专利名称：一种具有抗汞特性的喜温硫杆菌基因工程菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株喜温硫杆菌及其应用，具体地说是一株具有抗汞特性的喜温硫杆菌及其应用。
背景技术：
喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)在细菌浸矿中具有十分重要的作用。在实际应用过程中，因为该菌生长缓慢、细胞得率低以及对重金属如砷、汞、银等缺乏抗性等弱点，限制了其应用范围，也给实验室的研究工作带来许多不便。对国内外文献检索，目前还没有任何关于对该菌进行遗传改造，构建成功抗汞基因工程菌的报道。
发明内容
针对现有技术中该菌缺乏对汞的抗性的不足，本发明要解决的问题是提供一株具有抗汞特性的喜温硫杆菌，满足对含汞金矿的生物浸出，使其充分发挥生物冶金的功能。
本发明涉及的喜温硫杆菌抗汞基因工程菌的构建及在含HgCl2培养基中的生长及应用，涉及的步骤顺序如下(1)菌种选择喜温硫杆菌MTH-04(Acidithiobacillus caldus MTH-04)；大肠杆菌SM10(Escherica coli SM10)。
(2)可移动性抗汞质粒载体pTMJ212的构建将含有抗汞基因的质粒pTM314进行SalI和BamHI双酶切，分离得到大小为3.4kb的抗汞片段merCA；对可移动性的质粒载体pJRD215进行BamHI和XhoI(XhoI与SalI为同尾酶)双酶切，回收约8.7kb的载体片段；用T4连接酶将这两个片段连接，将连接液转化大肠杆菌SM10，在含有Sm(100μg/m1)的LB固体平板上37℃静置培养，进行转化子的筛选，挑取转化子进行质粒提取、酶切验证，构建了抗汞质粒pTMJ212。
(3)喜温硫杆菌抗汞工程菌的制备以大肠杆菌SM10作为供体菌，野生型喜温硫杆菌MTH-04作为受体菌在滤膜上进行接合转移。供体菌和受体菌分别离心收集菌体，洗涤液洗涤两次，用洗涤液分别悬浮供体菌和受体菌至相同密度，然后按一定比例混合后取适量的菌悬液(0.1～0.3ml)加到硝酸纤维素滤膜上，滤膜置于接合平板上37℃培养48～72h，使之接合。取滤膜用1ml无机盐洗涤液洗下菌体，稀释成一系列不同浓度100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，分别取100～200μl涂布含相应抗生素的Starky-Na2S2O3选择平板及相应的不含抗生素的对照平板。同时在选择性平板上分别涂布供体菌和受体菌作为对照。放置40～45℃温箱中培养7～10d观察，挑取接合子进行菌落PCR验证，将携带有抗汞质粒pTMJ212的喜温硫杆菌已于2006年6月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心编号为CGMCC1742，命名为A.cadus CGMCC1742。
(4)A.cadus CGMCC1742的种子培养将步骤(3)筛选得到的接合子，在无菌条件下用接种环接于50mL Starky-S0无机盐培养基(Sm 300μg/ml)中，40～45℃条件下，静置培养3～5d，再振荡培养至稳定期(约7d)，制得种子液；(5)A.cadus CGMCC1742扩大培养以3～5％体积比的接种量，将种子液接种于100mL Starky-S0无机盐培养基(Sm 300μg/ml))中，40～45℃条件下，静置培养3～5d，再振荡培养2d；(6)A.cadus CGMCC1742在不同HgCl2浓度培养基中的生长将步骤(5)所得的培养液静置，除去硫粉，离心收集菌体，用Starky无机盐悬浮，取相同体积悬浮液加入含不同HgCl2浓度(0～4.5μg/ml)的Starky-S0无机盐培养基(Sm 300μg/ml)中，同时以野生型喜温硫杆菌MTH-04作为阴性对照，40～45℃条件下静置培养10～14d；不同时间收集步骤(4)中的各菌液，离心得菌体，PBS缓冲液洗菌体三次，加入裂解缓抽提细胞总蛋白，以考马斯亮蓝染色法进行蛋白的定量；同时测定两株菌不同时的菌浓(OD600)，绘制生长曲线，比较A.caldus MTH-04与A.caldus CGMCC1742在含汞培养基中的生长情况即对抗汞特性进行比较。
