一种生物光敏树脂及其制备方法和构建立体预血管网络通道的方法与流程

本发明涉及生物增材制造技术领域，尤其涉及一种生物光敏树脂及其制备方法和构建立体预血管网络通道的方法。

背景技术：

目前，组织工程构建技术发展较快，但是构建大体积的三维组织工程仍存在较多问题，其中，承担输送氧气和营养任务的可灌注血管网络是三维组织工程的主要局限之一。随着组织工程领域研究的不断深入，越来越多的研究人员开始尝试构建符合生物学需求的厚组织，在天然组织中，末端毛细血管之间的距离为100～200μm，以满足细胞与血管之间营养物质输送以及废物排出，如果缺乏血管网络，则会导致细胞组织缺氧坏死。预血管网络通道的构建是目前生物制造领域解决血管化的有效途径之一，预血管网络通道对于组织内细胞的营养供给、气体交换、生长因子和蛋白质的传递以及细胞的新陈代谢有着极其重要的意义。

目前，构建预血管网络通道的方法主要有生物打印方法、牺牲材料方法和层层组装方法。生物打印方法主要是同轴挤出，即采用化学交联的方式构建中空的微血管结构，但是该种方法的最大问题是目前只能构建单一的血管，无法构建立体分叉血管网络，然而实际生物体的血管结构，均为分叉且复杂的空间结构。牺牲材料方法是当下较为热门的研究方向，基本原理是利用具有温度或其它可逆响应的牺牲材料作为血管网络管道的预填充物，采用浇铸的方式成型，然后将牺牲材料去除，形成可灌注的预血管网络通道，常见的牺牲材料有碳水化合物玻璃、石蜡、琼脂糖、聚醚f127、海藻酸钠。该方法适合结构简单的预血管网络通道，螺旋等复杂预血管网络通道的构建效果不理想，强度较低。层层组装方法的基本原理是将提前构建好的具有内部血管通道的薄层叠加形成大尺寸厚组织，实现内部通道的互联。但是层层表面之间的接合主要通过压力机械接合、化学键接合、接合剂接合和交联剂接合等方式，效率低，且层层表面仅能依靠后期接合，机械性能较差。因此目前仍缺少高效构建复杂立体预血管网络通道的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种生物光敏树脂及其制备方法和构建立体预血管网络通道的方法，本发明提供的生物光敏树脂具有良好的生物相容性，且符合掩模投影光刻法对于树脂的要求，能够高效率、高精度实现复杂立体预血管网络通道的制备。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种生物光敏树脂，包括以下质量份数的制备原料：

甲基丙烯酰化明胶14～16份，所述甲基丙烯酰化明胶由猪皮明胶与甲基丙烯酸酐经改性反应得到；

光引发剂0.9～8.1份；

紫外线阻滞剂0.09～0.11份；

添加剂15～35份；

溶剂80～100份。

优选地，所述猪皮明胶与甲基丙烯酸酐的用量比为(9～11)g：(7.5～8.5)ml。

优选地，所述改性反应的温度为45～60℃，时间为1～2.5h。

优选地，所述光引发剂包括光引发剂irgacure2959、光引发剂1173或光引发剂907。

优选地，所述紫外线阻滞剂包括hmbs紫外线阻滞剂、ehmc紫外线阻滞剂或hms紫外线阻滞剂。

优选地，所述添加剂包括碳酸钙微粒、羟基磷灰石、二脲烷二甲基丙烯酸酯、聚醚醚酮、丝素蛋白、胶原和血管内皮生长因子中的至少一种。

优选地，所述溶剂包括水或磷酸盐缓冲溶液。

本发明提供了上述技术方案所述生物光敏树脂的制备方法，包括以下步骤：

将甲基丙烯酰化明胶、光引发剂、紫外线阻滞剂、添加剂和溶剂混合，得到生物光敏树脂。

本发明提供了一种构建立体预血管网络通道的方法，包括以下步骤：

建模，得到具有中空血管通道的方形结构体模型，对所述具有中空血管通道的方形结构体模型进行分层切片；

采用掩模投影光刻法，以生物光敏树脂为原料，根据具有中空血管通道的方形结构体模型的分层切片数据，构建得到立体预血管网络通道；其中，所述生物光敏树脂为上述技术方案所述生物光敏树脂或上述技术方案所述制备方法制备得到的生物光敏树脂。

