高速多方向线共焦数字全息三维显微成像方法及装置

本发明涉及三维显微成像技术领域，特别涉及高速多方向线共焦数字全息三维显微成像方法及装置。

背景技术：

数字全息三维成像技术沿袭了光学全息记录理论，利用光电探测器代替普通全息记录介质记录干涉图，通过计算机数值计算取代光学衍射来再现所记录的物光波场，同时获得物光波场的振幅信息和相位信息，整个记录和再现过程都数字化，是一种无接触、无破坏且具有较高分辨率的测量介质中相位变化的3d成像技术，有望成为3d微纳成像领域研究的有力工具。

空间分辨率是评价数字全息三维显微成像系统的重要指标，由成像系统的数值孔径(na)和记录波长共同确定。在数值孔径一定时，采用深紫外波长记录光也可以有效提高记录系统的分辨率，但是对波长要求较高，同时记录光可能会对样品产生影响；在波长一定时，使用大数值孔径的成像物镜可以有效提高记录系统的分辨率，但是大数值孔径的成像物镜却有着工作距离和焦深短以及视场小的缺点，而且成像物镜的像差对再现质量造成的影响也难以消除。另外还受到记录器件(如ccd,cmos)有限的光敏面尺寸及像元尺寸的限制，这在很大程度上影响了数字全息三维显微技术的进一步发展及应用。

为了突破数字全息中成像系统空间带宽积的限制，研究人员提出了光栅调制数字全息、合成孔径数字全息、结构光照明数字全息、倾斜照明数字全息等方法。

从空间频域角度出发，再现像的横向分辨率由数字全息显微系统所能记录下的物体衍射的最高空间频率决定。光栅调制数字全息三维成像技术通过在物体和线阵相机光敏面之间放置衍射光栅，记录过程中利用光栅的衍射将物体衍射的高频光波再次衍射到线阵相机光敏面的靶面上，压缩物体的空间频率，在数值再现过程中加入“数字光栅”，实现横向超分辨的再现成像。但是尚不能应用于高速的数字全息成像。

合成孔径数字全息三维成像技术是一种不需要在记录系统中使用显微放大系统即可获得高分辨率再现像的技术，能突破由数值孔径决定的系统分辨率极限，但是由于传统方法需要移动成像器件或者被测物体，在记录过程中会耗费大量的时间，而且对系统的稳定性要求也会很高。

结构光照明数字全息三维成像技术，采用类似于莫尔条纹原理，通过对宽场显微镜照明的预先余弦调制，拓展接收系统频域带宽，提高截止频率，能够使系统横向分辨率提高到原来的2倍。但是在记录过程中，需要在2π范围内准确移动调制光的相位获得多幅图像，将获取的各幅干涉图像进行快速傅里叶变换。同时为了实现分辨率的各向同性，需要在多个方向上对称地采用结构光照明。在提高成像分辨率的同时却增加了物体记录与再现方面的复杂性。

上述数字全息研究方法由于采用宽场成像，纵向分辨力低，并且噪声影响严重。共焦显微技术由于具备了良好的纵向分辨力而受到了广泛应用，并且横向分辨力也可以得到提高。在先技术(a.s.goyandd.psaltis,digitalconfocalmicroscope,opt.express2012,20(20):22720-22727)将点扫描共聚焦显微技术与数字全息三维成像技术相结合，对扫描点进行实时数字全息记录，获得目标的所有相位和强度信息，可以重建目标的三维图像。为了进一步提高成像速度，在先技术(changgengliu,sebastianknitter,zhilongcong,ikbalsencan,huicao,andmichaela.choma,high-speedline-fieldconfocalholographicmicroscopeforquantitativephaseimaging,opt.express2016,24(9):9251-9265)将一维线共焦显微技术与数字全息三维成像技术相结合，集成两种技术的优点，通过逐线记录一维离轴干涉图，实现快速高分辨低噪声的数字全息三维成像。但是在先技术均只能实现一维方向线共焦，无法实现二维横向分辨率的各向同性。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供高速多方向线共焦数字全息三维显微成像方法及装置。本发明可以有效地实现高速多方向线共焦数字全息显微成像；此外，本发明提高了三维成像的横向和纵向空间分辨率，实现高分辨率的数字全息三维成像，同时还实现了横向分辨率各向同性，具有信噪比高、抗干扰能力强的优点。

