傅里叶叠层显微成像装置及方法与流程

本发明属于光学显微成像技术领域，涉及傅里叶叠层显微成像技术，具体涉及一种基于液晶光束偏转技术的傅里叶叠层显微成像装置及方法。

背景技术：

传统光学显微镜无法同时获得大视场、高分辨率图像，而且只能获取样品的振幅信息，无法得到相位信息。

2013年加州理工大学的zheng首次将傅里叶叠层成像技术引入到显微成像领域，同时实现了高分辨率和大视场的显微成像技术：通过将led阵列放置在样品下方一定距离处，样品台上的薄样品由来自不同led发出的不同角度的平面光照亮，在显微物镜的傅里叶平面上，样品的频谱对应于不同的照明角度产生不同量的频移，因此原本一些超出显微物镜数值孔径的样品频率成分便被平移到孔径内，从而能够获得更多频域信息并传递到像面进行成像；然后通过傅里叶叠层相位恢复算法将不同角度照明下获得的低分辨率图像进行融合重建，恢复出样品的图像(包含强度信息和相位信息)。上述这些方案虽然能够得到包含强度信息和相位信息的样品图像，但是由于led阵列相干性较低、角度控制精度较差等因素制约，使得上述方案在实施时，存在恢复样品图像的效率低、分辨率低的缺点。

技术实现要素：

为了解决现有的傅里叶叠层显微成像技术恢复样品图像的效率低、分辨率低的技术问题，本发明提供了一种傅里叶叠层显微成像装置及方法。

本发明的技术方案是：

傅里叶叠层显微成像装置，其特殊之处在于：包括计算机以及沿光路从下至上依次设置的激光器、准直透镜、液晶光束偏转器件、样品台、显微物镜、管镜和相机；

所述准直透镜的出射光束中心、液晶光束偏转器件的中心均与显微物镜的光轴重合；

所述液晶光束偏转器件和相机均与所述计算机相连；

所述液晶光束偏转器件根据所述计算机的控制指令，调制入射于待测样品上的光束角度；相邻两个角度的光束单独照亮样品后，在所述显微物镜的傅里叶平面上所获取的衍射频谱信息有≥50％重叠率；

