-s处理的表面上缺少tet寡核苷酸强度表明寡核苷酸接枝的pazam未固定在cytop-s处理的表面上。

图3图示了化学处理之前和之后，cytop-m和cytop-s处理的玻璃表面与对照表面相比的接触角。cytop处理的玻璃表面对于cytop-m显示出约120度的接触角，并且对于cytop-s显示约123度的接触角。在降冰片烯硅烷层沉积之后，cytop-m的接触角降低至116度，并且cytop-s的接触角降低至120度。在pazam偶联和寡核苷酸接枝后，cytop-m表面的接触角显著降低至51度，表明dna簇和亲水性pazam聚合物结合到表面并且表面被赋予了亲水性。相比之下，cytop-s表面保持其疏水性，接触角略有下降。由于其化学惰性和疏水性特征，cytop-s被鉴定为是表面图案化的良好候选者(如，在携带分析物特征之间形成间隙区)。

图4中示出了典型的工作流程，用于使用cytop-s作为疏水性涂层制备图案化表面。首先，用cytop-s处理表面。因为cytop-s缺少用以偶联至玻璃或硅表面的任何反应性官能团，因此，可以使用粘附促进层来促进涂覆cytop-s至表面。在这个实例中，cytop-a薄层首先被涂覆在玻璃表面上。然后，将cytop-s均匀涂覆在表面上。在随后的固化之后，两个cytop层中的全氟化聚合物进一步缠结以形成更强的粘附。可用作玻璃或硅表面的粘附促进层的材料的非限制性实例还包括基于氨基的硅烷偶联剂，诸如aptms、aptes等。

在该标准工作流程中，cytop-s表面用氧等离子体处理，以沉积用于光刻术的标准光刻胶。等离子体处理使cytop-s更具亲水性，使光刻胶可以涂覆在其顶部上。通过这种表面改性，标准光刻胶倾向于从表面脱湿。在此过程中，cytop-s表面在氧等离子体处理后失去了其疏水性和化学惰性。虽然cytop-s表面的疏水性经由使用cytop-s溶液在180℃的高温回流步骤被恢复，但表面的化学惰性未被恢复并且观察到pazam与间隙cytop-s表面的非特异性结合。

回流工艺

在本文所述方法的任何实施方案中，所述方法还可包括回流工艺以在图案化期间恢复对表面的损坏。例如，如果在图案化过程中cytop-s表面已经损坏(诸如失去惰性或疏水性性质)，则可以通过使用含cytop-s溶剂的回流工艺恢复cytop-s表面性质。溶剂回流可以如图9a中举例说明的液相工艺或如图9b中举例说明的蒸汽相工艺来进行。液相回流的非限制性实例包括在表面上沉积cytop-s溶剂或在高温(例如，180℃)下直接在表面上旋涂，然后在较低温度(例如，50℃)下固化。在蒸汽相回流中，将基板放入真空密封的干燥器中，其中含有一定量的含cytop-s的溶剂，诸如2ml的全氟化碳氟化合物溶剂，诸如ct-solv100e。可在回流工艺中使用的溶剂包括但不限于ct-solv180或ct-solv100e。其它可选择的溶剂包括fluorinert^tmfc-40、fluorinert^tmfc-770，每种溶剂都能溶解全氟化聚合物。

在另一个实施方案中，图案化的cytop-s表面可在水凝胶涂覆后经过回流工艺以恢复表面性质的损坏。回流工艺对用于测序的水凝胶质量没有影响。图10a是在o2等离子体处理之后，pazam涂覆的cytop-s纳米孔(700nm至1.1μm)的光学显微术图像。图10b是液相溶剂回流后，图10a中pazam涂覆的cytop-s纳米孔的光学显微术图像。图10c是在用荧光模具润湿/去润湿水滴之后，图10b的pazam涂覆的cytop-s纳米孔的荧光图像，表明pazam仍然可用。

