显微镜的制作方法
本申请是申请日为2015年9月18日、申请号为201580060936.6、发明名称为“显微镜”的发明专利申请的分案申请。
本发明涉及显微镜，具体地，涉及用于生物学物质(包括细胞和微生物)的三维层析成像的显微镜。本发明还可以更一般性地用于非生物学透明材料的三维层析成像的领域。
背景技术：
能够对生物学细胞及其内部结构进行三维成像的显微镜一般基于数字层析成像技术，并且往往基于标记染料的使用，以增强细胞的成分之间的强度对比度。但是，标记染料可能影响所要观察的物质(尤其是在活细胞的情况下)，而且也会致使过程更加复杂。在国际专利申请pct/ib2011/051306中描述了基于3d折射率计算的无标记非侵入式显微镜检查方法。但是，对非常小的对象计算具有内部结构的足够细节的基于折射率的图像所需的图像数据的捕获需要非常精确的显微镜。常规显微镜的精确度依赖于透镜的质量以及在显微镜的各种部件的组装中的非常低的制造公差。这导致显微镜成本高昂。此外，为了具有高数值孔径以增加捕获数据的分辨率，针对所要观察的样本的可用工作距离和空间是非常有限的。这使得制备样品或样本以通过显微镜进行查看变得复杂，并且限制了可以被观察的样本的类型以及可以呈现样本的形式。
技术实现要素：
本发明的一个目的在于提供一种实施和使用起来容易并且经济的显微镜。
提供一种准确并给出高分辨率还生产起来经济的显微镜将是有利的。
提供一种简化所要观察的生物学样本的制备的显微镜是有利的。
提供一种可以与各种标准或者常见形式的生物学样本容器(包括用于活细胞的培养皿)一起使用的显微镜是有利的。
提供一种简化所要观察的生物学样本的制备的显微镜是有利的。
提供一种可靠的显微镜是有利的。
提供一种多用途的显微镜是有利的。
文中公开了一种显微镜，其包括：产生至少部分准直的光束的光源；包括被配置为将光束分成参考波束和样本照明波束的分束器的光束引导系统；被配置为接纳所要观察的样本的样本观察区；被配置为在样本照明波束通过样本观察区之后使参考波束和样本照明波束重新聚合的波束重聚器；以及被配置为捕获波束重聚器的下游的光束的至少相位和强度值的光感测系统。在实施例中，光源可以被配置为生成相干或部分相干准直光束，具体地，激光束，例如，二极管激光束。在一种变型中，光源可以生成非相干光，例如，白光，其例如借助于光学透镜得到准直。
根据本发明的第一方面，光束引导系统包括指引参考波束和样本照明波束沿着其相应的光路的方向改变反射镜，其中，方向改变反射镜中的至少一个是可由显微镜的电子控制系统控制的可枢转操作的反射镜。该控制系统被配置为生成反射镜角度控制信号，以自动控制所述至少一个可枢转操作方向改变反射镜的角度，该反射镜角度控制信号至少部分地基于由光感测系统借助于该控制系统的反馈环接收到的光束的信号。
在一个实施例中，控制信号可以基于由光感测系统测得的光束的相位和强度值两者。
有利地，显微镜可以容易地在制造或运输之后以规律的间隔或者在每次使用之前，通过对在样本照明波束路径和/或在参考波束路径中的方向改变反射镜中的一个或多个的角度进行电子控制来进行校准。
根据本发明的第二方面，该样本照明装置包括：反射镜系统，被配置为指引样本照明波束相对于光轴处于非零照明角度(非正视照明)；以及旋转波束机构，被配置为使成一定角度的样本照明波束围绕光轴旋转至少360°(2π弧度)。
根据本发明的旋转具有预定照明角度的样本照明波束与常规解决方案相比尤其是有利的，因为它允许在相比于基于透镜的解决方案具有低成本的布置中以大的照明角度照明微小对象，其中该照明角度主要由显微镜物镜的数值孔径限定。实际上，与透镜或者折射或衍射元件形成对照的是，旋转波束不改变波束形状，因而，与本发明所提供的解决方案形成对照的是，透镜或者折射或衍射元件需要以极高的质量进行制造以减少波束整形，从而增加了生产成本。此外，旋转波束允许对于样本的大的工作空间，因而提供了可以位于样本保持器上并由显微镜查看的样本的在大小方面的通用性，同时显著减少显微镜的制造成本以及对沿光路的光学元件的质量的敏感性。
根据本申请的第三方面，显微镜进一步包括被配置为调整参考波束的相对于样本照明波束的光程长度的光程差(opd)调整装置，opd调整装置包括第一光偏离元件和第二光偏离元件，它们每个都安装在枢转支座上，该枢转支座被配置为变化第一光偏离元件相对于第二光偏离元件的角度，由此光偏离元件的倾斜角度至少影响光程差。
因而，可以实现对光程差的连续、准确的调整。此外，如有需要，可以进行动态调整。
在一个实施例中，样本照明装置的反射镜系统安装在旋转支座上，并且旋转波束机构由旋转支座和用于旋转该支座的马达驱动装置形成。
在一个实施例中，旋转波束机构包括旋转可倾斜操作反射镜，从而将样本照明波束指引到样本照明装置的反射镜系统上，其中反射镜系统安装在固定支座上。
在一个有利实施例中，可枢转操作的反射镜是微机电(mems)类型部件。
在一个有利实施例中，可枢转操作的反射镜基本上位于样本之上，与显微镜物镜的光轴对齐。
在一个有利实施例中，方向改变反射镜至少包括布置在分束器的下游的样本照明波束的光路中的第一方向改变反射镜和第二方向改变反射镜，两反射镜均可枢转的操作，从而对光程误差进行校正，或者改变样本照明角度。
在一个有利实施例中，显微镜还包括被配置为接收来自光感测系统的多个图像帧数据的数据处理系统，所述多个图像帧是针对样本照明波束围绕显微镜物镜光轴的至少360°旋转生成的。
在一个有利实施例中，由光感测系统和数据处理系统每360°捕获的帧的数量大于10，优选地大于20，更优选地大于30。
在一个有利实施例中，图像帧数据通过数据处理系统进行重构，或者由数据处理系统供应给外部计算系统，以处理成微小对象的三维图像。
在有利实施例中，显微镜被配置为通过确定样本照明波束在穿过微小对象之后的相位偏移而基于该微小对象的折射率分布生成该微小对象的三维图像。
本文还公开了一种控制显微镜的方法，该显微镜包括：产生光束的光源；包括分束器的光束引导系统，其中分束器被配置为将光束分成穿过光束引导系统的参考波束和样本照明波束，至少一个是可枢转操作的方向改变反射镜(tm1、tm2、tm3、tm4)指引参考波束和样本照明波束，从而引导参考波束和样本波束沿着其相应的光路；被配置为在样本照明波束的路径中接纳所要观察的样本的样本观察区；被配置为在样本照明波束穿过样本观察区之后使参考波束和样本照明波束重新聚合的波束重聚器；被配置为取得波束重聚器的下游的光束的至少相位和强度值的光感测系统；以及电子控制系统，所述方法的特征在于：
-通过控制系统中的反馈环接收来自光感测系统的由光束生成的信号，
-在控制系统中生成反射镜角度控制信号，该反射镜角度控制信号至少部分地基于从光感测系统接收的所述信号；以及
-将反射镜角度控制信号传送至所述至少一个可枢转操作方向改变反射镜，以控制可枢转操作方向改变反射镜的角度。
在一个实施例中，该方法包括相对于样本旋转样本波束。
在一个实施例中，所生成的反射镜角度控制信号是动态的。
在一个实施例中，反射镜角度控制信号是依据样本波束相对于样本的旋转角度动态生成的。
在一个实施例中，所生成的反射镜角度控制信号是静态的。
在一个实施例中，反射镜角度控制信号所基于的、从光感测系统接收并且由光束生成的信号包括通过光感测系统接收的光束的强度、相干性、干涉条纹(fringe)频率和相位中的任何一个或多个。
