细胞内汞离子检测与显像用二苯乙烯基双氰基苯双光子荧光探针的制作方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于精细化工领域中细胞内汞离子检测与显像用二苯乙烯基双氰基苯双 光子荧光探针。
【背景技术】：
[0002] 汞是一种对人体有害的高毒性重金属元素，又是一种在工业上有多种用途的重 要金属。不同形态（chemicalspecies)的萊对生物的毒性大小和作用机理差异很大。金属 汞有高的扩散性和脂溶性，由于汞的蒸气压很低，因此易通过呼吸作用进入生物体，并通 过血脑屏障（bloodbrainbarrier)进入脑组织，在脑组织中被氧化成萊离子。萊离子由于 较难通过血液屏障，被蓄积在脑组织中，从而引起中枢神经系统的严重损害；而且由于汞 与细胞膜结合后会抑制糖穿过细胞膜的主动输送，使钾对细胞膜的透性增加，造成对脑细 胞的糖分供应不足而导致脑细胞能量缺乏；可溶性的无机汞化合物也有较高毒性，它们通 过消化道进入人体后，容易在肾脏和肝脏中蓄积；烷基汞很容易溶于有机物中，特别易溶 于细胞膜或脑组织的类脂里，其碳-汞共价键不易破坏，对生物体造成极大危害。所以对 于汞离子的检测以及生物过程研究已经成为近年来的研究热点。与其他检测方法相比，荧 光检测具有灵敏度高、选择性好、响应迅速、检测快捷方便并可以进行实时区域离子检测等 优点，且双光子荧光探针使用800-1100nm的激光作为激发光源，可以避免单光子荧光探针 因使用350-560nm的激发光而导致的光致毒与光漂白。基于ICT原理的双光子荧光汞离子 探针络合汞离子后，双光子荧光强度降低，因此可以通过监测双光子荧光强度的变化来确 定汞离子含量的高低，此外，可以借助双光子荧光显微镜对活细胞或生物组织进行汞离子 生物成像，并对汞离子的生理作用与生物过程进行实时动态三维跟踪研究。
[0003]目前有效的汞离子选择性荧光探针较少，并且适于细胞内汞离子检测与成像的 双光子荧光探针更少。已报道的对汞离子有选择性的荧光探针主要分两大类：一是单 光子荧光汞离子探针；二是双光子荧光汞离子探针。单光子荧光汞离子探针是一种氮 硫杂冠酿或开链冠酿[(1)S. Yoon, E.W. Miller, Q. He, P.H. Do, C.J. Chang. A Bright and Specific Fluorescent Sensor for Mercury in Water，Cells，and Tissue. Angew. Chem. Int. Ed.，2007, 46, 6658-6661 ; (2) E. M. Nolan，S. J. Lippard. A "Turn-On" Fluorescent Sensor for the Selective Detection of Mercuric Ion in Aqueous Media. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 14270-14271 ； (3) A. B. Descalzo, R.Marlincz-M anc/,R. Radeglia, K. Rurack，Juan.Soto Coupling Selectivity with Sensitivity in an Integrated Chemosensor Framework:Design of a Hg2+-Responsive Probe,Operating above 500nm. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 3418-3419]，激发波长在350-560nm，不但易使生物本体产生自 发荧光干扰，而且短的激发波长还会对细胞产生光致毒，因此这种探针的应用受到了一定 的限制D
[0004] 双光子荧光汞离子探针是近年来发展的一类探针，这类探针具有近红外激 发、暗场成像、避免荧光漂白和光致毒、定靶激发、高横向分辨率与纵向分辨率、降低生 物组织吸光系数及降低组织自发荧光干扰等优点。