(7)抗汞质粒pTMJ212在A.cadus CGMCC1742的稳定性检测在固体平板上挑取A.caldus接合转移子菌落一个，接种到不含有筛选标记的Starky-S0液体培养基中，在没有选择压力条件下40℃静止培养7d，然后按照1％的比例转接，如此连续转接5次(约50代)，稀释后涂布不含有筛选标记的Starky-Na2S2O3固体平板，40℃培养7d。菌落长出后，用无菌牙签分别在以抗生素作为筛选标记的Starky-Na2S2O3固体平板上点种100个菌落，计算抗性菌落与敏感菌落的比例，测出质粒在喜温硫杆菌中的稳定性。
其中，步骤(3)中所述的菌体接合培养时间优选是72h；固体培养温度优选是42℃，培养时间是8d；其中，步骤(4)、(5)、(6)中所述的菌体培养温度优选是42℃；其中，步骤(4)、(5)中所述的静置培养时间优选是4d；其中，步骤中(6)所述培养时间为12d。
在上述抗汞质粒的构建中，培养大肠杆菌SM10使用的LB液体培养基，配方为每1000ml蒸馏水中添加蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，用2N NaOH溶液调pH至7.0～7.5，15磅/寸2高压蒸汽灭菌20min，37℃培养。
上述LB固体培养基为上述LB液体培养基中加入1.8％琼脂粉，pH7.0～7.5。
在上述喜温硫杆菌培养使用的液体Starky-S0无机盐培养基，配方为每1000ml蒸馏水中添加(NH4)2SO42g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，CaCl2·2H2O 0.25g，用浓H2SO4调pH2.5～3.5，121℃条件下灭菌20min；硫磺粉常压蒸煮灭菌2h以上；临用前，用灭菌的药匙取一定量的硫磺粉加入Starky无机盐培养基中(约20g/L)。
上述Starky-Na2S2O3固体培养基为上述液体Starky-S0无机盐培养基成分添加质量体积百分比浓度为1％的琼脂粉及经过滤除菌的Na2S2O3(10g/L)，自然pH4.8。
上述Starky-Na2S2O3接合培养基为上述Starky-Na2S2O3固体培养基中加入0.1％的酵母粉，pH4.8～5.0。
其中，步骤(3)中所述的菌体洗涤液为上述Starky-Na2S2O3液体培养基中加入等体积的蒸馏水作为菌体洗涤液。
上述步骤(3)中进行菌落PCR的引物为上游引物5｀-TAACCCGCATCATGGACAAAATTGGCATAG-3｀下游引物5｀-GGACTCCTTTATCAATCCGTCTCAAGCGGG-3｀上述步骤(6)中的PBS缓冲液配方为每1000ml蒸馏水中添加NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO41.44g，KH2PO40.24g，用HCl调pH值至7.4，加H2O定容至1L，15磅/cm2，灭菌20min。
上述步骤(6)中的裂解液配方为每1000毫升蒸馏水各成分含量为50mmol/L Tris-Cl(pH8.0)，150mmol/LNaCl，0.2g/l叠氮钠，1g/L SDS，100mg/L Aprotin，10g/L NP-40，5g/L去氧胆酸钠，100mg/L苯甲基磺酰氟(PMSF)。
本发明所述的CGMCC1742可以在HgCl2浓度为5μg/ml时保持正常生长较野生型喜温硫杆菌MTH-04，其抗汞能力提高了一倍，这对含汞金矿的生物浸出有着重要的意义，具有极大的应用前景。此外，因HgCl2在高温、酸性条件下较抗生素更稳定，因此抗汞特性可以作为研究喜温硫杆菌遗传改造方面的一个可靠的筛选标记。