本发明的技术方案：高速多方向线共焦数字全息三维显微成像方法，其特征在于：激光信号首先经过起偏、扩束和聚焦后，由偏振分束棱镜分为参考光信号和探测光信号；将参考光信号通过第一透镜组中继至全反射镜并接收参考返回光信号；将探测光信号通过第二透镜组中继至样品平台并接收探测扫描光信号，其中探测光信号在中继过程中经过一维快速扫描器和线扫描方向快速转换单元，利用一维快速扫描器实现对样品平台的线扫描，利用线扫描方向快速转换单元实现多个扫描方向的快速切换，完成对样品的多方向共焦线扫描；参考返回光信号和探测扫描光信号在偏振分束棱镜合束进入接收光路；在接收光路中，信号先先经过狭缝滤除非聚焦平面的杂散光，再通过检偏形成离轴干涉场，然后通过接收透镜组中继到高速线阵相机，并得到多帧一维线共焦干涉图，经过高速数字采集后，在主控计算机中进行叠加生成多方向重建干涉场，并通过频谱叠加和角谱后向传输处理，实现高速多方向线共焦数字全息显微成像。

上述的高速多方向线共焦数字全息三维显微成像方法，在主控计算机中进行叠加生成多方向重建干涉场后，先进行二维傅里叶变换，再进行频谱叠加、滤波和平均处理，实现样品平台的物光频谱拓展，然后对拓展后的物光频谱做角谱后向传输处理，最后采用解包裹运算重建物光波场的三维相位分布，完成三维成像，同时通过样品平台轴向平移获得样品不同深度层次的三维相位信息。

前述的高速多方向线共焦数字全息三维显微成像方法，所述第一透镜组包括沿参考光信号传输方向依次设置的第一透镜、第一四分之一波片和第二透镜；所述第一四分之一波片用于调整参考返回光信号的光强。

前述的高速多方向线共焦数字全息三维显微成像方法，所述第二透镜组包括沿探测光信号传输方向依次设置的第三透镜、一维快速扫描器、第四透镜、线扫描方向快速转换单元、第五透镜和显微物镜；所述一维快速扫描器处于第三透镜和第四透镜之间，即第三透镜的后焦面和第四透镜前焦面；所述线扫描方向快速转换单元处于第四透镜和第五透镜之间，即第四透镜后焦面和第五透镜的前焦面。

前述的高速多方向线共焦数字全息三维显微成像方法，所述线扫描方向快速转换单元由第一二维快速扫描器、中空正多边形内反射镜和第二二维快速扫描器组成，入射的探测光信号首先经过第一二维快速扫描器偏转，然后发射到中空正多边形内反射镜的单个反射镜面，再反射到第二二维快速扫描器，由第二二维快速扫描器完成角度补偿后出射，出射的探测光信号相对于入射的探测光信号实现二维扫描视场内一个固定角度的旋转。

前述的高速多方向线共焦数字全息三维显微成像方法，所述接收透镜组包括沿参考返回光信号和探测扫描光信号传输方向设置的第六透镜、第七透镜和检偏器；所述的狭缝位于第六透镜的前焦面，用于滤除非聚焦平面的杂散光。

前述的高速多方向线共焦数字全息三维显微成像方法，所述的重建干涉场的强度分布表示为：

ih(kδxh，lδyh)

＝a(kδxh，lδyh)+c(kδxh，llδyh)exp[-j2π(ξxδxh+ξyδyh)]+c^*(kδxh，lδyh)exp[j2π(ξxδxh+ξyδyh)]；

式中：

其中o0(kδδxh，lδyh)为探测扫描光信号的离散振幅分布，为探测扫描光信号的离散相位分布，r0(kδxh，lδyh)为参考返回光信号的离散振幅分布，ξx和ξy，分别是x和y方向的空间频率，由参考返回光信号和探测扫描光信号的离轴夹角θ决定；k和l都是整数，-m/2≤k≤m/2，-n/2≤l≤n/2，m和n分别为两个方向的像素数；δxh和δyh为重建干涉图平面的采样间隔，δxh＝δyh＝lx/m＝ly/n，lx×ly是重建干涉场的面积，*表示卷积运算。