优选地，所述掩模投影光刻法的操作参数包括：光源波段为320～500nm，临界暴露时间为30～60s，渗透深度为30～50μm。

本发明提供了一种生物光敏树脂，包括以下质量份数的制备原料：甲基丙烯酰化明胶14～16份，所述甲基丙烯酰化明胶由猪皮明胶与甲基丙烯酸酐经改性反应得到；光引发剂0.9～8.1份；紫外线阻滞剂0.09～0.11份；添加剂15～35份；溶剂80～100份。本发明利用甲基丙烯酰化明胶、光引发剂和紫外线阻滞剂制备得到的生物光敏树脂具有良好的生物相容性，且符合掩模投影光刻法对于树脂的要求，能够高效率、高精度实现复杂立体预血管网络通道的制备，同时能够形成具有不同尺寸的空间血管网络通道，最大限度的为厚组织提供营养物质和氧气、排除废气等，促进组织结构的快速生长，构建的立体预血管网络通道类似于生物体血管结构，具有仿生的特点；且其构建过程无需借助任何其他材料及模具，无需多次繁琐操作，一次成型，效率高，立体预血管网络通道的复杂程度不受限制。

附图说明

图1为本发明基于掩模投影光刻法构建立体预血管网络通道的原理示意图，图中，1-uv紫外光源模块，2-动态掩模模块，3-光学成像模块，4-光学调整模块，5-光敏树脂容器，6-平台线性执行模块，7-控制器子系统。

具体实施方式

本发明提供了一种生物光敏树脂，包括以下质量份数的制备原料：

甲基丙烯酰化明胶14～16份，所述甲基丙烯酰化明胶由猪皮明胶与甲基丙烯酸酐经改性反应得到；

光引发剂0.9～8.1份；

紫外线阻滞剂0.09～0.11份；

添加剂15～35份；

溶剂80～100份。

在本发明中，没有特殊说明的话，各试剂均为本领域技术人员熟知的市售商品；具体的，所述猪皮明胶采购自signa，其余试剂均采购自阿拉丁。

按质量份数计，本发明提供的生物光敏树脂的制备原料包括甲基丙烯酰化明胶14～16份，优选为15份，所述甲基丙烯酰化明胶由猪皮明胶与甲基丙烯酸酐经改性反应得到。在本发明中，所述猪皮明胶与甲基丙烯酸酐的用量比优选为10g：(7～9)ml，更优选为10g：8ml；所述改性反应的温度优选为45～55℃，更优选为50℃，时间优选为50～70min，更优选为60min。本发明中甲基丙烯酰化明胶由猪皮明胶与甲基丙烯酸酐经改性反应得到，对基质蛋白酶敏感，可以支持细胞生长以及血管生成；而且本发明中甲基丙烯酰化明胶对紫外光线敏感，能够快速交联聚合，在符合生物性要求的同时还能够满足光聚合的条件。

在本发明中，所述甲基丙烯酰化明胶的制备方法，优选包括以下步骤：

将猪皮明胶、甲基丙烯酸酐与磷酸盐缓冲溶液混合后进行改性反应，得到甲基丙烯酰化明胶。

在本发明中，所述猪皮明胶、甲基丙烯酸酐(ma)与磷酸盐缓冲溶液(pbs)混合优选是将猪皮明胶与磷酸盐缓冲溶液混合，在55～65℃条件下搅拌至完全溶解，得到猪皮明胶溶液，然后向所述猪皮明胶溶液中加入甲基丙烯酸酐；所述甲基丙烯酸酐的加入速率优选为0.4～0.6ml/min，更优选为0.5ml/min。在本发明中，所述磷酸盐缓冲溶液与猪皮明胶的用量比优选为(90～110)ml：10g，更优选为100ml：10g；所述磷酸盐缓冲溶液作为溶剂，能够保证改性反应顺利进行。

在本发明中，所述改性反应过程中，猪皮明胶的18种氨基酸中，赖氨酸包含多余的氨基，氨基能够与甲基丙烯酸酐反应生成酰胺键，从而将甲基丙烯酸酐接枝到猪皮明胶的分子链上实现猪皮明胶的改性。