具体实施例方式
实施例1抗汞质粒pTMJ212的构建及鉴定。
(1)将来自pTM314的抗汞片段与可穿梭性质粒pJRD215连接后，转化大肠杆菌SM10，在含有Sm/HgCl2的LB固体平板筛选得到含有Sm抗性质粒的大肠杆菌SM10，经提取质粒酶切验证，转化子中携带的质粒确实含抗汞片段merCA。
(2)经过对大肠杆菌SM10(pTMJ212)的抗汞特性研究，表明merCA的抗汞特性在重组质粒pTMJ212中成功的进行了表达，使大肠杆菌SM10对HgCl2的抗性由10μg/ml提高至22.5μg/ml。
上述LB筛选培养基中，Sm、HgCl2的筛选浓度分别为100μg/ml，18μg/ml。
实施例2喜温硫杆菌抗汞基因工程菌的构建及鉴定。
(1)分别收集指数中期的大肠杆菌SM10(pTMJ212)作为供体菌，稳定期的野生型喜温硫杆菌MTH-04作为受体菌，无机盐洗涤液洗涤3次，按相同菌体浓度悬浮于洗涤液中备用。
(2)按供体菌与受体菌的体积比为2∶1，将悬浮液进行混合，取150ul放于孔径为0.45μm的硝酸纤维素滤膜上，37℃于接合平板上培养48h；1ml洗涤液将滤膜上的菌体洗下，稀释为10-3、10-4，分别取200μl涂布Starky-Na2S2O3筛选平板，42℃静置培养10d。
(3)挑取筛选平板上的抗性菌落，经洗涤液洗涤，悬于30μl蒸馏水，煮沸裂解菌体，取1μl进行PCR验证，同时对质粒pTMJ212进行PCR作为阳性对照，野生型喜温硫杆菌MTH-04为阴性对照。
(4)经菌落PCR验证，从筛选平板上挑取的接合子得到的PCR产物与质粒pTMJ212一致，而野生型喜温硫杆菌的产物中没有目的条带。
上述Starky-Na2S2O3筛选平板中加入Sm、HgCl2的浓度分别为300μg/ml、3μg/ml。
实施例3喜温硫杆菌抗汞基因工程菌的菌种鉴定及保藏信息。
以实施例2方式获得的喜温硫杆菌抗汞菌株于2006年6月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国科学院微生物研究所，中国北京)，保藏中心编号为CGMCC1742。
上述喜温硫杆菌CGMCC1742，经鉴定，具有如下生物学特征具有嗜热、嗜酸的特性，为革兰氏阴性，端生鞭毛，无运动，严格好氧，为专性自养硫氧化细菌，短杆状，大小为(0.6～0.8)μm×(1～2)μm；以硫或者硫的复合物作为能源，在含有硫代硫酸钠和四硫酸钾的固体培养基上能生长；菌落形态为圆形，白色半透明，凸起，光滑，在菌落中央有硫的沉淀；生长最适温度为45℃，在32～58℃范围内都能生长，生长最适pH为2.0～2.5。
实施例4A.caldus CGMCC1742在含汞培养基中的生长应用-1(1)菌种选择A.caldus MTH-04，A.caldus CGMCC1742；(2)种子培养将A.caldus MTH-04及A.caldus CGMCC1742在无菌条件下用接种环接一环于50mL Starky-S0液体培养基中，42℃条件下，静置培养3～5d，再振荡培养至稳定期(约7d)，制得种子液；(3)扩大培养以5％的体积比的接种量，将两株菌的种子液接种于100mLStarky-S0液体培养基中，42℃条件下，静置培养3～5d，再振荡培养至稳定期(约7d)；(4)A.caldus MTH-04与A.caldus CGMCC1742在含汞培养基中的生长将步骤(3)中得到的培养液静置，使硫粉沉淀，取上清，离心收集菌体，用Starky无机盐悬浮至相同浓度，取相同体积悬浮液接入100mL含有HgCl2浓度分别为0μg/ml，2.5μg/ml，3.0μg/ml，3.5μg/ml，4.0μg/ml，4.5μg/ml的Starky-S0液体培养基中，42℃条件下，静置培养14d；(5)A.caldus MTH-04与A.caldus