前述的高速多方向线共焦数字全息三维显微成像方法，将m个扫描方向的重建干涉场在主控计算机中通过二维傅里叶变换分别求出频谱，将m个频谱叠加、滤波和加权平均处理，实现样品平台的物光频谱拓展，其中二维傅里叶变换计算如下：

ih(pδξ，qδη)＝fft2{ih(kδxh，lδyh)}p，q

＝a(pδξ，qδη)+c+1(pδξ-ξx，qδη-ξy)+c-1(pδξ+ξx，qδη+ξy)；

式中：ih表示ih的二维傅里叶变换，p和q都是整数，-m/2≤p≤m/2，-n/2≤q≤n/2；δξ和δη分别为频谱域内两个轴的取样间隔，δξ＝1/(mδxh)＝1/lx，δη＝1/(nδyh)＝1/ly；a为干涉频谱的零级峰，c+1为干涉频谱的+1级峰，c-1为干涉频谱-1级峰；

通过参考返回光信号和探测扫描光信号的离轴夹角θ调整ξx和ξy，使其a、c+1和c-1在频谱域内足够分开，然后将频谱域内的a和c-1滤除，再将c+1平移至频谱域的中心，再进行角谱后向传输处理，即利用角谱传递函数将c+1向后传播以得到样品平台所在平面的物光频谱；最后采用解包裹运算，即对物光频谱作二维逆傅里叶变换得到重建后的物光波场的复振幅分布：

式中：m和n都是整数，-m/2≤m≤m/2；-n/2≤n≤n/2；λ是波长，h(pδξ，qδη)是频谱域内的角谱传递函数；ifft2是二维逆傅立叶变换；和为成像面的采样间隔，大小与高速线阵相机光敏面像素尺寸相同；

从而得到物光波场的相位分布：

实现如前述的高速多方向线共焦数字全息三维显微成像方法的装置，包括单频单模连续激光器，单频单模连续激光器经起偏器连接有扩束器，扩束器的输出端依次连接有半波片、矩形光阑、柱面透镜和偏振分束棱镜；所述偏振分束棱镜连接有第一透镜组、第二透镜组和接收透镜组；所述第一透镜组包括与偏振分束棱镜连接的第一透镜，第一透镜经第一四分之一波片连接有第二透镜；所述第二透镜连接有全反射镜；所述第二透镜组包括与偏振分束棱镜连接的第二四分之一波片，第二四分之一波片连接有第三透镜，第三透镜经一维快速扫描器连接有第四透镜，第四透镜经线扫描方向快速转换单元连接有第五透镜；所述第五透镜经显微物镜连接有样品平台；所述接收透镜组的前侧设有狭缝，所述接收透镜组包括与位于狭缝后侧的第六透镜，第六透镜经第七透镜连接有检偏器；所述检偏器连接有高速线阵相机，高速线阵相机经高速数字采集卡连接有主机计算机；所述主控计算机分别还与一维快速扫描器和线扫描防线快速转换单元连接。