所述相机根据所述计算机的控制指令采集入射至待测样品上的每一个光束角度对应的样品的显微图像；

所述计算机还用于对所述相机获取的不同光束角度下的显微图像，采用傅里叶叠层相位恢复算法进行融合重建，得到最终样品图像。

进一步地，所述液晶光束偏转器件紧贴所述样品台放置。或者，所述液晶光束偏转器件固定于二维平移台上，且距离所述样品台有一定距离。

进一步地，液晶光束偏转器件为液晶数字光束偏转器、液晶偏振光栅、液晶棱镜或液晶光学相控阵。

本发明同时提供了一种基于上述任一傅里叶叠层显微成像装置的成像方法，其特殊之处在于，包括步骤：

1)确定液晶光束偏转器件每次调制的光束角度αi,j：

光束角度αi,j由sinαi,j/λ＝fi,j确定；

fi,j为原频谱每次移动半个fx之后的频谱中心坐标值；

fi,j＝(0.5ifx，0.5jfx)；

其中：

fx为每次的频谱平移量，

λ为激光器输出光束的中心波长；

i＝0，1，-1，2，-2，3，-3，……，n，-n；

j＝0，1，-1，2，-2，3，-3，……，n，-n；

i＝0，j＝0时表示光束垂直于液晶光束偏转器件出射；

定义显微物镜光轴方向为z轴方向，平行于相机光敏面侧边的方向为x轴方向；

i＝0，j≠0时表示光束沿x轴偏转；

i≠0，j＝0时表示光束沿y轴偏转；

i≠0，j≠0时表示光束沿x、y轴均偏转；

i或j的绝对值越大，表示光束沿x或y轴的偏转角度越大；

n为正整数，n＝2na′/na；na为显微物镜的数值孔径；

na′为想要获得的合成数值孔径；

2)确定各光束角度αi,j的调制顺序：

各光束角度αi,j按以下顺序调制：

αn，n、αn，n-1、αn，n-2、……、αn，0、αn，-1、αn，-2、……、αn，-n、

αn-1，n、αn-1，n-1、αn-1，n-2、……、αn-1，0、αn-1，-1、αn-1，-2、……、αn-1，-n、

αn-2，n、αn-2，n-1、αn-2，n-2、……、αn-2，0、αn-2，-1、αn-2，-2、……、αn-2，-n、

……

α0，n、α0，n-1、α0，n-2、……、α0，0、α0，-1、α0，-2、……、α0，-n、

α-1，n、α-1，n-1、α-1，n-2、……、α-1，0、α-1，-1、α-1，-2、……、α-1，-n、

α-2，n、α-2，n-1、α-2，n-2、……、α-2，0、α-2，-1、α-2，-2、……、α-2，-n、

……

α-n，n、α-n，n-1、α-n，n-2、……、α-n，0、α-n，-1、α-n，-2、……、α-n，-n；

3)图像采集：

计算机按照步骤2)确定的光束角度αi,j的调制顺序，控制液晶光束偏转器件进行光束调制，以及控制相机依次采集光束角度αi,j对应的样品显微图像；

4)图像融合：

计算机利用傅里叶叠层相位恢复算法，将步骤3)中相机采集的所有样品显微图像融合，恢复出一幅高分辨率、大视场的样品图像。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明使用激光器作为照明光源，可以使光源有较高的相干性，有利于后续利用傅里叶叠层算法从低分辨率图像中恢复出高分辨率图像。

2、采用液晶光束偏转器件对激光照明光束进行调制，不但使照射在待测样品上的每个角度的照明光的发光强度相同，光源稳定性高，还能实现任意角度的高分辨率、高精度快速控制，装置更加灵活。

3、利用液晶光束偏转器件容易实现大角度照明，突破led阵列对于照明角度的限制。

4、本发明光源的调制便于控制，调制效率高，精度高，使得获取的低分辨率图像较之现有技术准确度更高，提升了算法的运行效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例。

图1是本发明装置示意图；

图2是本发明实例中所采用的被测样品；

图3是本发明实例恢复出的高分辨率大视场图像；

图4是本发明实例中单个角度照明时获取的低分辨率图像。

附图1标记说明：1-激光器，2-准直透镜，3-液晶光束偏转器件(液晶棱镜)，4-样品台，5-显微物镜，6-管镜，7-相机，8-计算机。

具体实施方式

如图1所示，本发明所提供的傅里叶叠层显微成像装置，包括计算机8以及沿光路从下至上依次设置的激光器1、准直透镜2、液晶光束偏转器件3、样品台4、显微物镜5、管镜6和相机7；

准直透镜2的出射光束中心、液晶光束偏转器件3的中心均与显微物镜5的光轴重合；

液晶光束偏转器件3紧贴样品台4放置，测试过程中应使经过液晶光束偏转器件调制后的出射光束中心始终对准待测样品的正中心，这样角度调制过程中液晶光束偏转器件3发出的每个角度的光束都能照射在待测样品上；也可以将液晶光束偏转器件3固定在二维平移台上，且距离所述样品台4有一定距离，通过控制二维平移台在x、y轴方向上移动一定的距离，使得经过液晶光束偏转器件3调制后的出射光束中心仍对准样品的正中心，以保证角度调制过程中液晶光束偏转器件3发出的每个角度的光束都能照射在待测样品上。

液晶光束偏转器件3和相机7均与计算机8相连；

液晶光束偏转器件3根据所述计算机8的控制指令(市面上已有液晶光束偏转器件有相应的控制软件)，调制入射于待测样品上的光束角度；相邻两个角度的光束单独照亮样品后，在显微物镜5的傅里叶平面上所获取的衍射频谱信息有重叠；为了能够恢复出高分辨率图像，必须有≥50％的重叠率。