CGMCC1742在不同HgCl2培养基中细胞总蛋白含量的测定不同时间收集步骤(4)中的各菌液，尽可能不要吸取到硫粉，离心得菌体，PBS缓冲液洗菌体三次，加入裂解缓抽提细胞总蛋白，以考马斯亮蓝染色法进行蛋白的定量；比较A.caldus MTH-04与A.caldus CGMCC1742在含汞培养基中的最大总细胞蛋白含量，以此进行抗汞特性的比较；(6)本实验所构建的抗汞基因工程菌A.caldus CGMCC1742较野生型A.caldus MTH-04，抗汞特性得到了很大的提高HgCl2浓度低于3.0μg/ml时，A.caldus CGMCC1742的最大总细胞蛋白含量达到80mg/L，为A.caldus MTH-04细胞总蛋白含量的两倍；HgCl2浓度为3.0μg/ml时，A.caldus MTH-04最大总细胞蛋白含量为28mg/L，与接种时相当，没有生长，而A.caldus CGMCC1742为70mg/L；当HgCl2浓度高于3.0μg/ml时，A.caldus MTH-04最大总细胞蛋白含量一直维持在28mg/L，没有生长迹象，而A.caldus CGMCC1742的最大总细胞蛋白含量始终保持在45～60mg/L，由此得出，A.caldus CGMCC1742较A.caldusMTH-04在含汞培养基中有很明显的生长优势，其抗汞特性得到了显著的提高。
上述A.caldus CGMCC1742在进行种子培养及扩大培养时，培养基中加入浓度为300μg/ml的Sm。
实施例5A.caldus CGMCC1742在含汞培养基中的生长应用-2(1)菌种选择A.caldus MTH-04，A.caldus CGMCC1742；
(2)种子培养将A.caldus MTH-04及A.caldus CGMCC1742在无菌条件下用接种环接一环于50mL Starky-S0液体培养基中，42℃条件下，静置培养3～5d，再振荡培养至稳定期(约7d)，制得种子液；(3)扩大培养以5％的体积比的接种量，将两株菌的种子液接种于100mLStarky-S0液体培养基中，42℃条件下，静置培养3～5d，再振荡培养至稳定期(约7d)；(4)A.caldus MTH-04与A.caldus CGMCC1742在含汞培养基中的生长将步骤(3)中得到的培养液静置，使硫粉沉淀，取上清，离心收集菌体，用Starky无机盐悬浮至相同浓度，取相同体积悬浮液接入100mL含有HgCl2浓度分别为0μg/ml，2.5μg/ml，3.0μg/ml，3.5μg/ml，4.0μg/ml，4.5μg/ml，5μg/ml的Starky-S0液体培养基中，42℃条件下，静置培养12d；(5)A.caldus MTH-04与A.caldus CGMCC1742在不同HgCl2培养基中生长曲线的测定不同时间取步骤(4)中的各培养液用紫外分光光度计进行菌浓(OD600)的测定；比较A.caldus MTH-04与A.caldus CGMCC1742在含汞培养基中的生长情况即对抗汞特性进行比较；(6)本实验所构建的抗汞基因工程菌A.caldus CGMCC1742较野生型A.caldus MTH-04，抗汞特性得到了很大的提高A.caldus MTH-04在HgCl2浓度为2.5μg/ml时，生长完全受到抑制，在低于2.5μg/ml时，生长也要比重组菌A.caldus CGMCC1742弱得多；而重组菌A.caldus CGMCC1742在HgCl2浓度为5μg/ml时，仍能保持一定的生长量，且延迟期与不含HgCl2培养基中菌的生长曲线相比，并没有推迟，即工程菌较野生菌的抗汞特性提高了一倍。
上述A.caldus CGMCC1742在进行种子培养及扩大培养时，培养基中加入浓度为300μg/ml的Sm。
权利要求
1.一株具有抗汞特性的喜温硫杆菌，其特征在于该菌名为Acidithiobacilluscaldus，已于2006年6月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC 1742。