前述的高速多方向线共焦数字全息三维显微成像方法的装置，所述线扫描方向快速转换单元由依次连接的第一二维快速扫描器、中空正多边形内反射镜和第二二维快速扫描器组成。

与现有技术相比，本发明中激光信号首先经过起偏、扩束和聚焦后，由偏振分束棱镜分为参考光信号和探测光信号；将参考光信号通过第一透镜组中继至全反射镜并接收参考返回光信号；将探测光信号通过第二透镜组中继至样品平台并接收探测扫描光信号，其中探测光信号在中继过程中经过一维快速扫描器和线扫描方向快速转换单元，利用一维快速扫描器实现对样品平台的线扫描，利用线扫描方向快速转换单元实现多个扫描方向的快速切换，完成对样品的多方向共焦线扫描；参考返回光信号和探测扫描光信号在偏振分束棱镜合束进入接收光路；在接收光路中，信号先先经过狭缝滤除非聚焦平面的杂散光，再通过检偏形成离轴干涉场，然后通过接收透镜组中继到高速线阵相机，并得到多帧一维线共焦干涉图，经过高速数字采集后，在主控计算机中进行叠加生成多方向重建干涉场，并通过频谱叠加和角谱后向传输处理，由此本发明可以实现高速多方向线共焦数字全息显微成像。此外，本发明在主控计算机中进行叠加生成多方向重建干涉场后，先进行二维傅里叶变换，再进行频谱叠加、滤波和平均处理，从而实现样品平台的物光频谱拓展，然后对拓展后的物光频谱做角谱后向传输算法处理，最后采用解包裹运算重建物光波场的三维相位分布，完成三维成像，同时通过样品平台轴向平移可以获得样品不同深度层次的三维相位信息。因此，本发明通过将离轴数字全息三维成像技术与高速多方向线共焦成像技术相结合，利用多方向线共焦频谱叠加、滤波和平均处理实现横向成像频谱范围拓展，从而提高了横向空间分辨率，通过线共焦成像提高了纵向空间分辨率，从而实现了高分辨率的数字全息三维成像。同时仅通过一维扫描便实现了横向分辨率各向同性，具有高速成像、信噪比高、抗干扰能力强的优点，在高速高分辨高精度三维检测领域具有重要的发展前景。

附图说明

图1是本发明的框架结构示意图；

图2是扫描方向快速转换单元的结构示意图；

图3是中空正三角形内反射镜原理示意图；

图4是高速线阵相机的光敏面、探测扫描光信号和参考返回光信号之间的几何关系图；

图5是主控计算机中的算法流程图。

附图中的标记为：

1、单频单模连续激光器；2、起偏器；3、扩束器；4、半波片；5、矩形光阑；6、柱面透镜；7、偏振分束棱镜；8、第一透镜；9、第一四分之一波片；10、第二透镜；11、全反射镜；12、第三透镜；13、一维快速扫描器；14、第四透镜；15、扫描方向快速转换单元；16、第五透镜；17、显微物镜；18、样品平台；19、第六透镜；20、检偏器；21、第七透镜；22、高速线阵相机；23、高速数字采集卡；24、主机计算机；25、第一二维快速扫描器；26、中空正多边形内反射镜；27、第二二维快速扫描器；28、第二四分之一波片；29、狭缝。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

实施例1：单频单模连续激光器产生的光信号首先经过起偏、扩束和柱面透镜聚焦后，由偏振分束棱镜分为参考光信号和探测光信号；将参考光信号通过第一透镜组中继至全反射镜并接收参考返回光信号；将探测光信号通过第二透镜组中继至样品平台并接收探测扫描光信号，其中第二透镜组内设置有一维快速扫描器和线扫描方向快速转换单元，利用一维快速扫描器实现对样品平台的某个方向的线扫描，利用线扫描方向快速转换单元实现多个扫描方向的快速切换；参考返回光信号和探测扫描光信号在偏振分束棱镜合束进入接收光路；在接收光路中，信号先经过狭缝滤除非聚焦平面的杂散光，再通过接收透镜组中继到高速线阵相机的光敏面，中继时经过检偏器的检偏形成离轴干涉场，得到多帧一维线共焦干涉图；多帧一维线共焦干涉图经过高速数字采集，在主控计算机中进行叠加生成多方向重建干涉场，再进行二维傅里叶变换、频谱叠加、滤波和平均处理，实现样品平台的物光频谱拓展，然后对拓展后的物光频谱做角谱后向传输算法处理，最后采用解包裹运算重建物光波场的三维相位分布，完成三维成像，同时通过样品平台轴向平移获得样品不同深度层次的三维相位信息。通过样品平台轴向平移获得样品不同深度层次的三维相位信息，最终实现高速多方向线共焦数字全息高分辨率三维显微成像。