在一个实施例中，该方法还包括在显微镜的数据处理系统中接收来自光感测系统的多个图像帧数据，所述多个图像帧是针对样本照明波束围绕显微镜物镜光轴的至少360°旋转生成的。
在一个实施例中，由光感测系统和数据处理系统每360°捕获的帧的数量大于10。
在一个实施例中，图像帧数据通过数据处理系统进行重构，或者由数据处理系统供应给计算系统，以处理成微小对象的三维图像。
在一个实施例中，图像帧数据被数据处理系统进一步利用，或者由数据处理系统供应给计算系统，用于估算样本的光学特性，以改善微小对象的三维图像。
在一个实施例中，该方法还包括通过确定样本照明波束在穿过微小对象之后的相位偏移而基于该微小对象的各个截面的折射率生成该微小部分的三维图像。
本文还公开了一种控制显微镜的方法，该方法的特征在于通过显微镜的控制系统动态调整参考波束的光程长度(opl)，从而使参考波束和样本波束之间的光程差(opd)保持低于光源的相干长度，该方法包括下述步骤：
a)将旋转波束系统定位于第一位置上，
b)将被配置为指引参考波束的所述至少一个可枢转操作方向改变反射镜(tm3，tm4)定位于第一位置，
c)在样本波束被关掉时，测量通过光感测系统捕获的参考波束信号的位置，
d)打开样本波束，并测量通过光感测系统捕获的信号的干涉条纹对比度，
e)使所述至少一个可枢转操作方向改变反射镜(tm3，tm4)的位置改变一个增量，
f)重复步骤c)到e)直到增量之和对应于可枢转操作方向改变反射镜(tm3，tm4)的预定义工作范围，
g)比较针对每个增量获得的干涉条纹对比度测量结果，并将可枢转操作方向改变反射镜(tm3，tm4)的针对具有最高值的干涉条纹对比度测量结果的位置连同旋转波束系统的位置存储到控制系统的存储器的查找表格(lut)中；
h)使旋转波束系统旋转一个小的增量，并重复步骤b)到g)直到旋转波束系统完成了360°旋转。
附图说明
本发明的其他目的和有利特征将从权利要求、详细说明和附图中变得清楚，其中：
图1a是根据本发明的实施例的去除了一部分外壳的显微镜的透视图；
图1b是贯穿图1a的显微镜的横截面视图；
图1c是基于马赫-曾德(mach-zehnder)方案的、根据本发明的实施例的显微镜的配置的简化示意图；
图1d是根据本发明的另一实施例的显微镜的横截面视图；
图1e是图1d的显微镜的横截面透视图；
图2a是根据本发明的实施例的显微镜的配置的简化示意图；
图2b是与图2a类似的示意图，其例示了诸如制造公差、磨损、振动或受热的各种缺陷对光路的影响；
图2c和2d是显微镜的一部分的配置的示意图，例示了在显微镜的旋转扫描臂的一个循环(revolution)期间机械缺陷在光程长度上的影响，其中图2c示出没有缺陷的扫描头，图2c示出具有机械缺陷(错位)的扫描头；
图3a和3b是在根据本发明的显微镜的样本保持器上根据第一和第二变型的样本的局部视图；
图4a是根据本发明的一个实施例的显微镜的基于透射原理的光程差(opd)调整装置的视图；
图4b是图4a的光路装置的简化示意图，其例示了opd走离校正，图4c是与图4b变型类似的视图，其例示了opd补偿；
图4d是opd装置的透明(例如，玻璃)厚板的详细示意性视图，其示出在详细描述中讨论的各种角度和尺寸；
图4e是示出了光程长度变化与图4a的opd装置的透明厚板的取向角度的关系的曲线图；
图4f到4h是根据本发明的实施例的透射型opd装置的示意例示，其示出了理想同步(图4f)、非理想同步(图4g)以及借助于可倾斜反射镜对非理想同步的校正(图4h)；
图4i是例示了用于调整图4a的opd装置的控制过程中的步骤的简图。
图5a是根据本发明的实施例的包括基于反射原理的opd装置的显微镜的配置的简化示意图；
图5b、图5c和图5d是图5a的实施例的opd装置的变型的简化示意图；
图5e是例示了用于调整图5a的opd装置的控制过程中的步骤的简图；
图5f是例示了用于动态调整图5a的opd装置的控制过程中的步骤的简图；
图5g是例示了依据扫描头位置的opd系统的光程长度(opl)差的图，其允许确定最优位置；
图6a和6b是例示了所要观察的样本的倾斜照明的简化示意性视图，图6a例示了在其中浸入样本的液体的高度(δh)的变化的影响，图6b例示了照明角度(α)的变化的影响；
图6c是例示了所要捕获的样本的倾斜照明的简化示意性视图，该倾斜照明具有校正在其中浸入样本的液体的高度的变化的影响的手段；
图7a、图7b、图7c和图7d是以根据本发明的显微镜的不同变型为根据的相对于样本旋转照明波束系统的简化示意性例示；
图8是根据本发明的实施例的用于显微镜中使用的具有可调整倾斜角度的基于mems的反射镜的简化透视图；
图9是例示根据本发明的实施例的显微镜的校准过程(p1)的步骤的流程图，其中，对样本照明波束路径中的可倾斜反射镜的角度进行调整；
图10a和图10b是例示根据本发明的实施例的用于显微镜的基于样本的自动相位校正的反馈环控制过程(p2)的步骤的流程图；
图11是例示根据本发明的实施例的显微镜的校准过程(p5)的步骤的流程图，其中，对参考波束路径和样本照明波束路径中的可倾斜反射镜的角度进行调整；
图12是例示根据本发明的实施例的显微镜的质量评估过程(p6)的步骤的流程图，其中，对参考波束路径中的可倾斜反射镜的角度进行调整；
图13是例示根据本发明的实施例的显微镜的误差分析过程(p7)的步骤的流程图；
图14a是根据本发明的实施例的通过显微镜的光感测系统捕获的全息图的强度图案的傅里叶变换的示意性例示；
图14b是根据本发明的实施例的显微镜的可倾斜反射镜的不同层级的反馈控制的示意性例示；
图15a是根据本发明的实施例的通过显微镜的光感测系统捕获的不同阶的像差的例示图，所述像差用于通过光感测系统接收的波束的幅度和相位分析；
图15b和15c是根据本发明的实施例的通过显微镜的光感测系统捕获的不同阶的像差所生成的信号的图形表示；
图16a是处于具有两种不同折射率n1、n2的物质之间的界面处的样本照明波束的几何角度和长度的例示，其用于例示浸没在具有高度h的液体中的样本；
图16b是测得的波束信号的强度和散焦角度(δα)之间的关系的例示；
图16c是用以确定相位校正(φ)的样本照明波束的散焦角度(δα)与样本液体的高度之间的关系的例示；
图16d是样本照明波束相对显微镜物镜的视场(fov)的依赖于样本厚度的走离的例示；
图17a是样本照明波束路径的用于例示角度和尺寸的示意图，图17b是变化角度和尺寸的结果的表格，用于例示制造公差、振动或热效应对补偿公差所需要的样本照明波束路径中的一个或多个可倾斜反射镜的角度的影响。
图18是例示根据本发明的实施例的显微镜的操作中的各种过程p1到p7的全面实施的流程图。
具体实施方式
参考附图，具体从图1a开始到图2b，显微镜2的示例性实施例包括光源4(具体地，相干光源，诸如，激光束装置)、光束引导系统6、光感测系统8、(具体用于处理所生成的图像数据的)数据处理系统10、电子控制系统15以及一般收容和支撑显微镜2的各种部件的外壳和支座结构12。
显微镜2能够对包括活细胞在内的生物学细胞和微生物进行三维成像。可以通过使用国际专利申请pct/ib2011/051306中描述的技术来生成细胞和其他的生物学微细物质样本的图像，该专利申请通过引用并入本文。