固体支撑物

在本公开的装置或方法中有用的固体支撑物可以是大致平坦的表面(如，芯片或载玻片)或可以具有弯曲表面(如圆柱或鼓)。它也可以是二维或三维的。有用的材料包括玻璃、石英、塑料(诸如聚苯乙烯(低交联和高交联聚苯乙烯)、聚碳酸酯、聚丙烯或聚(甲基丙烯酸甲酯))、丙烯酸共聚物、聚酰胺、硅、金属(如，烷硫醇酯衍生的金)、纤维素、尼龙、乳胶、葡聚糖、凝胶基质(如硅胶)、聚丙烯醛或复合材料。在一些实施方案中，固体支撑物包含玻璃。

特征

阵列的特征可以具有各种形状。在一些实施方案中，当所有轮廓用作阵列中的特征时，术语“特征”还指图案化表面上的“轮廓”。例如，当在二维平面中观察时，如在阵列的表面上，特征可以呈现圆形、环形、椭圆形、矩形、正方形、对称、不对称、三角形、多边形等。所述特征可以以规则的重复图案排列，包括例如正方形格子、矩形格子、菱形格子、六边形格子或倾斜格子。可以选择图案以达到所需的堆积水平。例如，圆形特征以六边形排列最佳地堆积。当然，其它堆积排列也可用于圆形特征，反之亦然。

可以选择阵列上的特征(或本文的方法或系统中使用的其它对象)的尺寸以适合特定应用。例如，在一些实施方案中，阵列的特征可以具有仅容纳单个核酸分子的尺寸。具有该尺寸范围内的多个特征的表面可用于构建用于以单分子分辨率检测的分子阵列。该尺寸范围的特征也可用于具有各自含有核酸分子群的特征的阵列中。因此，阵列的特征可以各自具有的面积不大于约1mm²、不大于约500μm²、不大于约100μm²、不大于约10μm²、不大于约1μm²、不大于约500nm²、或不大于约100nm²、不大于约10nm²、不大于约5nm²、或不大于约1nm²。可选地或另外地，阵列的特征将不小于约1mm²、不小于约500μm²、不小于约100μm²、不小于约10μm²、不小于约1μm²、不小于约500nm²、不小于约100nm²、不小于约10nm²、不小于约5nm²、或不小于约1nm²。实际上，特征的尺寸可以在从上面例举的那些中选择的上限和下限之间的范围内。尽管关于核酸和核酸规模已经例示了表面特征的数个尺寸范围，但是应当理解，这些尺寸范围内的特征可以用于不包括核酸的应用。将进一步理解，特征的尺寸不必限于用于核酸应用的规模。

阵列也可以用间隔来表征。例如，特征的尺寸和/或特征的间距可以变化，使得阵列可以具有期望的密度。例如，平均特征间距最大可为100μm、50μm、10μm、5μm、1μm、0.5μm、0.4μm、0.3μm、0.2μm、0.1μm或更小。可替代地或另外地，平均特征间距可以是至少0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm或更大。同样，最大特征间距最大可以为100μm、50μm、10μm、5μm、1μm、0.5μm、0.4μm、0.3μm、0.2μm、0.1μm或更小；和/或最小特征间距可以为至少0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm或更大。上述范围可适用于特征之间的平均、最大或最小间距。

根据每单位面积存在的特征数量，也可以理解阵列中特征的密度。例如，阵列的平均特征密度可以是至少约1x10³个特征/mm²、1x10⁴个特征/mm²、1x10⁵个特征/mm²、1x10⁶个特征/mm²、1x10⁷个特征/mm²、1x10⁸个特征/mm²或1x10⁹个特征/mm²或更高。可替代地或另外地，阵列的特征的平均密度可以是至多约1x10⁹个特征/mm²、1x10⁸个特征/mm²、1x10⁷个特征/mm²、1x10⁶个特征/mm²、1x10⁵个特征/mm²、1x10⁴个特征/mm²或1x10³个特征/mm²或更小。