实现上述方法的装置，如图1所示，包括单频单模连续激光器1，单频单模连续激光器1经起偏器2连接有扩束器3，扩束器3的输出端依次连接有半波片4、矩形光阑5、柱面透镜6和偏振分束棱镜7；所述偏振分束棱镜7连接有第一透镜组、第二透镜组和接收透镜组；所述第一透镜组包括与偏振分束棱镜7连接的第一透镜8，第一透镜8经第一四分之一波片9连接有第二透镜10；所述第二透镜10连接有全反射镜11；所述第二透镜组包括与偏振分束棱镜7连接的第二四分之一波片28，第二四分之一波片28连接有第三透镜12，第三透镜12经一维快速扫描器13连接有第四透镜14，第四透镜14经线扫描方向快速转换单元15连接有第五透镜16；如图2所示，所述线扫描方向快速转换单元5由依次连接的第一二维快速扫描器25、中空正多边形内反射镜26和第二二维快速扫描器27组成；所述第五透镜16经显微物镜17连接有样品平台18；所述接收透镜组的前侧设有狭缝29，所述接收透镜组包括与位于狭缝29后侧的第六透镜19，第六透镜19经第七透镜21连接有检偏器20；所述检偏器20连接有高速线阵相机22，高速线阵相机22经高速数字采集卡23连接有主机计算机24；所述主控计算机24分别还与一维快速扫描器13和线扫描防线快速转换单元15连接。

实施例2：在实施例1的基础上，具体的，采用633nm单频单模连续激光器，激光器线宽10khz，输出功率为20mw，单频单模连续激光器产生的光信号首先经过起偏，确保偏振消光比大于25db，经过10×扩束器进行扩束，然后再经过半波片和矩形光阑，矩形光阑位于柱面透镜的前焦面，柱面透镜焦距50mm，矩形光阑长度5mm；光信号经过柱面透镜后，在后焦面产生一条聚焦线光束入射至1×2偏振分束棱镜，由1×2偏振分束棱镜分为参考光信号和探测光信号，两路信号分束比由半波片进行控制，大部分能量作为探测光信号，小部分能量作为参考光信号。

将参考光信号通过第一透镜组中继至全反射镜并接收参考返回光信号；所述第一透镜组包括沿参考光信号传输方向依次设置的第一透镜、第一四分之一波片和第二透镜；其中柱面透镜、第一透镜和第二透镜共同构成了4f系统，第一四分之一波片用于调整参考返回光信号的光强；第一透镜的焦距为150mm，第二透镜的焦距为20mm；

将探测光信号通过第二透镜组中继至样品平台并接收探测扫描光信号；具体是，所述第二透镜组包括沿探测光信号传输方向依次设置的第三透镜、一维快速扫描器、第四透镜、线扫描方向快速转换单元、第五透镜和显微物镜；其中柱面透镜、第三透镜、第四透镜、第五透镜和显微物镜共同构成了4f系统，一维快速扫描器处于第三透镜和第四透镜之间，即第三透镜的后焦面和第四透镜前焦面(两焦平面重合)，一维快速扫描器采用thorlabs的一维振镜系统gvs001；线扫描方向快速转换单元处于第四透镜和第五透镜之间，即第四透镜后焦面和第五透镜的前焦面。利用一维快速扫描器实现对样品平台的某个固定角度的线扫描；利用线扫描方向快速转换单元实现多个扫描方向的快速切换，线扫描方向快速转换单元由第一二维快速扫描器、中空正多边形内反射镜和第二二维快速扫描器组成，入射的探测光信号首先经过第一二维快速扫描器偏转，然后发射到中空正多边形内反射镜的某个反射镜面，假设该反射镜面的倾斜角度为θ，再反射到第二二维快速扫描器，由第二二维快速扫描器完成角度补偿后出射，出射探测光信号相对于入射探测光信号实现二维扫描视场2θ角度的旋转；如图3所示，中空正三角形内反射镜可以实现3个角度(0度、120度和240度)的角度旋转，本实施例中的中空正多边形内反射镜为中空正十六边形内反射镜，可以实现4个角度(0度、45度、90度和135度)的旋转，出射的探测光信号通过第五透镜和显微物镜中继到样品平台，然后接受样品平台反射回的探测扫描光信号；

参考返回光信号和探测扫描光信号在偏振分束棱镜合束进入接收光路；在接收光路中，信号先经过狭缝滤除非聚焦平面的杂散光，再通过接收透镜组中继到高速线阵相机的光敏面，中继时经过检偏器的检偏形成离轴干涉场，得到多帧一维线共焦干涉图；所述接收透镜组包括沿参考返回光信号和探测扫描光信号传输方向设置的第六透镜、第七透镜和检偏器；其中柱面透镜、第六透镜和第七透镜共同构成了4f系统，狭缝位于第六透镜的前焦面，用于滤除非聚焦平面的杂散光；所述第六透镜焦距50mm，第七透镜焦距300mm；高速线阵相机选用aviivaem2，像素数目512个，像素尺寸14μm×14μm，扫描行频126khz，扫描线数512条，成像系统放大率为45倍，像素分辨率为0.31μm。