外壳和支座结构12包括样本观察区，样本观察区包括被配置为保持具有各种标准和非标准形式的生物学样本的样本保持器18。样本保持器具有位置调整机构，该位置调整机构允许三维地移动样本的位置，具体地允许高度调整以及样本照明光束所横越的平面中的调整。显微镜的位置调整机构本身是公知的，其允许相对于在样本之下(透射)或者之上(反射)的显微镜物镜位置来调整所要观察的样本的位置。
在一种变型(未示出)中，样本观察区可以具有导管，导管具有延伸通过样本照明波束所横越的区的透明截面，样本观察区被配置为观察在封闭导管中的由液体流动供应到照明波束路径的样品材料。
参考图3a和3b，可以在封闭容纳系统3a中或者在开口皿(opendish)3b(诸如陪替氏培养皿)中提供生物学样本。例如，可以根据以下非限制性示例来提供生物学样本。作为对任何类型的样本的一般性要求，缓冲介质5不应散射入射光。例如，可以使用诸如磷酸盐缓冲盐水(pbs)或者4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)的透明液体。为了保持细胞存活3到4小时，具有pbs(具有例如葡萄糖)(例如，25mmol)和hepes(例如，10mmol))的样本工作良好。对于静态实验而言，使用多聚甲醛(pfa)固定的细胞可供使用几个星期。可以通过通常为170微米厚的盖玻片进行观察(大部分显微镜物镜针对这样的盖玻片进行了优化)，并且由于这种物镜的有限工作距离的原因，细胞应当被固定在优选距离细胞没有远超过30微米的盖玻片上。光学表面应当尽可能洁净，并且细胞保持器应当被仔细清理，根据经验至少两次，使得尽可能少的死细胞或者任何种类的残留物漂浮在固定介质(mountingmedium)中。在图3a的示例中，缓冲介质5被密封在腔室中，以避免液体干燥或渗漏。例如，以胶带隔离件(例如，来自于gracebio-labsss1x9-securesealimaging，其内径为9mm，厚度为0.12mm)的形式的密封件7被安装在盖玻片9和基座11之间。
对于在具有透明基座的标准陪替氏培养皿3b中提供的活细胞而言，可以通过将陪替氏培养皿的基座定位成挨着显微镜物镜37或者非常靠近显微镜物镜37而直接观察细胞。只要培养皿的底部表面被覆盖，其中细胞被定位成挨着该底部表面，并且该底部表面形成了观察平面13，那么液体的量就不重要。
细胞的汇合(confluency)优选大于20％，以确保容易对细胞定位，以供观察。
在示例性实施例中，相干光源4可以是激光束发生器，例如，其类型为处于520纳米波长的二极管激光束。也可以使用具有其他波长的激光束，需要注意的是波长越短，可能的分辨率就越高。
具体地，光感测系统8可以是具有图像传感器的照相机，其中图像传感器被配置为读取穿过样本后被接收到的光束，并将检测到的光信号传送至数据处理系统10。照相机可以是具有ccd、cmos或者其他类型的光传感器的已知类型的照相机，其中光传感器能够拾取所接收到的光束的波长、相位和强度，并将该信息传送至数据处理系统10。
光束引导系统6被配置为将相干光束划分成两个波束，即，参考波束7a和样本照明波束7b，它们遵循不同路径，分别为参考波束光路22和样本波束光路20。光束引导系统包括分束器14，其接收来自相干光源4的相关波束7，并将其分成两个波束7a、7b。分束器本身是公知器件，无需在这里对其做进一步解释。
在样本照明波束7b穿过了样本1之后，并且在被光感测系统8捕获之前，样本照明波束7b和参考波束7a通过波束重聚器16得以重新聚合。可以与分束器具有相同的构造但是按照相反的模式工作的波束重聚器本身也是公知的，无需在这里对其做进一步描述。将相干光束7分成沿着两条路径(其中一条穿过样本)允许测量样本照明波束7b相对于参考波束7a的相移，该相移依赖于样本物质的被样本照明波束7b穿过的截面的折射率。
参考波束光路系统22包括用以将参考波束7a重定向并引导成沿着其路径的方向改变反射镜30，以及光程差(opd)调整装置32。
参考图4a到图4c，根据所示实施例的opd调整装置32是基于透射原理的，并且包括安装在枢转支座46上的第一光偏离元件42和安装在第二枢转支座48上的第二光偏离元件44。光偏离元件42、44由折射率大于空气的透明材料(例如，玻璃厚板)制成，被配置为使穿过它的参考光束按照某种方式发生弯曲，从而允许对参考波束的光程长度进行调整。该透明材料可以由玻璃或聚合物或者其他透明固体制成，并且可以仅仅具有平板或厚片的形状，或者可以具有弯曲的或者非平行的外表面。枢转支座46、48包括枢转轴p1、p2，并且可以通过互啮齿50机械耦合到一起，从而使得枢转支座同时并按照相反的角方向w1、w2旋转。因而，安装在枢转支座上的光偏离元件42、44同时并以相反的角方向枢转，以调整波束7a的光程的长度。第一和第二光偏离元件42、44之间的角度ω越大，参考波束7a的光程越长。有利地，枢转支座46、48可以是使用mems制造技术由半导电衬底制出的微机械加工零件，枢转支座的旋转受到在半导体的一部分中流动的感应电流的控制。
在有利的实施例中，光偏离元件48中的至少一个可以被可旋转地安装到其枢转支座上，从而相对于另一个光偏离元件具有角度ω1的附加独立旋转，该光偏离元件48中的至少一个被配置为允许对由于错位、制造公差等造成的光路错位(走离)进行调整。
在可替代的实施例中，第一枢转支座和第二枢转支座可以被独立控制，并且没有被直接机械耦合，从而允许光程长度和光路走离两者的调整。
在一种变型中，如图4c中示意性例示的，参考波束路径系统20的方向改变反射镜30中的至少一些是可枢转的或者是倾斜可调整的，以调整光程长度和/或光路错位(走离)。
参考图4d和4e，进一步描述根据上述实施例的opd补偿系统的原理。已知，可以使用玻璃厚板将波束横向偏移，并附带地增加光程长度。但是，该横向偏移可以有利地通过使用两个玻璃厚板而受到补偿，其中，将一个玻璃厚板顺时针旋转，并将另一个玻璃厚板逆时针旋转，从而在使opd两倍大的同时使横向偏移受到补偿。
参考图4d到图4f，横向偏移(c′d)和opd(即，opd＝(bc′-bc))可以被如下表示：
为了补偿波束的横向偏移，使另一玻璃厚板以相反角度倾斜：偏移受到补偿，并且同时opd被加倍，如图4f所例示的。图4f示出了对于每个10mm厚，具有ri1.5并且可倾斜0°到60°的两个厚板的根据以上计算的opd补偿结果。
根据该实施例的opd调整装置可以被实施到显微镜中，以使光路适应于两个反射镜30之间的样本厚度，如图4g所示。由于命令误差、玻璃厚板厚度e的差异或者仅仅是支撑结构12中的部件的组装中的宽松公差的原因，出射的参考波束7a将被横向偏移，如图4h所示。对于透镜和照相机之间的300mm的距离以及对于该透镜的20mm的焦距而言，如果容许传感器上的视场的十分之一的可能偏移，例如，大约500μm的偏移，则这意味着第二反射镜上大约40μm的最大可容许横向偏移。如果我们容许这样的最大横向偏移，则两个厚板42、44应当以具有最大差异为0.25°的角度倾斜，或者厚板的厚度的差异不应超过100μm。为了避免对玻璃厚板的机械驱动或尺寸施加严苛的公差，用由控制系统15的微控制器所控制的可倾斜反射镜tm3、tm4替换反射镜30是有利的，参考图4i。
可以参考图4i和4h对整个opd补偿装置的命令过程进行如下描述。
-样本1被放置在样本观察区17中，并准备好接受探查；