完成所述改性反应后，本发明优选采用磷酸盐缓冲溶液将所得产物体系稀释使改性反应终止，然后对所得体系进行透析，得到甲基丙烯酰化明胶(gelma)溶液；将所述gelma溶液进行预冷冻处理，形成冰块，然后将所述冰块放置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，得到粉末状甲基丙烯酰化明胶(gelma粉末)，储存在-75～-85℃条件下备用。在本发明中，稀释产物体系所需磷酸盐缓冲溶液的温度优选为25～30℃，更优选为30℃；所述磷酸盐缓冲溶液的用量以将体系稀释至原体积的1.5～2.5倍为宜。在本发明中，所述透析用透析袋的截留分子量优选为10kda；所述透析的温度优选为35～45℃，更优选为40℃；透析的时间优选为7天，透析液优选每天更换一次。本发明通过透析去除未反应的甲基丙烯酸酐及其它杂质。在本发明中，所述预冷冻处理的温度优选为-45～-55℃，更优选为-50℃；预冷冻处理的时间优选为10～15h，更优选为12h；所述冷冻干燥处理的温度优选为-75～-85℃，更优选为-80℃；冷冻干燥处理的时间优选为60～84h，更优选为72h。

以所述甲基丙烯酰化明胶的质量为基准，本发明提供的生物光敏树脂的制备原料包括光引发剂0.9～8.1份，优选为1～8份。在本发明中，所述光引发剂优选包括光引发剂irgacure2959(化学名称为2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮)、光引发剂1173或光引发剂907，更优选为光引发剂irgacure2959。在本发明中，光引发剂能够吸收光子，加快自由基的形成，进而加快甲基丙烯酰化明胶光聚合反应的速度。

以所述甲基丙烯酰化明胶的质量为基准，本发明提供的生物光敏树脂的制备原料包括紫外线阻滞剂0.09～0.11份，优选为0.1份。在本发明中，所述紫外线阻滞剂优选包括hmbs紫外线阻滞剂(化学名称为2-羟基-4-甲氧基苯并苯酮-5-磺酸)、ehmc紫外线阻滞剂(化学名称为甲氧基肉桂酸乙基己酯)或hms紫外线阻滞剂(化学名称为胡莫柳酯)，更优选为hmbs紫外线阻滞剂。本发明中紫外线阻滞剂能够限制紫外光源的渗透深度，将紫外光吸收于光源照射区域，加快甲基丙烯酰化明胶光聚合反应的速度，提高预血管网络通道的精度；本发明进一步通过调整紫外线阻滞剂的含量，可以控制单次光聚合的厚度(该厚度与构建立体预血管网络通道过程中的切片层厚一致)，进而能够优化固化聚合的精度，减少台阶效应。

以所述甲基丙烯酰化明胶的质量为基准，本发明提供的生物光敏树脂的制备原料包括添加剂15～35份，更优选为20～30份。在本发明中，所述添加剂优选包括碳酸钙微粒、羟基磷灰石(hap)、二脲烷二甲基丙烯酸酯(udma)、聚醚醚酮(peek)、丝素蛋白、胶原和血管内皮生长因子中的至少一种。在本发明中，所述碳酸钙微粒的粒径优选为5～20μm；碳酸钙微粒能够加速生物光敏树脂光聚合的速度，同时可以改善聚合后所得立体预血管网络通道的强度。本发明优选根据立体预血管网络通道的应用环境选择相应的添加剂，其中，应用环境主要考虑强度和生物性两个方面，具体的，如果需要提高细胞生物相容性，可以添加丝素蛋白、胶原和血管内皮生长因子中的至少一种；如果需要提高强度及硬度，可以添加碳酸钙微粒、hap和peek中的至少一种，同时，在骨组织的环境下，需要选择与成骨细胞样细胞(mg-63)共培养效果较好的材料，为了保证立体预血管网络通道的强度接近于天然骨的强度(100～150mpa)，可以加入udma，udma自身能够构建氢键，从而产生高强度，如将hap和udma作为添加剂(udma和hap的质量比优选为1：(2.5～3.5)，更优选为1：3)，可以保证骨组织具有所需强度。

以所述甲基丙烯酰化明胶的质量为基准，本发明提供的生物光敏树脂的制备原料包括溶剂80～100份，优选为85～95份。在本发明中，所述溶剂优选包括优选水或磷酸盐缓冲溶液。在本发明中，所述水优选为去离子水。本发明优选根据材料的溶解性能选择相应的溶剂，具体的，当材料易溶于水时优选采用水作为溶剂，当材料难溶于或者不溶于水时优选采用磷酸盐缓冲溶液作为溶剂。