多帧一维线共焦干涉图经过高速数字采集(ni的pcie-1433图像采集卡)，在主控计算机中进行叠加生成某个扫描方向的重建干涉场；

重建干涉场的强度分布表示为：

ih(kδxh，lδyh)

＝a(kδxh，lδyh)+c(kδxh，llδyh)exp[-j2π(ξxδxh+ξyδyh)]=c^*(kδxh，lδyh)exp[j2π(ξxδxh+ξyδyh)]；

式中：

其中o0(kδδxh，lδyh)为探测扫描光信号的离散振幅分布，为探测扫描光信号的离散相位分布，r0(kδxh，lδyh)为参考返回光信号的离散振幅分布，ξx和ξy分别是x和y方向的空间频率，如图4所示，由参考返回光信号和探测扫描光信号的离轴夹角θ决定；k和l都是整数，-m/2≤k≤m/2，-n/2≤l≤n/2，m和n分别为两个方向的像素数；δxh和δyh为重建干涉图平面的采样间隔，δxh＝δyh＝lx/m＝ly/n，lx×ly是重建干涉场的面积，*表示卷积运算。

在主控计算机中进行叠加生成多个扫描方向的重建干涉场，再进行二维傅里叶变换、频谱叠加、滤波和平均处理，实现样品平台物光频谱的拓展，然后对拓展后的物光频谱做角谱后向传输算法处理，最后采用解包裹运算重建物光波场的三维相位分布，通过样品平台轴向平移获得样品不同深度层次的三维相位信息。如图5所示，具体是：将m个扫描方向的重建干涉场在主控计算机中通过二维傅里叶变换分别求出频谱，将m个频谱叠加、滤波和加权平均，实现样品平台的物光频谱拓展，提高横向空间分辨率，其中二维傅里叶变换计算如下：

ih(pδξ，qδη)＝fft2{ih(kδxh，lδyh)}p，q

＝a(pδξ，qδη)+c+1(pδξ-ξx，qδη-ξy)+c-1(pδξ+ξx，qδη+ξy)；

式中：ih表示ih的二维傅里叶变换，p和q都是整数，-m/2≤p≤m/2，-n/2≤q≤n/2；δξ和δη分别为二维频谱域内的两个轴的取样间隔，δξ＝1/(mδxh)＝1/lx，δη＝1/(nδyh)＝1/ly；a为干涉频谱的零级峰，c+1为干涉频谱的+1级峰，c-1为干涉频谱-1级峰。通过参考返回光信号和探测扫描光信号的离轴夹角θ调整ξx和ξy，使其a、c+1和c-1在频谱域内足够分开，然后将频谱域内的a和c-1滤除，再将c+1平移至频谱域的中心，再进行角谱后向传输处理，即利用角谱传递函数将c+1向后传播以得到样品平台所在平面的物光频谱；最后采用解包裹运算，即对物光频谱作二维逆傅里叶变换得到重建后的物光波场的复振幅分布：

式中：m和n都是整数，-m/2≤m≤m/2；-n/2≤n≤n/2；λ是波长，h(pδξ，qδη)是频谱域内的角谱传递函数；ifft2是二维逆傅立叶变换；和为成像面的采样间隔，大小与线阵相机光敏面像素尺寸相同；

从而得到物光波场的相位分布：

最后进行解包裹运算，得到物光波场的三维相位分布，完成三维成像。通过样品平台轴向平移获得样品不同深度层次的三维相位信息。

本实施例最终的扫描成像速约为67帧/秒。

综上所述，本发明通过将离轴数字全息三维成像技术与高速多方向线共焦成像技术相结合，利用多方向线共焦频谱叠加、滤波和平均处理实现横向成像频谱范围拓展，提高了横向空间分辨率；通过线共焦成像提高了纵向空间分辨率。从而实现了高分辨率的数字全息三维成像。同时还实现了横向分辨率各向同性，具有信噪比高、抗干扰能力强的优点，在高速高分辨高精度三维检测领域具有重要的发展前景。