-玻璃厚板42、44被放置在中立位置(在图4h中，θ＝90°)。
-控制可倾斜反射镜tm3、tm4(例如，mems反射镜)，以最佳地均匀传感器上的强度。为了易于搜索，可以将样本照明波束7b从显微镜物镜37的孔径中偏转出来。
-根据在傅里叶域中与dc分量能量相比的载波峰值能量的计算来评价干涉条纹对比度。
-opd扫描开始于使玻璃厚板42、44沿某个方向倾斜某个小角度。
-对于角度的每个增量(厚板可以通过具有恰当的齿轮减速比(gearreductionratio)的步进马达来驱动)，通过pid算法使激光光点保持在光传感器上居中。
-适当地重定向样本照明波束7b，并且评估干涉条纹对比度；
-一旦完成扫描，厚板42、44被适当地取向成得到最高干涉条纹对比度的位置。
-可倾斜反射镜tm3、tm4的位置被细调。
-显微镜准备好对样本1进行最优测量。
在一种变型中，为了加快以上描述的迭代搜索，从过程p1获得的光学厚度(用在过程p2中)可以被用于定义厚板角度的接近期望的最优位置的起始点：得到最高干涉条纹对比度的结果的厚板倾斜角度直接依赖于过程p1中估算出的样本的光学厚度。
参考图5a到图5d，根据所例示的实施例的opd调整装置32是基于反射原理，并且包括第一方向改变反射镜30a、第二方向改变反射镜30b和第三方向改变反射镜30c。第一和第三方向改变反射镜30a、30c中的至少一个是可倾斜的，而沿参考波束的光路位于第一和第三反射镜之间的第二方向改变反射镜30b则是可平移的。第二反射镜30b的平移改变光程的长度，旋转可倾斜的第一和第三反射镜30a、30c，以校正依据第二反射镜30b的位移的参考波束的方向。
在图5b的变型中，第二反射镜安装在支座(未示出)上，该支座被配置为沿着偏斜于与第二反射镜反射平面正交的方向的方向来移动第二反射镜(又称为角平分线位移)，其中第一和第三反射镜30a、30b都是可倾斜的，从而针对参考光束的角度上的变化进行调整。在图5c的变型中，第二反射镜安装到支座(未示出)上，该支座被配置为与第二反射镜反射平面正交地移动第二反射镜，其中第一和第三反射镜30a、30b都是可倾斜的，从而针对参考光束的角度上的变化进行调整。在图5d的变型中，第二反射镜安装在支座(未示出)上，该支座被配置为沿平行于被反射出第二反射镜的参考波束的方向移动第二反射镜(又称为内切圆位移)，其中第一反射镜30a是可倾斜的，以针对参考光束的角度上的变化进行调整，并且第二和/或第三反射镜是任选可倾斜的。
与透射型opd实施例相比，反射型opd实施例的优点在于使得光学表面的误差引起的影响(诸如强度变化或像散)最小化，以及使用在mems倾斜反射镜运动中可容易地获得的自由度。过程p4基本上与过程p3等同，只是利用反射镜平移替换了厚板旋转。
主要参考图1a到2b，样本波束光路系统20还包括方向改变反射镜26，以引导样本照明波束沿着其选定的路径。样本波束光路系统还包括样本照明装置28，该装置包括反射镜系统34和旋转机构36。反射镜系统34包括被配置为将样本照明波束7b以相对于显微镜物镜37的轴a的预定角度α朝样本1指引的第一反射镜54和第二反射镜56。
在实施例中，旋转机构36包括马达驱动装置38和旋转支座40，反射镜系统34被安装在旋转支座40中。在本示例性实施例中，驱动装置38经由包括皮带39的传动设备耦接至旋转支座，但是可以使用很多其他传动设备系统(例如，齿轮系统)将驱动设备耦接至旋转支座，或者通过磁感应耦接。
旋转支座40包括中空的或者管状的轴58，轴58被配置为允许样本照明光束从其穿过，旋转支座40还包括在其中安装第一和第二反射镜54、56的反射镜支座体60。旋转支座，具体地，中空轴58，经由轴承59被安装至外壳支撑结构12。
第一反射镜54将被投射通过中空轴的光束重定向到第二反射镜56上，第二反射镜以照明角度α将该光束重定向到位于样本保持器18上的样本1上。第一和第二反射镜可以以固定关系布置在反射镜支座体60内。在其他变型中，第一反射镜或者第二反射镜或者两者可以是可枢转调整的。可枢转调整的第一和/或第二反射镜可用于将照明角度调整到选定的照明角度，和/或针对由于制造公差造成的或者由于运输和操作期间或使用中的失调造成的错位进行调整。也可以通过调整样本波束光路系统20的方向改变反射镜26a、26b的角度来调整照明角度。角度可调整的反射镜26a、26b可以是如图8所例示的具有由半导体材料形成的以mems加工反射镜的形式的微机械加工零件(如本领域中本身已知的)，以形成具有可电调整的倾斜角度的反射镜。因而，角度可电调整的反射镜允许对制造公差进行补偿，从而校准该装置，并且允许根据需要将照明角度动态地或者静态地调整至选定值。因而，有可能在制造之后并且每次使用之前对显微镜进行自动校准，以校正使波束7b′偏离选定路径7b的任何错位、制造公差、热效应和磨损，如图2b中最佳地例示的。
样本照明路径系统中的角度可调整反射镜还可以有利地实现对样本的折射特性的静态或动态调整。例如，可以对在其内浸入样本的液体的高度增量h的改变(参考图5a到5c)进行校正。随着光束围绕显微镜物镜光轴a旋转通过360°，可以应用动态校正，从而对在其中浸入样本的液体介质的相对于光束的路径的不均匀的厚度进行补偿。这种不均匀厚度可以是由于样本容器的非水平安装造成的，或者可以是由于表面张力造成的液体的弯液面的存在造成的。
用于在来自光感测系统8的反馈信号的基础上自动控制反射镜26a、26b的倾斜角的闭环调节系统可以被结合到显微镜的控制系统15的电子控制电路中。电子控制电路还可以控制旋转波束机构36和光源4。
在图1b中例示的实施例中，旋转支座允许在图像捕获期间使样本照明波束在保持固定的照明角度α的同时旋转360°。在旋转反射镜系统34期间，可以通过照相机捕获选定数量的图像帧，例如，在20个至200个的范围内的图像帧，例如，大约100个图像帧，每个图像帧表示正被观察的微小对象的不同视角。每帧表示一个二维图像截面，该二维图像截面表示正被观察的样本的平面截面中的折射率分布。可以编译该二维部分，从而重构出所观察的微小对象的三维的基于折射率的图像。如图1b例示的实施例所关心的，依赖于旋转支座40的旋转速度的波束旋转速度可以依据光感测系统8的帧捕获频率而调整。
根据本发明的具有预定照明角度α的旋转的样本照明波束相对于基于透镜的常规解决方案尤其有利，因为它允许以显微镜物镜37的数值孔径(na)所允许的尽量大的大照明角度α来照明微小对象。这在可以位于样本保持器上并被显微镜查看的样本的大小方面提供了大得多的灵活性，同时显著减少了显微镜的制造成本和对沿着光路的光学元件的质量的敏感性。此外，旋转反射镜系统不改变波束形状，这与透镜或者折射或衍射元件形成了对照，透镜或者折射或衍射元件因而需要以极高的质量来制造以减少波束整形。后者显著增加了生产成本，与本发明提供的解决方案形成了对照。在本发明中，可以改变照明角度α，如果反射镜以固定的关系在旋转支座40中，则通过替换旋转支座40来改变照明角度α，或者通过在旋转支座中具有可旋转的第一反射镜54和/或第二反射镜56来改变照明角度α，由此照明角度的极限由显微镜透镜的数值孔径确定。例如，对于0.8的数值孔径而言，照明角度可以为55°，以及利用数值孔径1.3，照明角度可以高达64°。该角度越高，灵敏度就越大，因而二维相位图像以及因而由二维相位图像重构的三维相位图像的分辨率就越大。