本发明提供了上述技术方案所述生物光敏树脂的制备方法，包括以下步骤：

将甲基丙烯酰化明胶、光引发剂、紫外线阻滞剂、添加剂和溶剂混合，得到生物光敏树脂。

在本发明中，所述甲基丙烯酰化明胶、光引发剂、紫外线阻滞剂、添加剂和溶剂混合优选是将甲基丙烯酰化明胶、添加剂和溶剂进行第一混合，在避光条件下将所得混合料液与光引发剂、紫外线阻滞剂进行第二混合。在本发明中，所述添加剂可以直接添加，也可以通过相应的反应制备得到，具体的，当添加剂含有碳酸钙微粒时，优选将甲基丙烯酰化明胶与溶剂混合，在55～65℃条件下搅拌至完全溶解，然后向体系中加入氯化钙和碳酸钠，通过氯化钙和碳酸钠反应制备得到碳酸钙微粒，这样有利于保证各组分充分混合均匀；当采用其它种类的添加剂时，优选直接添加。本发明对于所述第一混合和第二混合的具体操作条件没有特殊的限定，能够将各组分充分混合即可。

本发明提供了一种构建立体预血管网络通道的方法，包括以下步骤：

建模，得到具有中空血管通道的方形结构体模型，对所述具有中空血管通道的方形结构体模型进行分层切片；

采用掩模投影光刻法，以生物光敏树脂为原料，根据具有中空血管通道的方形结构体模型的分层切片数据，构建得到立体预血管网络通道；其中，所述生物光敏树脂为上述技术方案所述生物光敏树脂或上述技术方案所述制备方法制备得到的生物光敏树脂。

本发明首先建模，得到具有中空血管通道的方形结构体模型，对所述具有中空血管通道的方形结构体模型进行分层切片。本发明对于建模的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方法即可。本发明优选使用建模软件solidworks填充血管外方形结构体，抽空血管通道，形成具有中空血管通道的方形结构体模型，对所述具有中空血管通道的方形结构体模型进行分层切片，层厚优选为1mm。

对所述具有中空血管通道的方形结构体模型进行分层切片后，本发明采用掩模投影光刻法，以所述生物光敏树脂为原料，根据具有中空血管通道的方形结构体模型的分层切片数据，构建得到立体预血管网络通道；其中，所述生物光敏树脂为上述技术方案所述生物光敏树脂或上述技术方案所述制备方法制备得到的生物光敏树脂。在本发明中，所述掩模投影光刻法的操作参数优选包括：光源波段为320～500nm，临界暴露时间为30～60s，渗透深度为30～50μm。本发明优选采用紫外光作为光源，且临界暴露时间较短，短时间的紫外光暴露毒性较小，其较好的灭菌性也能够为细胞提供更适宜的生长环境；本发明优选采用上述渗透深度，有利于加快甲基丙烯酰化明胶光聚合反应的速度，提高预血管网络通道的精度。

在本发明中，利用掩模投影光刻法构建所述立体预血管网络通道的原理示意图具体如图1所示，包括光学子系统、控制器子系统7和执行操作子系统，其中，光学子系统包括uv紫外光源模块1(所用光源的波段为320～500nm)、动态掩模模块2、光学成像模块3和光学调整模块4，执行操作子系统包括光敏树脂容器5和平台线性执行模块6；使用时，控制器子系统7将建模软件solidworks的切片数据传输给动态掩模模块2，动态掩模模块2按照模型切片的特征投射相应的面光源(其中，光学成像模块3依据分层切片的厚度需求调节光源的强度，光学调整模块4承担uv紫外光源模块1与动态掩模模块2之间光束传递的任务)，光源照射的生物光敏树脂发生交联聚合，光源未照射区域不发生任何变化(光引发剂使光源照射处的生物光敏树脂迅速发生交联聚合，紫外线阻滞剂吸收紫外线使其不影响未照射区域，以保证生物光敏树脂按要求形状进行交联聚合)，一层交联聚合完成后，平台线性执行模块6下移一个高度(即切片层厚)，光敏树脂容器5中刮板自动刮平液面，成型下一层，逐层叠加，直至完成，得到立体预血管网络通道的结构体。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

(1)将10g猪皮明胶与磷酸盐缓冲溶液(pbs)混合，在60℃条件下搅拌至完全溶解，得到猪皮明胶溶液，猪皮明胶的浓度为0.1g/ml；向所得猪皮明胶溶液中以0.5ml/min的速率加入甲基丙烯酸酐(ma)，使所得混合料液中ma的体积浓度为8％，然后在50℃条件下搅拌反应1h；反应完成后，采用温度为30℃的pbs将所得体系稀释至原体积的2倍使反应终止，然后用截留分子量为10kda的透析袋在40℃条件下透析7天，透析液每天更换一次，以除去未反应的ma及其它杂质，得到甲基丙烯酰化明胶(gelma)溶液；将所述gelma溶液在-50℃条件下进行预冷冻处理12h，形成冰块，将所述冰块置于冷冻干燥机中，在-80℃条件下进行冷冻干燥处理72h，得到gelma粉末，储存在-80℃条件下备用；