具有规则特征图案的阵列可以相对于特征的相对位置排序，但是相对于各个特征的一个或多个其它特征是随机的。例如，在核酸阵列的情况下，核酸特征可以相对于它们的相对位置排序，但是对于任何特定特征中存在的核酸种类的序列的知识是随机的。作为更具体的实例，通过用模板核酸接种重复的特征图案并在每个特征处扩增模板以在特征处形成模板的拷贝(例如，经由簇扩增或桥扩增)形成的核酸阵列将具有核酸特征的规则图案，如由形成特征的轮廓的位置所确定，但对于跨阵列中核酸的序列分布是随机的。因此，通常在阵列上检测核酸材料的存在可以产生重复的特征图案，而序列特异性检测可以跨阵列产生非重复的信号分布。

在一些实施方案中，本文描述的方法形成具有单个重复图案的轮廓。在一些其它的实施方案中，本文描述的方法形成具有多个重复图案的轮廓，从而提供了具有至少第一重复特征图案和第二重复特征图案的阵列。在一些此类的实施方案中，第一图案和第二图案沿着外表面形成交错图案，其中第一重复图案的特征出现在第一标高处并且第二重复图案的特征出现在第二标高处，并且其中特征包括分析物的附接点，从而第一重复图案的特征被配置成将分析物附接在相对于附接至第二重复图案特征的分析物的不同标高处。2017年3月28日提交的且题为“multi-planemicroarrays”的pct申请no.pct/us2017/024578(其在此通过引用整体并入本文)中描述了可以在本文所述的方法或组合物中制备或使用的具有含多个重复图案的轮廓的基板的实例。

分析应用

一些实施方案涉及使用具有通过本文所述方法制备的图案化表面的基板检测分析物的方法。在一些实施方案中，分析物选自核酸、多核苷酸、蛋白、抗体、抗体表位、酶、细胞、细胞核、细胞器或小分子药物。在一个实施方案中，分析物是多核苷酸。在一个实施方案中，检测包括确定多核苷酸的核苷酸序列。

本文所述的一些实施方案涉及制备多核苷酸阵列的方法，该方法包括提供包括图案化表面的固体支撑物，该表面包括涂覆有能够共价键合至寡核苷酸的凝胶材料的微米尺度和/或纳米尺度的轮廓，该表面通过本文所述的任何方法制备；以及共价附接多个第一寡核苷酸和多个第二寡核苷酸至凝胶材料。在一些实施方案中，该方法还包括使附接至聚合物涂层的多个第一寡核苷酸与待扩增的模板接触，每个模板在3'末端包含能够与第一寡核苷酸杂交的序列并且在5'末端包含其补体能够与第二寡核苷酸杂交的序列。在一些实施方案中，该方法还包括使用第一寡核苷酸和第二寡核苷酸扩增模板，从而产生多核苷酸的聚簇阵列。

使用核酸的一些实施方案可包括在基板上扩增核酸的步骤。许多不同的dna扩增技术可以与本文所述的基板结合使用。可以使用的示例性技术包括但不限于聚合酶链式反应(pcr)、滚环扩增(rca)、多重置换扩增(mda)或随机引物扩增(rpa)。在特定的实施方案中，可以将一种或多种用于扩增的引物附接至基板(如经由凝胶或聚合物包被)。在pcr实施方案中，用于扩增的一种或两种引物可以附接至基板。利用两种附接引物的形式通常被称为桥扩增，因为双链扩增子在两个附接的引物之间形成桥状结构，所述引物位于已被复制的模板序列的侧翼。可以用于桥扩增的示例性试剂和条件描述于例如美国专利no.5,641,658；美国专利公布no.2002/0055100；美国专利no.7,115,400；美国专利公布no.2004/0096853；美国专利公布no.2004/0002090；美国专利公布no.2007/0128624；和美国专利公布no.2008/0009420，其中的每个都通过引用并入本文。

pcr扩增也可以用附接至基板的一种扩增引物和溶液中的第二引物进行。使用一种附接的引物和可溶性引物的组合的示例性形式是乳液pcr，例如在dressman等人,proc.natl.acad.sci.usa100:8817-8822(2003),wo05/010145，或美国专利公布no.2005/0130173或2005/0064460中所述，其各自通过引用并入本文。乳液pcr是对形式的说明，并且应理解，出于本文所述方法的目的，乳液的使用是任选的并且实际上对于若干实施方案，不使用乳液。此外，如epcr参考文献中所述，引物不需要直接附接至基板或固体支撑物，而是相反可以附接至如本文所述的凝胶或聚合物涂层。