样本照明波束的光路中的倾斜可调整反射镜尤其有利，因为它们允许针对装置寿命期间的错位、制造公差、磨损进行调整，还允许针对各种变化，诸如在其中浸入所要观察的物质的液体的高度的变化，进行静态或者动态的校正。
本发明的另一个尤其有利的特征是光程差(opd)调整装置32，其具有倾斜可调整的透射或反射光偏离元件42、44、30a、30b、30c，这些元件允许对光程差进行自动且连续的校准或调整，并且还允许在不必改变这些元件的情况下对opd走离进行校正。在常规装置中，依据光路的调整，具有不同厚度的一系列的透明圆片位于参考波束路径中，然而，这不允许连续且精细的调整，也不允许对opd走离进行校正。
参考图7a到图7c，首先从图7a开始，在第一变型中，旋转波束机构36包括具有第一反射镜54和第二反射镜56的反射镜系统34，旋转波束机构36安装在支座40中，支座40可旋转地安装在外壳支座12上，并且围绕显微镜物镜光轴a旋转通过360°，以执行对样本1的图像捕获。第二方向改变反射镜26b根据一种变型可以是可调整的，或者可以是固定的，其中，在可调整的变型中，可以变化波束的照明的角度α，以改变照明角度，或者保持固定的照明角并且对任何错位或失调进行校正。在图7b的第二变型中，样本照明装置的反射镜系统34是固定的，第一反射镜54基本上具有中央锥(centralcone)的形式，其将波束7b重定向至第二反射镜56，也基本上形成了外锥形环(outerconicalring)。通过样本波束光路系统20的第二方向改变反射镜26b执行波束旋转，该反射镜执行连续地倾斜的圆形的移动，以围绕第一反射镜54所形成的锥来旋转照明波束，使得照明波束围绕显微镜物镜光轴a旋转360°。这种解决方案的优点在于有限的机械零件，但是与图7a中例示的机械解决方案相比，这种解决方案对锥形反射镜表面的曲率的准确性的敏感性更大。
图7c还例示了具有固定支座40的系统，其中，旋转的照明波束通过中心可倾斜反射镜54′致动，该反射镜54′执行360°范围的圆形的倾斜的移动，并且将该波束朝向上方第一反射镜56a反射，第一反射镜56a向第二横向反射镜56b反射。
图7d例示了样本保持器18包括基座18b和在其上放置样本的旋转的样本支承表面18a的实施例。因而，在该实施例中，在样本照明波束7b保持在固定角度位置的同时，通过使样本保持器绕着显微镜物镜37的光轴a旋转，使样本照明波束7b相对于样本是旋转的。方向改变反射镜26中的任一者或两者可以是可枢转操作的反射镜tm1，例如，以mems部件的形式。
样本照明过程p1-自动校准例程的示例：
根据本发明实施例，显微镜可以有利地包括被配置为实施自动校准例程的软件和电子控制系统，其中该例程的目的在于控制可倾斜(例如，mems)反射镜26、tm1的检测角度，以校正几何错位，从而使得样本照明波束7b在显微镜物镜37的视场(fov)的中心射到显微镜物镜37的焦平面上。这等同于使入射光光点在照相机8的传感器表面上居中，相应地在所捕获的数字图像上居中。从该校正可以随着样本旋转波束系统36的旋转角度一起改变的意义上来讲该校正是动态的。
由于对于旋转波束系统36的每次旋转而言，想要校正的错位是等同的，因而控制可倾斜反射镜26a的信号相对于系统的旋转是周期性的。对于可倾斜反射镜中的每个自由度i＝x，y而言，可以分别通过使用对应于旋转波束系统的旋转频率f0及其整数倍nf0的可数数量的离散傅里叶正弦和余弦系数
如果入射光光点在物镜的视场(fov)中，那么可以通过对照相机图像的四个象限中的像素值求和而定量地确定该光点的位置。取两个沿对角线相对的象限的和之间的差值，则然后得到两个值u，v，它们描述了光点相对于图像中心的位置。在fov中心的光点将得到u＝v＝0。
值u、v可以被用作(例如针对pid控制的)反馈值。然后可以通过使样本照明波束相对于样本旋转并通过使用pid以保持光点在照相机的数字图像的中心而获得校正信号轨迹。但是该过程可能导致下面的困难：(i)一般而言，光点起初不在照相机的视场内，所以反馈环被破坏；以及(ii)由于pid控制的速度受到照相机帧速率的限制，所以可能需要非常大的帧速率以能够在旋转期间跟随光点。换言之，在旋转期间，可以发生的是，光点在两个照相机帧之间彻底离开照相机的视场，因而阻止pid能够做出反应。
为了规避这些困难，在图8中例示的实施例中，可以实施如下文描述的两步骤过程。在主要傅里叶系数是dc和基频的假设下，第一步骤是获取这些系数的近似值，从而使反馈环必须仅能够对表现出低得多的幅度的较高次谐波项做出反应。首先，针对旋转波束机构的两个正交静态位置θ1、θ2(图9的流程图中的“角度1和角度2”，下文的θ1和θ2)找到使光点在照相机8的视场中居中的可倾斜反射镜的位置-参见步骤p1-1到p1-5以及p1-6到p1-10。该步骤是通过在搜索图案中移动可倾斜反射镜(例如，mems反射镜)直到光点进入照相机的视场而完成的(步骤p1-2、p1-3以及p1-8、p1-9)。然后，pid控制被用于使光点在图像中居中(步骤p1-4、p1-9)。因此获得的反射镜角位置可以被保存(步骤p1-5、p1-9)，并可以允许计算(步骤p1-11)对应于角度偏差以及圆半径和相位的dc和基频傅里叶系数。这可以通过求解针对6个傅里叶系数a和b的6个方程完成：
这里，下标m指示从角度1和角度2的测量获得的x和y值，f是可倾斜反射镜的x方向和y方向之间的灵敏度比率。
接下来，使旋转波束系统(例如，指图1a、图1b的实施例中例示的机械旋转系统的臂)连续旋转(步骤p1-12)，并将先前确定的偏差和圆形运动动态地应用于可倾斜反射镜tm1(步骤p1-13)。入射光光点的运动的主要部分因而被减去，则残余运动慢到足以被反馈环(即pid控制)跟随(步骤p1-14)。位置可以被保存(p1-15)，并且在一个完整循环之后，反馈环的输出信号的傅里叶变换(p1-17)可以然后被加(p1-18)到先前获得的傅里叶系数(即，dc值和基频值)上，从而得到完整的校正谱。
如有必要(p1-16)，可以执行第二次迭代，现在将所获得的所有傅里叶系数在旋转期间应用于反射镜tm1(例如，mems反射镜)，并使用电子控制系统的反馈环来再次使残余的光点运动最小化。这在改变旋转频率时可以是有用的，因为mems反射镜的响应一般来说是依赖频率的，因此系数可以与旋转波束的角速度一起改变。
样本相位校正过程p2-用于基于样本的且自动的相位校正的可倾斜反射镜的反馈环控制的示例。
该例程的目标在于找到用于访问一定范围的查找表格(lut)的参数，该查找表格用于对获取的图像的相位平坦度上的系统误差进行数值校正。照到样本上的激光样本照明波束可能稍微没有准直。这可能是由于准直光学器件的错位造成的，但也是由于高斯波束的衍射受限发散造成的。当改变该波束必须行进通过的样本的光学厚度时，以散焦
可以从校准过程p1的结果推导出样本的光学厚度nh。可以注意到，可以执行过程p1以补偿样本照明波束相对显微镜物镜的视场(fov)的依赖于样本厚度h1、h2(参见图16d)的走离。
由于位于旋转波束系统的上游的倾斜反射镜tm1是静态安装的，所以旋转波束系统38的旋转将使得通过可倾斜反射镜tm1进行的校正是动态的。但是，主要分量是对应于圆柱坐标中的恒定角度偏转(以上的α′)的圆形校正。在过程p1中，通过第一阶傅里叶系数