相机7根据计算机8的控制指令(相机采集图像是通过现有的相机采集软件实现控制)采集入射至待测样品上的每一个光束角度对应的样品的显微图像；计算机8还用于对所述相机7获取的不同光束角度下的显微图像，采用傅里叶叠层相位恢复算法进行融合重建，得到最终样品图像。

液晶光束偏转器件3可以采用液晶数字光束偏转器(dld)、液晶偏振光栅(pg)、液晶棱镜(prism)或液晶光学相控阵(opa)。其中，液晶数字光束偏转器和液晶棱镜属于折射式光束偏转器件，液晶偏振光栅和液晶光学相控阵属于衍射式光束偏转器件。液晶光学相控阵(opa)的液晶电极间距很小，如果施加在液晶电极上的电压分辨率足够高，则液晶光学相控阵(opa)可以实现超高分辨率、微弧度级的光束偏转，液晶盒很薄的情况下还可以实现实时、超高速的光束偏转。

基于上述傅里叶叠层显微成像装置的成像方法，包括步骤：

1)确定液晶光束偏转器件3每次调制的光束角度αi,j：

光束角度αi,j由sinαi,j/λ＝fi,j确定；

fi,j为原频谱每次移动半个fx之后的频谱中心坐标值；

fi,j＝(0.5ifx，0.5jfx)；

其中：

fx为每次的频谱平移量，

l为样品距显微物镜5的距离，d为显微物镜5的口径；

λ为激光器1输出光束的中心波长；

i＝0，1，-1，2，-2，3，-3，……，n，-n；

j＝0，1，-1，2，-2，3，-3，……，n，-n；

i，j序号表示光源在x、y方向上角度的编号；

i＝0，j＝0时表示光束垂直于液晶光束偏转器件3出射，与显微物镜5的光轴重合；

i＝0，j≠0时表示光束沿x轴偏转；

i≠0，j＝0时表示光束沿y轴偏转；

i≠0，j≠0时表示光束沿x、y轴均偏转；

i或j的绝对值越大，表示光束相对于x轴或y轴的偏转角度越大(根据公式计算出的光束角度αi,j是根据这个原则与角标i、j进行匹配的)；

n为正整数，由想要获得的合成数值孔径na＇确定；

上述坐标系方向定义：

定义显微物镜5光轴方向为z轴方向，平行于相机7光敏面侧边的方向为x轴方向，垂直于x、z轴的方向为y轴方向。

光束相对x轴的偏转角度是指在xz平面内，光束与z轴的夹角；光束相对于y轴的偏转角度是指在yz平面内，光束与z轴的夹角。

2)确定各光束角度αi，j的调制顺序：

各光束角度αi，j按以下顺序调制：

αn，n、αn，n-1、αn，n-2、……、αn，0、αn，-1、αn，-2、……、αn，-n、

αn-1，n、αn-1，n-1、αn-1，n-2、……、αn-1，0、αn-1，-1、αn-1，-2、……、αn-1，-n、

αn-2，n、αn-2，n-1、αn-2，n-2、……、αn-2，0、αn-2，-1、αn-2，-2、……、αn-2，-n、

……

α0，n、α0，n-1、α0，n-2、……、α0，0、α0，-1、α0，-2、……、α0，-n、

α-1，n、α-1，n-1、α-1，n-2、……、α-1，0、α-1，-1、α-1，-2、……、α-1，-n、

α-2，n、α-2，n-1、α-2，n-2、……、α-2，0、α-2，-1、α-2，-2、……、α-2，-n、

……

α-n，n、α-n，n-1、α-n，n-2、……、α-n，0、α-n，-1、α-n，-2、……、α-n，-n；

3)图像采集：

计算机8按照步骤2)确定的光束角度αi，j的调制顺序，控制液晶光束偏转器件3进行光束调制，以及控制相机7依次采集光束角度αi，j对应的样品显微图像，共(2n+1)²幅；