2.如权利要求1所述的喜温硫杆菌的抗汞基因工程菌在含汞培养基中的生长应用，涉及的步骤顺序如下(1)本例选用菌种A.caldus MTH-04和A.caldus CGMCC 1742，但不限于这两株菌；(2)种子培养将A.caldus MTH-04及A.caldus CGMCC 1742在无菌条件下分别用接种环接一环于10mL Starky-S0液体培养基中，40～45℃条件下，静置培养3～5d，再振荡培养至稳定期(约7d)，制得种子液；(3)扩大培养以5％的体积比的接种量，将两株菌的种子液分别接种于100mLStarky-S0液体培养基中，40～45℃条件下，静置培养3～5d，再振荡培养至稳定期(约7d)；(4)A.caldus MTH-04与A.caldus CGMCC 1742在含汞培养基中的生长将步骤(3)中得到的培养液静置，使硫粉沉淀，取上清，离心收集菌体，用Starky无机盐悬浮至相同浓度，取相同体积悬浮液接入100mL含有HgCl2浓度分别为0μg/ml，2.5μg/ml，3.0μg/ml，3.5μg/ml，4.0μg/ml，4.5μg/ml的Starky-S0液体培养基中，40～45℃条件下，静置培养14d；(5)A.caldus MTH-04与A.caldus CGMCC 1742在不同HgCl2培养基中细胞总蛋白含量及生长曲线的测定不同时间取步骤(4)中的各培养液，收集菌体，裂解抽提细胞总蛋白并定量，同时用紫外分光光度计进行菌浓(OD600)的测定，绘制两株菌的生长曲线；比较A.caldus MTH-04与A.caldus CGMCC 1742在含汞培养基中的生长情况即对抗汞特性进行比较。
3.如权利要求2所述的A.caldus CGMCC 1742在含汞培养基中的生长应用，其特征在于，步骤(2)、(3)、(4)中所述的菌体培养温度是42℃。
4.如权利要求2所述的A.caldus CGMCC 1742在含汞培养基中的生长应用，其特征在于，步骤(2)、(3)中所述的菌体静置培养时间是4d。
5.如权利要求2所述的A.caldus CGMCC 1742在含汞培养基中的生长应用，其特征在于，对培养液定时取样进行细胞总蛋白的定量及菌浓的测定，其时间间隔是1d。
6.如权利要求2所述的A.caldus CGMCC 1742在含汞培养基中的生长应用，其特征在于本实验所构建的喜温硫杆菌的抗汞基因工程菌对HgCl2的抗性比野生型的提高了一倍，且抗汞性能稳定。
7.如权利要求2所述的A.caldus MTH-04，分离自云南省腾冲地区热泉中，现保藏于微生物技术国家重点实验室菌种保藏室。
全文摘要
本发明公开了一株具有抗汞特性的喜温硫杆菌，该菌株于2006年6月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国科学院微生物研究所，中国北京)，其保藏编号为CGMCC 1742。本发明还公开了所述的喜温硫杆菌抗汞基因工程菌的制备及在含汞培养基中的生长应用，其制备方法包括(1)抗汞质粒载体的构建，(2)抗汞基因工程菌A.caldus CGMCC 1742的构建及鉴定，(3)A.caldus CGMCC 1742的种子培养，(4)A.caldus CGMCC 1742的扩大培养，(5)A.caldus CGMCC 1742在含汞培养基中的生长应用及抗汞性能的检测等步骤；该喜温硫杆菌的抗汞基因工程菌较野生型的喜温硫杆菌在抗汞特性方面有很大的提高，且抗汞性能稳定，在对含汞矿粉的生物浸出领域具有很大的应用前景。
文档编号C22B3/18GK101016521SQ200610070170
公开日2007年8月15日 申请日期2006年11月20日 优先权日2006年11月20日
发明者林建群, 陈丹丹, 林建强, 刘相梅, 颜望明 申请人:山东大学