半径r正比于角度α′上的偏移。由于斯涅耳定律的原因，在nh和α′之间不存在线性关系，因而在nh和r之间不存在线性关系。但是，如果使用查找表格(lut)来表征校正参数
该过程步骤可以被如下列举：
p2-1在执行了校准过程p1之后，如以上所述的由第一阶傅里叶系数
p2-2更新将从其提取校正系数
当散焦校正
在一种变型中，以上过程是通过使用较低谐波(即，dc傅里叶分量
在一种变型中，光学厚度nh由在p3/p4中执行的光程长度补偿确定。其中，由样本厚度nh引起的光程差通过移动元件来补偿。移动元件的位置可以被反过来用于推导nh。与以上类似地，nh非线性地依赖于移动元件位置，但是可以通过恰当校准的lut对该非线性进行补偿。反之亦然，通过过程p2推导出的nh的估值可以在p3/p4中被用于对该移动元件定位。
参考波束校正过程p5-示例
该例程的目标在于找到对于倾斜反射镜tm2的最优设置，从而使得所观察到的全息干涉条纹具有使经解调的相位图像的信噪比(snr)得到优化的频率。在显微镜中，全息干涉条纹是通过在光感测系统8(例如，照相机)上叠加两个光束(即，对象光束和参考光束)而创建的。假设两个光束是具有波矢
其中
在参考波中引入倾斜对应于将其表达式乘以线性相位函数，其方向通过矢量kr定义。因而经倾斜的参考波变为rt＝re-i(kr·x)，其中，x＝(ex，ey，ez)是笛卡尔坐标系的单位矢量：
可以识别出，干涉项与在sfd中对应不同调制的各种相位因数相乘。如果考虑沿平行于调制方向的轴ωx的调制频率，则倾斜角度θ将引起对应于下式的调制频率
另一方面，探测器在x方向上具有对应于ω＝1/δx的频率的采样能力，其中，δx是照相机的像素大小。因而，通过考虑奈奎斯特定理，能够由探测器求解(resolve)的最大角度为
根据该方程，对于λ＝520nm的主激光线以及ccd照相机的标准像素大小(δx＝5μm)而言，最大可用角度为y≤4o且α(2)≤2o。为了实现衍射波矢的测量，可以考虑在第一近似中将角度限于该值的一半，并且将载波频率放到象限的中心处，因而得到α(2)≤1°。假设最大带通偏移为带通/8，因而512px/8＝64px，那么最大偏移导致δα(2)≤0.25°。
鉴于从可倾斜反射镜tm2到光探测器8的最大距离为300mm，那么最大偏移导致δα(2)≤0.25°，使得横向实际空间位移为tan(0.25°)＊300mm＝1.3mm。因而，对于典型的传感器大小1024＊0.005mm＝5.12mm而言，6.4mm的波束大小应当足够使载波频率适应仅α(2)而不损失实际空间“diameter_ref＝fov+最大位移”中的强度。
强度图案的谱的位置依赖于对象波束7b和参考波束7a两者的方向。由于显微镜物镜37的与照相机8有关的几何结构是固定的，所以不能容易地调整对象波束的方向。但是，能够通过使用可倾斜反射镜，例如，tm2，调整参考波束的方向。用于找到对于可倾斜反射镜tm2的最优位置的过程可以如下：
p2-1首先运行校准过程p1和p3/p4，以确保存在可在光探测器8上观察到的干涉条纹。
p2-2借助于旋转波束系统36(例如，在图1b中例示的实施例中，旋转支座臂40)使对象波束7b旋转，以将对象波束的波矢的kx分量最小化。
p2-3计算光探测器(照相机)8上的强度图案的2dfft，并且由+1阶计算载波频率
p2-5增加倾斜反射镜tm2，从而使参考波束7a更加陡峭地落在照相机8的x轴上。返回至步骤p5-3。
p2-6计算照相机上的强度图案的2dfft，并且由+1阶计算载波频率
p2-7将kc，y与预定义最小值kmin进行比较。如果kc，y＞kmin，那么前进至步骤p5-10。
p2-8增加倾斜反射镜tm2，从而使参考波束更加陡峭地落在照相机的y轴上。返回至步骤p5-7。
p2-9通过将在对象波束路径中(位于样本1的上游)的反射镜tm1完全向一侧倾斜而使得仅参考波束7a落到光探测器8上，使得对象波束7b消隐。
p2-10通过计算像素的在照相机感兴趣区域(roi)中受到照明的部分而计算参考波束的填充因子ff。
p2-11将ff与预定义值ffmin进行比较。如果ff≥ffmin，那么前进至步骤p5-14。
p2-12将roi从未受照明的像素的平均位置移开。返回至步骤p5-11。
p2-13使对象波束可倾斜反射镜tm1返回至其默认位置，从而在光探测器上看到对象波束。
p2-14连续地旋转对象波束(例如，通过旋转支座臂40)。
p2-15获取多个全息图，并计算它们的载波频率的重心作为用于解调的带通滤波器的中心。
质量评估过程p6-参考图12的示例
该例程的目标在于通过提取光学波束的一些特征而对测量的质量进行评估，当没有样本存在于视场中时，特征为强度平均值波度和粗糙度。该过程的目标在于给予i)关于波束强度分布的信息(可以用于诊断问题)以及ii)留到过程p2之后才能确定的针对a_n^m的lut，其中，n≥2并且m≥1。如果样本1被插入到对象波束7b的路径，那么必须应用照亮(lightened)过程来确保样本基本上在特设的(ad-hoc)形状中，从而允许进行适当的3d测量。
依赖于所观察到的样本的类型、固定介质的性质以及光学表面的清洁度状态，强度分布会或多或少地变动。此外，即使在波束均匀性满足了一定质量要求时，由于光路中的残留轻微错位的原因，每个全息图的相位有可能不是理想化平坦的。为了实现最佳质量的层析成像测量，一旦补偿了第一阶像差(即，活塞(piston)、倾斜和散焦)，就可以对更高阶的像差进行量化和数值补偿，如过程p3或p4中所描述的。
在装置的该校准阶段中，已经执行了过程p1、p2、p3/p4和p5。现在我们可以确保整个视场没有可以作为对象和/或参考波束的强度分布的不均匀性而出现的缺陷。可替代地，如图18所述，可以在应用p1、p3/p4和p5之后在空的fov上执行p6，从而得到针对唯一归因于显微镜的光学特性的参数a_n^m的lut。随后的过程p2用于对归因于样本引起的光学特性的a_2^0进行更新。
因而，这里的方法是首先在参考波束7a光路内使用倾斜反射镜tm2来相对于光探测器8遮蔽参考波束。然后，对象波束7b可以被表征。在通过倾斜反射镜tm1遮蔽住对象波束时，可以针对参考波束执行相同的过程。如果在该点处检测到的误差，则可以启动过程p7，否则可以执行层析成像获取，意味着获取和分析一系列的全息图。
一旦波束均匀性满足了某些预定义的质量标准，则记录和分析一系列的全息图，如先前描述的那样。根据在相对于样本1旋转对象波束的循环期间取得每个全息图，再次在平坦度和粗糙度方面对由光探测器取得的波束信号的相位
误差分析过程p7-参考图13的示例
在出现误差时，启动该过程以解决问题或者尽可能多的诊断问题从而将有用信息以日志文件的形式传送至计算机网络(这里称为云)。如果在几个测试例程之后，装置仍然没有适当地工作，那么可能需要维修。
这里，我们只考虑以上描述的从p1到p6的例程中的故障。该误差例程p7描述了系统如何能够自我诊断问题并且解决问题或者向用户给出用于解决问题的基本且精确的指令。考虑两种类型的问题：i)与样本有关联的问题，或者是样本的性质(吸收、厚度)，或者是样本浸入其中的介质的性质(扩散或者表现出漂浮碎片)，或者ii)与光学器件有关联的问题，例如，由于灰尘或错位。