可以修改rca技术以用于本公开的方法中。可以在rca反应中使用的示例性组分和rca产生扩增子的原理描述于例如lizardi等人,nat.genet.19:225-232(1998)和us2007/0099208a1，其各自通过引用并入本文。用于rca的引物可以在溶液中或附接至凝胶或聚合物涂层。

可以修改mda技术以用于本公开的方法中。mda的一些基本原理和有用条件描述于例如dean等人,procnatl.acad.sci.usa99:5261-66(2002)；lage等人,genomeresearch13:294-307(2003)；walker等人,molecularmethodsforvirusdetection,academicpress,inc.,1995；walker等人,nucl.acidsres.20:1691-96(1992)；us5,455,166；us5,130,238；和us6,214,587中，它们各自通过引用并入本文。用于mda的引物可以在溶液中或附接至凝胶或聚合物涂层。

在特定实施方案中，可以使用以上示例性扩增技术的组合。例如，rca和mda可以组合使用，其中rca用于在溶液中产生多联体扩增子(如使用溶液相引物)。然后可以将扩增子用作使用附接至基板的引物(如经由凝胶或聚合物涂层)的mda的模板。在该实例中，在组合的rca和mda步骤之后产生的扩增子将附接至基板。

含有核酸阵列的本发明的基板可用于任何各种目的。核酸的特别理想的用途是用作与具有互补序列的靶核酸杂交的捕获探针。一旦与捕获探针杂交，靶核酸可以经由募集至捕获探针的标记来检测。经由与捕获探针杂交检测靶核酸的方法是本领域已知的，并且包括例如美国专利no.7,582,420；6,890,741；6,913,884或6,355,431或美国专利公布no.2005/0053980a1；2009/0186349a1或2005/0181440a1中所述的那些方法，其各自通过引用并入本文。例如，通过捕获探针与带有标记的靶探针杂交，可以将标记募集至捕获探针。在另一个实例中，通过将靶探针与捕获探针杂交，可以将标记募集至捕获探针，使得捕获探针可以通过连接至标记的寡核苷酸(如经由连接酶活性)或通过添加标记的核苷酸(如经由聚合酶活性)延伸。

在一些实施方案中，本文所述的基板可用于测定多核苷酸的核苷酸序列。在此类实施方案中，该方法可包括以下步骤：(a)使多核苷酸聚合酶与附接至基板表面的多核苷酸簇接触(如，经由本文所述的聚合物或凝胶涂层中的任一种)；(b)将核苷酸提供至基板表面，使得当多核苷酸聚合酶利用一个或多个核苷酸时产生可检测信号；(c)检测一个或多个附接的多核苷酸(或从附接的多核苷酸产生的一个或多个簇)处的信号；和(d)重复步骤(b)和(c)，从而确定基板附接的多核苷酸的核苷酸序列。

核酸测序可通过本领域已知的各种方法用于确定多核苷酸的核苷酸序列。在优选的方法中，利用边合成边测序(sbs)来确定附接至基板表面的多核苷酸的核苷酸序列(如经由本文所述的聚合物涂层的任一种)。在此类方法中，将一个或多个核苷酸提供给与多核苷酸聚合酶相关的模板多核苷酸。多核苷酸聚合酶将一个或多个核苷酸掺入与多核苷酸模板互补的新合成的核酸链中。合成起始于寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物与模板多核苷酸的一部分互补或与在模板多核苷酸的一个末端处所共价结合的通用的或非可变的核酸的一部分互补。当核苷酸针对模板多核苷酸掺入时，产生可检测的信号，其允许确定在测序过程的每个步骤中掺入了哪种核苷酸。以此类方式，可以产生与模板多核苷酸的至少一部分互补的核酸序列，从而允许确定至少一部分模板多核苷酸的核苷酸序列。