4)图像融合：

计算机8利用傅里叶叠层相位恢复算法，将步骤3)中相机7采集的所有样品显微图像融合，恢复出一幅高分辨率、大视场的样品图像。

实施例：

液晶光束偏转器件3采用液晶棱镜；

显微物镜5采用两倍消色差显微物镜，数值孔径na为0.1，物镜口径为15mm；

被测样品(如图2)为usaf1951标准分辨率板；

激光器1选用波长为632nm的红光he-ne激光器；

准直透镜2将激光光束准直为的平行光；

相机7采用像素元尺寸5.5um的ccd传感器；

液晶棱镜紧贴样品台4正下方放置；

想要达到的合成数值孔径na＇为0.3，且要确保频谱重叠率＝50％。

按照以下步骤实施：

第一步：确定液晶棱镜每次调制的光束角度αi,j。

1.1根据n＝2na′/na，计算出n＝6；

na为显微物镜5的数值孔径；

na′为想要获得的合成数值孔径；

1.2根据sinαi,j/λ＝fi,j确定光束角度为0°、±3.6°、±7.3°、±11.0°、±14.7°、±18.5°、±22.4°(相对x、y方向偏转角度相同)，因此，α0，0＝0°、

α0，1＝3.6°(沿x轴偏转)、α1，0＝3.6°(沿y轴偏转)、α1，1＝3.6°(沿x、y轴均偏转)，…，α0，6＝22.4°(沿x轴偏转)、α6，0＝22.4°(沿y轴偏转)、α6，6＝22.4°(沿x、y轴均偏转)，…，α0，-1＝-3.6°(沿x轴偏转)、α-1，0＝-3.6°(沿y轴偏转)、α-1，-1＝-3.6°(沿x、y轴均偏转)，…，α0，-6＝-22.4°(沿x轴偏转)、α-6，0＝-22.4°(沿y轴偏转)、α-6，-6＝-22.4°(沿x、y轴均偏转)。

第二步：确定液晶棱镜调制光束出射角度的顺序。

由于要求相邻两次采集的图像频谱必须有一定的重叠率，所以各光束角度αi，j按照下述顺序进行调制：

α6，6、α6，5、α6，4、……、α6，0、α6，-1、α6，-2、α6，-3、……、α6，-6、

α5，6、α5，5、α5，4、……、α5，0、α5，-1、α5，-2、α5，-3、……、α5，-6、

α4，6、α4，5、α4，4、……、α4，0、α4，-1、α4，-2、α4，-3、……、α4，-6、

……

α0，6、α0，5、α0，4、……、α0，0、α0，-1、α0，-2、α0，-3、……、α0，-6、

α-1，6、α-1，5、α-1，4、……、α-1，0、α-1，-1、α-1，-2、α-1，-3、……、α-1，-6、

α-2，6、α-2，5、α-2，4、……、α-2，0、α-2，-1、α-2，-2、α-2，-3、……、α-2，-6、

……

α-6，6、α-6，5、α-6，4、……、α-6，0、α-6，-1、α-6，-2、α-6，-3、……、α-6，-6。

第三步：图像采集。

计算机8按照第二步确定的角度调制顺序，控制液晶棱镜出射光的角度，以及控制相机7进行相应的图像采集，液晶棱镜出射的光束每变换一次角度，相机7就采集一幅样品显微图像，相机7总共采集(2n+1)²幅样品显微图像(样品低分辨率图像)。

第四步：图像融合。

计算机8利用傅里叶叠层相位恢复算法，将第三步采集的(2n+1)²幅图像进行融合，恢复出一幅高分辨率、大视场的样品图像，恢复重建结果如图3所示。

通过单个照明角度获取的样品低分辨率图像如图4所示(此处采取的角度为0度时的低分辨率图像)。

图4中的5、6组是不可分辨的，而图3中的5、6组可以明显分辨，能够看出，重建后的图像分辨率明显提高。