在检测到阻止执行适当的层析成像测量或者只是阻止完成过程p1到p6中的一个的误差时，方法如下。在第一步骤中，装置连接至云，以上传包含元数据的日志文件。第二步骤是通过使可倾斜反射镜tm1发生枢转而执行对象波束7b的2d的盲全局搜索。该搜索被说成是盲搜索，是因为未给出任何具体的约束来限制在tm1的可能倾斜角度范围内的搜索图案。该过程或者在显微镜开启期间发生(例如，在无样本1的情况下)，或者在已经将样本插入样本观察区17中之后发生。
稍后，可以对参考波束可倾斜反射镜tm2到tm4进行受约束的全局搜索，而约束则是由依据tm2的可移动元件或角度范围的tm3和tm4的平行取向给出的。该步骤的目标在于识别未被先前的步骤解决的问题是否实际上来自于参考光路。该搜索在这里是受约束的，因为各反射镜的运动根据设计是按照线性定律发生联系的。它还允许减少搜索的复杂度，从而加快搜索。
在执行完这两次全局搜索之后，可以完成过程p6，以评估测量的质量。从那里开始，问题或者得到了解决，或者需要进一步分析，该分析是然后针对旋转光引导系统的不同取向来执行的。可以对依赖于样本照明的一系列全息图实施单独的且计算密集型的分析。其目标在于明确该问题是否具有取向依赖性。
于是，能够推导出该问题来自于光学器件还是样本，并且可以给用户导向性指令。如果质量还是不令人满意，那么可以远程访问该装置，以进行更高级的分析。如果在该过程之后问题仍然存在，那么该装置将需要特别注意。
图18例示了根据本发明的实施例的显微镜的操作中各种过程p1到p7的全面实施的示例。
在下文说明在上述过程p1到p7的每一个中由光感测系统捕获的各全息图的幅度和相位分析。可以按照洋葱皮模型查看不同层级的反馈，该模型的外表面描述了最易访问的层级，而最里面的核心是最不易访问的层级。访问每一层级首先要求所有外侧的反馈层级的成功对准。具体地，可以通过使用如图14b中示出的具有强度、相干性、干涉条纹频率和相位的相继层级的洋葱皮模型来描述反馈控制的不同层级。每个反馈层级可以在所呈现的校准过程中的一个或多个中被访问，并且不仅表示对于校准质量的监视器，还表示在向内前进之前必须优化的参数：必须成功地校准所有的外层才能评估下一个层。最内层，成像相位，是被最后用于显微镜中对生物学样本成像的值。第一层，强度，是调整起来最不复杂的参数，因为它不需要其他参数的对准。如果对象波束和参考波束干净利落地通过波束路径内的所有光学元件的通光孔径，则该波束的强度得到优化。起初，必须仅一次就找到适当的对准，但是在其他反馈参数的对准期间，每次修改配置，就必须调整强度。强度对准的一个特别情况是校准过程p1，因为它需要确定动态的校正，该动态的校正要确保在样本照明波束的旋转期间对象波束的强度最大值保持在显微镜物镜的fov中居中。该强度层还可以提供有关样本和系统配置的信息。例如，在过程p1中获得的系数可以给出对样本的光学厚度的估算，如在p2中被使用的。而且，在反射镜tm4既可倾斜，又可平移的实施例中，参考波束路径中的可倾斜反射镜tm3的使光穿过可倾斜反射镜tm4的通光孔径的角度能够给出可平移反射镜tm4的位置的近似。
如果对象波束和参考波束的光程长度比光源的相干长度短，那么第二层，相干性，得到优化。这等同于对象波束和参考波束之间的固定相位关系，并且是观察干涉条纹所需要的。显然，为了获得干涉条纹，对象波束和参考波束两者的强度必须得到适当优化，即，必须成功对准外层。反过来，在对光程长度优化之后，应当对强度对准进行检验。除了提供对于干涉的必备条件之外，用于最优相干性的配置也是对于对象波束路径中的样本的光学厚度的测量。
第三层，干涉条纹频率，由入射到光感测系统上的参考波束和对象波束的相对角度定义。与强度形成对照的是，该层受到波束路径中的光学元件被穿过的角度的影响。如果干涉条纹频率大到足以使得围绕所观察的全息图阶(hologramorder)的通带中的经调制的图像信息不与0阶区域重叠，则该层将得到优化。如果干涉条纹方向使得，对于旋转样本照明波束相对于样本的所有旋转位置而言，对应谱内的载波频率峰均处于同一象限内，从而加快了处理，则干涉条纹频率得到进一步优化。在修改该层之后，必须对强度以及也有可能的相干性的适当对准进行检验。
干涉条纹频率，即，全息图的傅里叶变换中的载波峰值的位置，可以在运行时间中(即，在获取期间)，用于提取有用信息。例如，峰的最大值限定了对于解调必须使用的频率。在使样本照明波束相对于样本转动时，峰相对于其旋转的重心的位置可以被用于计算旋转波束系统相对于样本的角位置，以用于基于查找表(lut)的相位校正。
最内层，经解调的图像的相位，可以用于重建样本1的图像。该值是通过获取全息图，向其谱中的先前确定的通带应用滤波器以及成功解调载波频率而获得的。可以看出，在评估相位之前必须优化所有外层。鉴于空的样本包含介质但不包含生物学对象，如果所得到的图像的相位具有最佳平坦度，则参数得到优化。该相位平坦度可能因为次最优校正的显微镜物镜而降低质量，也因显微镜中的不正确放置的光学元件而降低质量，诸如：
i.使非准直波束穿过平的窗口。
ii.使波束斜着(即不平行于透镜的光轴)通过透镜。
可以使用优化例程来最小化上述像差，尤其是ii号像差，以控制在光学元件上的波束位置和入射角度。如果提供了无样本参考，则可以数值地校正残余相位误差。
参考图15，下文说明对于自动校准步骤的相位校正。通过控制可倾斜反射镜执行用于光学厚度估算的对象扫描反馈。它允许基于样本且自动化的相位校正，意味着无背景识别的独立于用户的校正，该校正能够处理高细胞汇合。
可以描述在成像过程期间引入的有关从对象到图像的相位转移的光学像差。假设通过光学系统的相位偏差
这里，索引i表示图像，o表示对象，以及s表示光学系统。如果以
可以在被称为zernike多项式
对于空的样本，即没有生物学样本浸入在其中的介质(例如，液体)而言，
可以直接从全息图的傅里叶变换(特定频域，sfd)或者通过在实际空间中最小平方拟合到经滤波以仅包含非零阶的全息图频率的相位(或者通过两种方法的组合)来确定针对每个获取的全息图的倾斜(z1像差，a_1^(±1)因子)。校正因子正比于全息图的载波峰值的位置，相应地，正比于通过最小平方拟合的平面的斜率。
载波频率(相应地，sfd中的峰值位置)可以被用于确定旋转波束机构相对于样本的角度位置θ。这里，在旋转波束机构的完整旋转期间，载波峰值的位置必须是相对于由载波峰值描述的圆的重心来确定的。在给定三个载波峰值的情况下，可以容易地找到该中心：重心是连接三个峰值位置的线段的中垂线的交点。在给定旋转波束机构的位置θ的情况下，可以通过将θ(和样本厚度)插入到查找表格中而获得剩余的校正因子a_n^m。该查找表格先前根据关于透明、均匀的样本所做的校准测量(诸如在过程p6中)来填充。对于各种样本介质厚度nh和旋转波束机构角度θ而言，未经校正的相位得到测量，以及对zernicke多项式r_n^m的最小平方拟合得到查找表格值。
参考图15b和15c，例示了在不同样本条件下像散和散焦的典型测量结果，该典型测量结果由作为时间(在旋转期间)的函数的更高阶展开表示。在图15b中，通过盖玻片提供样本，对于盖玻片而言，散焦仅是旋转的函数，散焦的偏差的幅值是由光学厚度确定的，像散在时间上为常数但依赖于旋转。在图15c中，样本在陪替氏培养皿中，由此散焦是旋转和蒸发(随时间而改变)的函数，散焦的偏差的幅值由样本的光学厚度和可能的弯液面确定，像散在时间上为常数但依赖于旋转。