流动池提供了用于容纳阵列的便利形式，该阵列通过本公开的方法产生并且经历边合成边测序(sbs)或涉及循环中重复递送试剂的其它检测技术。例如，为了引发第一sbs循环，一个或多个标记的核苷酸、dna聚合酶等可以流入/通过流动池，所述流动池容纳通过本文所述方法制备的核酸阵列。阵列中引物延伸的那些位点导致待掺入的标记的核苷酸可被检测到。任选地，核苷酸可以进一步包括可逆的终止特性，一旦核苷酸被添加到引物，其终止进一步的引物延伸。例如，可以将具有可逆终止子部分的核苷酸类似物添加到引物，使得在递送解封闭剂以除去该部分之前，不会发生随后的延伸。因此，对于使用可逆终止的实施方案，可以将解封闭剂递送至流动池(在检测发生之前或之后)。洗涤可以在各种递送步骤之间进行。然后可以将该循环重复n次，以使引物延伸n个核苷酸，从而检测长度为n的序列。可以容易地适用于通过本公开的方法产生的阵列的示例性sbs程序、流体系统和检测平台描述例如于bentley等人,nature456:53-59(2008)、wo04/018497；us7,057,026；wo91/06678；wo07/123744；us7,329,492；us7,211,414；us7,315,019；us7,405,281和us2008/0108082中，其各自通过引用整体并入本文。

在采用流动池的上述方法的一些实施方案中，在单个流动步骤期间，在流动池中仅存在单一类型的核苷酸。在此类实施方案中，核苷酸可选自datp、dctp、dgtp、dttp及其类似物。在采用流动池的上述方法的其它实施方案中，在单个流动步骤期间在流动池中存在多种不同类型的核苷酸。在此类方法中，核苷酸可选自datp、dctp、dgtp、dttp及其类似物。

通过检测在多核苷酸模板处或附近产生的信号，来实现确定附接至在流动池中存在的基板表面上聚合物涂层的一个或多个多核苷酸在每个流动步骤期间掺入的一个或多个核苷酸。在上述方法的一些实施方案中，可检测信号包括光信号。在其它实施方案中，可检测信号包括非光学信号。在此类实施方案中，非光学信号包括一个或多个多核苷酸模板处或附近处的ph变化。

对于核酸，本文举例说明了本公开的基板的应用和用途。然而，应该理解，其它分析物可以附接至本文所述的基板并进行分析。一种或多种分析物可以存在于本公开的基板中或基板上。本公开的基板尤其可用于检测分析物，或用于进行使用分析物的合成反应。因此，待检测、表征、修饰、合成等的各种分析物中的任何一种可存在于本文所述的基板中或基板上。示例性分析物包括但不限于核酸(如，dna、rna或其类似物)、蛋白、多糖、细胞、抗体、表位、受体、配体、酶(如激酶、磷酸酶或聚合酶)、小分子药物候选物等。基板可包括来自分析物库的多种不同物质。例如，该物质可以是来自抗体文库的不同抗体、具有来自核酸文库的不同序列的核酸、具有与蛋白文库不同的结构和/或功能的蛋白、来自小分子的组合文库的候选药物等。

在一些实施方案中，分析物可以分布到基板上的特征，使得它们可以单独地分辨。例如，每种分析物的单个分子可以存在于每个特征处。或者，分析物可以作为菌落或群体存在，使得不必分辨单个分子。就仅含有单一种类的分析物(尽管呈多拷贝)而言，菌落或群体可以是同源的。以核酸为例，底物上的每个特征可以包括核酸的菌落或群体，并且菌落或群体中的每个核酸可以具有相同的核苷酸序列(单链或双链)。此类菌落可以通过如前所述的簇扩增或桥扩增产生。靶序列的多次重复可以存在于单个核酸分子中，诸如使用滚环扩增程序产生的多联体。因此，基板上的特征可含有多个拷贝的单一种类的分析物。或者，处于特征处的分析物的菌落或群体可包括两种或更多种不同的种类。例如，基板上的一个或多个孔可各自含有具有两种或更多种不同核酸种类的混合菌落(即具有不同序列的核酸分子)。混合菌落中的两种或更多种核酸种类可以以不可忽略的量存在，例如允许在混合菌落中检测到多于一种的核酸。