将所述gelma粉末与pbs混合，在60℃条件下搅拌至完全溶解，得到gelma料液，gelma的浓度为0.15g/ml；将氯化钙和碳酸钠加入到所述gelma料液中，控制氯化钙和碳酸钠的浓度均为0.1g/ml，然后在60℃条件下搅拌反应24h，直至碳酸钙沉淀完全，得到混合分散液(含有gelma和碳酸钙微粒，所述碳酸钙微粒的粒径为5～20μm)；

将所述混合分散液与光引发剂irgacure2959、hmbs紫外线阻滞剂混合，在避光环境下充分搅拌混合均匀，得到生物光敏树脂；其中，光引发剂在所述生物光敏树脂中的浓度为0.01g/ml，hmbs紫外线阻滞剂在所述生物光敏树脂中的浓度为0.001g/ml；

(2)使用建模软件solidworks填充血管外方形结构体，抽空血管通道，形成具有中空血管通道的方形结构体模型，对所述具有中空血管通道的方形结构体模型进行分层切片，层厚为1mm；

(3)将步骤(1)中生物光敏树脂置于掩模投影光刻系统的光敏树脂容器5中，将步骤(2)中建模软件solidworks的切片数据传输给控制器子系统7，控制器子系统7将建模软件solidworks的切片数据传输给动态掩模模块2，动态掩模模块2按照模型切片的特征投射相应的面光源(其中，光学成像模块3依据分层切片的厚度需求调节光源的强度，光学调整模块4承担uv紫外光源模块1与动态掩模模块2之间光束传递的任务)，光源照射的生物光敏树脂发生交联聚合，光源未照射区域不发生任何变化(光引发剂irgacure2959使光源照射处的生物光敏树脂迅速发生交联聚合，hmbs紫外线阻滞剂吸收紫外线使其不影响未照射区域，以保证生物光敏树脂按要求形状进行交联聚合)，一层交联聚合完成后，平台线性执行模块6下移一个高度(即切片层厚)，光敏树脂容器5中刮板自动刮平液面，成型下一层，逐层叠加，直至完成，得到立体预血管网络通道的结构体；其中，光源波段选择320～500nm，临界暴露(ec)时间为30s，渗透深度为50μm；

(4)将步骤(3)构建的立体预血管网络通道的结构体从光敏树脂容器5中取出，在去离子水中浸泡30min后，冲洗外表面黏附的树脂，用去离子水循环灌注其内部网络通道8次，冲洗内部残留的树脂，得到立体预血管网络通道。

对所述立体预血管网络通道进行压缩测试，结果显示，压缩强度达到1.3mpa，杨氏模量达到2mpa。

实施例2

(1)按照实施例1的的方法制备得到gelma粉末，将所述gelma粉末与去离子水混合，在60℃条件下搅拌至完全溶解，得到gelma料液，gelma的浓度为0.15g/ml；将二脲烷二甲基丙烯酸酯(udma)和羟基磷灰石(hap)加入到所述gelma料液中，控制udma和hap的浓度分别为0.1g/ml和0.3g/ml，然后在60℃条件下震荡、搅拌，直至完全溶解，得到混合分散液；

将所述混合分散液与光引发剂irgacure2959、hmbs紫外线阻滞剂混合，在避光环境下充分搅拌混合均匀，得到生物光敏树脂；其中，光引发剂在所述生物光敏树脂中的浓度为0.08g/ml，hmbs紫外线阻滞剂在所述生物光敏树脂中的浓度为0.001g/ml；

(2)按照实施例1的的方法使用建模软件solidworks建模，并对所得具有中空血管通道的方形结构体模型进行分层切片；

(3)将步骤(1)中生物光敏树脂置于掩模投影光刻系统的光敏树脂容器5中，将步骤(2)中建模软件solidworks的切片数据传输给控制器子系统7，然后按照实施例1的方法得到立体预血管网络通道的结构体；其中，光源波段选择320～500nm，临界暴露(ec)时间为60s，渗透深度30μm；

(4)按照实施例1的的方法对步骤(3)构建的立体预血管网络通道的结构体进行后处理，得到立体预血管网络通道。

对所述立体预血管网络通道进行压缩测试，结果显示，压缩强度达到2mpa，杨氏模量达到3.5mpa。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。