这些测量结果告诉我们散焦的平均幅值随着样本的光学厚度而变化。因此，通过变化样本照明路径中的可倾斜反射镜的角度而扫描的目标是确定样本的光学厚度，并借助这些手段确定散焦的幅值。在水溶液的情况下，弯液面可能引入附加的散焦。为了得到最佳的散焦估算，例如散焦的theta依赖性(校准期间)的测量结果(尤其)可以用作弯液面估算。
参考图16a-16c，说明以上提及的前因子的估算。在变化可倾斜反射镜的角度的扫描中，由光感测系统的光传感器(例如，照相机)捕获的光束信号的测量结果提供下面的信息：如果入射光的角度α使得光束直接落入视场中，则在视场中心，即(x＝0)处的强度将示出最大值。这是图16a中针对实线显示的情况。对于样本的变化的光学厚度厚度nh而言，该最大值将偏移到不同的α，如图16b中所显示的。角度α和光学厚度之间的关系可以使用费马定理给出，并且涉及使针对给定几何结构的光学路径ψ最小化：
这里，(x0，y0)是从可倾斜反射镜反射出去的波束的位置，(x1，y1)是进入样本介质的波束的位置。因而可以得到α和光学厚度nh之间的非线性关系，但是对于光学厚度相较于到反射镜的距离小的情况而言，响应接近于线性，如图16c中针对显微镜中的典型值所示出的。
通过使用可倾斜反射镜而减少机械上的公差并且补偿热扩散的示例：
参考图17a，其表示了样本照明波束旋转头架构的例示，以探查以下讨论的机械公差的影响。改变参数包括：
-alpha：中心反射镜54相对于光轴a的角度。
-beta：旋转波束系统28相对于结构的角度。
-theta：外围反射镜56相对于在中立位置上的光轴的角度。
-d：中心反射镜54在其法线方向上的位置。
-d′：两个反射镜54、56之间的距离。
-d″：臂相较于空心轴58的水平位置。
所选择的标准将处于mems反射镜26b补偿角的一定公差(可以例如是0.1°)以内，该公差对应于其法线方向关于其机械枢转轴的静态误差。
研究了误差的不同组合，并且在图17b的表格中示出了结果。例如，被作为目标的公差可以是：
-d/d′和d″：0.1mm(不是非常关键)
-alpha/beta/theta：0.025°，其对应于0.0055mm的几何公差。
如前所述，还可以借助于至少部分地基于通过光感测系统捕获的光束信号的反馈环，对opd系统的可倾斜透射或反射元件进行控制，以调整和校正参考波束的路径。
更一般地，本发明的一个重要方面是借助于电子控制系统，使用来自通过光感测系统捕获的波束信号的反馈来通过控制系统自动控制一个或多个倾斜的可调整反射镜的角度，以便对样本照明波束或参考波束或样本照明波束及参考波束两者的不希望出现的偏离进行校正，或者以便创建想要的偏离(例如，以便控制opd)。样本照明路径中的偏离可能是由于制造公差、显微镜在其使用寿命内的部件的磨损、热膨胀效应或者样本介质中的变化(诸如，液体高度、弯液面曲率、非水平液体表面以及其他因素的变化)造成的。参考波束的偏离也可能是由于制造公差、显微镜在其使用寿命内的部件的磨损以及热膨胀效应造成的，以及还有由于用于控制光程差的期望的偏离造成的。通过读取通过光感测系统捕获的波束信号而控制在样本照明波束或者参考波束中的这些偏离，有利地提供了利用极小的设置以简单、容易、实惠的方式获得高质量图像的自动化方式。
动态opd过程p8-参考图5f、5g以及2c、2d的示例
由于在机械上的缺陷或者仅仅瑕疵的原因，当旋转扫描臂在全息图的获取期间正在完成360°旋转时，样本波束的光程长度(opl)可能发生变化。如果这些缺陷导致了限于激光的相干长度的一小部分的opl变化，则关于图4h-4i描述的过程可以用于实现针对扫描臂的任何取向(参见图2c和图2d)的最优干涉条纹对比度。
但是，该缺陷可以导致光程长度的变化超过相干长度，从而在臂的某个取向上极大地减少，或者甚至消除干涉条纹对比度，那么使得在这些位置上的相位计算失去意义。
为了对此进行补偿，并找到如图5g中例示的最小opl，通过显微镜的控制系统对opl进行动态调整，以保持参考波束和样本波束之间的opd远低于激光源的相干长度并确保沿旋转扫描过程的最佳干涉条纹对比度。
用于定义可以与旋转波束系统36同步地应用于opd系统32的参数的方法包括以下步骤：
a)将样本放置到样本保持器上，
b)使旋转波束系统位于第一位置，
c)使被配置为指引参考波束的所述至少一个可枢转操作方向改变反射镜(tm3、tm4)位于第一位置，
d)在样本波束被关掉时，测量通过光感测系统捕获的参考波束信号的位置，
e)打开样本波束，并测量通过光感测系统捕获的信号的干涉条纹对比度，
f)使所述至少一个可枢转操作方向改变反射镜(tm3、tm4)的位置改变一个增量，
g)重复步骤d)到f)直到增量之和对应于可枢转操作方向改变反射镜(tm3、tm4)的预定义的工作范围，
h)比较针对每个增量获得的干涉条纹对比度测量结果，并将可枢转操作方向改变反射镜(tm3、tm4)的针对具有最高值的干涉条纹对比度测量结果的位置连同旋转波束系统的位置存储到控制系统的存储器的查找表格(lut)中；
j)使旋转波束系统旋转一个小的增量，并重复步骤c)到h)直到旋转波束系统完成了360°旋转。
因而，可以创建用于提供参数的查找表格(lut)，能够应用该参数来与旋转波束系统36同步地动态地控制opd系统32。
作为示例，在图5f的实施例中例示了该过程，该过程包括下面的步骤：
一旦样本放置在xy台上(步骤p8-1)，就将旋转臂40放置于其停放位置(步骤8-2)。
之后，启动(步骤p8-3)过程p4(在图5e中例示)，从而找到导致最大干涉条纹对比度的该臂位置的最优opd位置。
保存针对该臂位置的opd系统参数(步骤p8-4)。
然后，使扫描臂旋转一个小的增量(步骤p8-5)，并且然后再次启动过程p4。再次存储参数。
重复先前的步骤p8-3到p8-5直到臂返回到其停放位置。
因此创建了查找表格(lut)(步骤p8-6)，从而收集必须与旋转波束系统36同步地应用于opd系统32的参数。
附图标记列表
显微镜2
(相干)光源4(激光器)
参考波束7a
样本照明波束7b(本文也称为对象波束)
光束引导系统6
分束器14
样本波束光路20
方向改变反射镜26，26a，26b
可倾斜反射镜tm1(mems)
样本照明装置28
反射镜系统34
第一反射镜54
第二反射镜56
旋转波束系统36
驱动装置38
传动装置39(皮带)
支座40(旋转臂图1a、图1b、图1d、图7a的实施例，/固定的图7b、图7c的实施例)
可操作的反射镜
中空轴58
轴承59
反射镜支座体60
被配置为旋转的枢转波束
显微镜物镜37
参考波束光路22
方向改变反射镜30
可倾斜反射镜tm2、tm3、tm4(例如，mems反射镜)
反射镜表面61
枢转轴63
光程差(opd)调整装置32
第一光偏离元件42
第二光偏离元件44
枢转支座46、48
枢转轴49、51
齿50
透镜65(本文也称为场镜)
波束重聚器16
光感测系统8(探测器、照相机)
图像数据处理系统10
外壳/支承结构12
样本观察区17
样本保持器18
高度调整机构
样本光
控制系统15
反射镜(例如，mems反射镜)倾斜角控制
反射镜旋转驱动控制
源控制
照相机控制
样本1
封闭容纳系统3a
基座11
盖玻片9
观察平面13
密封件7
开口皿3b
缓冲介质5
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