实施例

在以下实施例中进一步详细公开了另外的实施方案，这些实施例不旨在以任何方式限制权利要求的范围。

实施例1

图5是使用cytop-s进行制备图案化表面的示例性方法的工作流程图。如上所述，发现cytop-s表面的氧等离子体处理导致cytop层的疏水性和化学惰性丧失。发现某些光刻胶，诸如shipley18系列光刻胶，可以直接在cytop-s涂覆表面上旋涂而不需要任何氧等离子体处理。

表面制备：首先，用异丙基醇(ipa)、去离子水(di)清洗基板(玻璃基板或二氧化硅涂覆的si基板)，然后用氮气吹干。然后，将基板置于60℃的真空干燥器中12小时，用aptms进行硅烷化。然后，将0.5％cytop-a涂层溶液以2000rpm旋涂在基板表面上20秒。将涂覆的基板在50℃下软烘烤30分钟。随后，将5％cytop-s涂层溶液以1000rpm旋涂在cytop-a层上30秒。为了制备cytop-a和cytop-s溶液，使用基于碳氟化合物的溶剂诸如来自agc的ct-solv180。将基板在室温下干燥30分钟，然后在50℃下烘烤30分钟，接着在80℃下烘烤30分钟，最后在250℃下烘烤30分钟。完成cytop-a/s涂层并且准备基板用于光刻术。

光刻术：将shipleys1800光刻胶直接旋涂在基板表面的cytop层上(如，3000rpm，30秒，用以涂覆厚度为0.5μm的shipleys1805)。将基板在115℃下软烘烤60秒。具有g线uv(g-lineuv)的接触对准器或步进器可用于光刻术，暴露能量约为120mj/cm²。通过将基板放入micropositmf-321显影剂中60秒、然后用去离子水冲洗、接着用氮气吹干来进行显影过程。然后将shipleys18光刻胶图案化基板在120℃的烘箱中硬烘烤30分钟。为了蚀刻掉孔区域中的cytop以暴露下面的sio2表面，用o2等离子体处理基板(平行板等离子蚀刻器(parallelplateplasmaetcher)，100sccmo2通量，150w，180秒干蚀刻)。得到的基板表面包括由cytop-s覆盖的间隙区隔开的图案化的暴露的sio2表面，准备用于水凝胶图案化步骤。

水凝胶图案化：硅烷偶联剂沉积在基板的处理过的表面上，覆盖暴露的sio2表面和由cytop-s覆盖的间隙区。然后将水凝胶旋涂在硅烷偶联剂上以形成共价键，使得水凝胶固定在表面上。固化后，冲洗掉过量的水凝胶。水凝胶图案化表面可直接用于寡聚接枝而无需抛光。

图6a和6b是在聚类和14个循环测序之前和之后，以28μm的间距包含14μm微孔的图案化装置表面的荧光图像。根据图5中描述的shipley光刻胶工作流程，使用shipleys1805制备装置表面，对于组合的cytop-a和cytop-s层，总厚度为370nm。图6a说明了用tet染料标记的寡聚引物接枝的pazam图案化表面的图像。图6b说明了用嵌入染料标记的微孔中dna簇的生长。从这些图像可以清楚地看出，在微孔之间的疏水性cytop-s间隙区中没有引物或dna簇的非特异性结合的迹象。

该过程在以1.8μm间距包含700nm微孔的装置上复制，其使用与图5中描述的相同的shipley18光刻胶工作流程制造。图6c是通过嵌入染料可视化的700nm微孔中的图案化dna簇的荧光图像。同样，图像显示出非常干净的cytop-s间隙区。

实施例2

在这个实例中，进行了两个使用标准光刻胶而不需要在光刻术之前对表面进行氧等离子体处理来创建图案化表面的工艺-直接图案化工艺和剥离工艺。

图7示出了用于创建图案化表面的直接图案化工作流程。

表面制备：首先，按照实施例1中所述的相同步骤，将cytop-a和cytop-s涂覆到固体支撑物的表面上。然后，将含氟表面活性剂suflon-s651与异丙醇(ipa)混合以形成1％溶液，并在cytop-s表面上以500rpm旋涂5秒，然后以4000rpm旋涂50秒。该步骤减少了cytop层和沉积在其上的光刻胶层之间的表面能的错配。随后，来自microchem的lor抗蚀剂直接在经处理的表面上旋涂，而不需要任何氧等离子体处理。这种方法拓展了工艺流程，使得能够使用在shipley18光刻胶之外的制造设施中所用的各种光刻胶。该工作流程中的后续步骤包括光刻胶涂覆、软烘烤、uv对准/暴露以及适合于给定光刻胶产品的显影。为了蚀刻掉孔区中的cytop聚合物以暴露下面的sio2区，用o2等离子体(平行板等离子蚀刻机，100sccmo2通量，150w，180秒干蚀刻)处理基板。所得到的基板表面包括由疏水性间隙区分开的图案化的暴露的sio2表面，准备用于水凝胶图案化步骤。

直接图案化：首先，通过在丙酮中对基板进行超声处理10分钟，然后用ipa冲洗、水冲洗、然后空气吹干，以去除残留在基板表面上的光刻胶。可替代地，可以通过microchemremoverpg剥去光刻胶lor，然后可以用丙酮剥去suflon-s651。光刻胶和含氟表面活性剂的去除使下方作为间隙区的cytop-s涂层暴露。随后，将基板置于60℃的真空干燥器中12小时，用于降冰片烯硅烷化。在硅烷化完成后，然后用pazam涂覆基板并在60℃的烘箱中孵育1小时。用di水冲洗掉过量的水凝胶。然后将基板在di水中于45℃超声处理30分钟以去除松散地保留在表面上且没有共价键合的过量水凝胶。得到的基板将具有涂覆在孔区域中的水凝胶和干净的不含水凝胶的cytop间隙区。基板准备用于以下引物接枝和dna接种和测序。

图8a说明了用于创建图案化表面的剥离图案化工作流程。底板制造过程与图7中例示的工作流程中所描述的相同。在cytop和surflon涂覆和光刻术之后，蚀刻图案化表面以暴露孔中下面的sio2表面。然后，将具有保留在表面上的光刻胶层的图案化基板直接放入60℃的真空干燥器中12小时，以用于降冰片烯硅烷化。然后用pazam涂覆基板并在60℃烘箱中孵育1小时。用di水冲洗掉过量的水凝胶。然后将基板在di水中于45℃超声处理30分钟以去除松散地保留在表面上而没有共价键合的水凝胶。随后，将基板在丙酮中于45℃超声处理30分钟，以去除间隙区处的光刻胶层。沉积在光刻胶层顶部的水凝胶也同时被去除。在间隙区处干净的cytop表面被暴露。得到的基板表面具有固定在孔区域中的水凝胶和干净的不含水凝胶的cytop间隙区域。然后将基板准备用于下面的引物接枝和dna接种和测序。

图8b说明了使用图8a中例示的剥离工作流程在14μm微孔结构中的图案化pazam和dna簇的荧光图像。用嵌入染料对dna簇染色。该图像表明水凝胶图案化结果与图7中直接图案化工作流程所获得的结果相当。

此外，cytop-s表面在直接和剥离过程中水凝胶图案化后恢复了表面疏水性，与直接图案化方法相比，剥离法保留了更好的表面疏水性。

实施例3

具有cytopa表面和各种孔图案的图案化流动池如本文所述进行制备。使用examp扩增方法和2×150个循环运行进行dna序列的扩增。孵育运行1分钟，15秒解封闭，并且以65ul体积进行反应。获得以下结果，并且结果显示在图13a-图13c中。

结果表明cytop图案化与illuminasbs化学相容，并且表面稳健以允许数千次的流量交换以完成2x150bps测序运行。