代表性报道为氮硫杂冠醚或开链 冠醚双光子焚光萊离子探针[(1)F. Liu，C. Ding，M.Jin，Y. Tian. A highly selective two-photon fluorescent probe for the determination of mercury ions. Analyst, 2015, 140, 3285-3289 ； (2) C. S. Limj D. ff. Kang, Y. S. Tianj J. H. Han, H. L. Hwang, B. R. Cho.Detection of mercury in fish organs with a two-photon fluorescent probe. Chem. Commun. , 2010, 46, 2388-2390 ； (3) C. Huang, J. Fan, X. Peng, Z. Lin, B. Guo, A. Ren, J. Cuij S. Sun,Highly selective and sensitive twin - cyano - stilbene -based two - photon fluorescent probe for mercury(ii)in aqueous solution with large two - photon absorption cross - section, J. Photochem.Photobio. A: Chem.，2008, 199 (2 - 3) : 144 - 149]，文献（I)报道的探针不能用于细胞成像，文献（2)虽 说能实现成像，但检测灵敏度不是很理想，文献（3)正是专利申请人开发的同类探针，可惜 未曾用于细胞成像实验。
【发明内容】
[0005] 本发明改进现有的汞离子单、双光子荧光探针结构和性能上的不足，设计合成出 适用于活细胞内汞离子检测、性能优良的基于二苯乙烯基双氰基苯类荧光染料的探针分子 作为研究目标。
[0006] 本发明使用二苯乙烯基双氰基苯类荧光染料，用叔氮原子连接染料母体和识别受 体，使整个分子的吸收和发射红移，染料波长增长。
[0007] 本发明的细胞内汞离子检测用二苯乙烯基双氰基苯双光子荧光探针具有下列结 构通式（I):
[0008]
本发明代表性的化合物的合成方法，是让（E)-2, 5-二{4-[二（2-(2-羟基乙基硫 基）乙基）氨基]苯乙烯基}对苯二甲腈（II )，与2-巯基乙醇（III)反应，经过柱分离得 到探针纯品。在本说明书的实施例中更详细地说明了该探针的合成和分析检测方法。
[0010]
[0011] 本发明的二苯乙烯基双氰基苯双光子荧光探针使用方法没有特殊的限制。通常， 可以将探针分子溶解在生理盐水、缓冲液或由乙腈、丙酮、二甲基亚砜等水溶性有机溶剂， 然后加入含有细胞组织的适当缓冲液中进行测试。
[0012] 本发明的二苯乙烯基双氰基苯双光子荧光探针的具体特征如下：
[0013] 探针分子单光子与双光子激发分别在467nm与810nm，本身发射在588nm，并且化 学-光稳定性好；探针分子络合汞离子前荧光量子产率较高，络合汞离子后荧光量子产率 降低，可以对汞离子进行单、双光子荧光检测。探针分子对汞离子有很好的选择性，钠、钾、 钙、镁、锰等金属离子对检测没有干扰；探针分子对pH变化不敏感，在pH 4. 5 - 13的范围 内，PH变化对荧光发射没有影响；探针分子与汞离子之间的解离常数在微摩尔级范围内， 可以检测微摩尔浓度的细胞汞离子；探针分子细胞渗透性好，对细胞本身没有毒副作用，适 于细胞内汞离子浓度变化的检测。可共聚焦激光显微镜得到各类活细胞或组织内汞离子的 分布荧光图像或假彩比例荧光图像。
【附图说明】
[0014] 图1是本发明的荧光探针分子I对汞离子的紫外-可见光滴定。紫外-可见光滴 定中的荧光探针分子I的浓度为K) ~mol/L，箭头表示吸收强度与单光子发射强度随汞离 子浓度的增加而变化的趋势。横坐标为波长（nm)，纵坐标为荧光强度。
[0015] 图2是本发明的荧光探针分子I对汞离子的单光子荧光滴定。单光子荧光滴定中 的荧光探针分子I的浓度为I %nml/L，箭头表示吸收强度与单光子发射强度随汞离子浓度 的增加而变化的趋势。横坐标为波长（nm)，纵坐标为荧光强度。
[0016] 图3是本发明的荧光探针分子I对汞离子的双光子荧光滴定。双光子荧光滴定中 的荧光探针分子I的浓度为1矣mol/L，箭头表示双光子发射强度随汞离子浓度的增加而 变化的趋势。横坐标为波长（nm)，纵坐标为双光子焚光强度。
[0017] 图4是本发明的荧光探针分子I在不同介质中的双光子激发谱。从上至下三条 曲线分别表示荧光探针分子I在H 20、toluene和Hg2++H20中的双光子吸收截面随双光子 激发波长的变化关系。横坐标为波长（nm)，纵坐标为吸收截面（GM，1GM= IXlO5Ws photon lIiiolecule 3 〇
[0018] 图5是本发明的荧光探针分子I的双光子荧光滴定中的络合常数拟合曲线图。数 据点表示对应于不同汞离子浓度的相对双光子荧光强度，对这些数据点进行Sigmoidal拟 合得到一条曲线，所得拟合参数即为荧光探针分子I的络合常数，以Pk表示。横坐标为汞 离子浓度（mol/L)，纵坐标为相对双光子焚光强度。
[0019] 图6是本发明的荧光探针分子I对金属离子的单光子选择性示意图。横坐标表示 荧光强度百分淬灭率，纵坐标为不同的离子。
[0020] 图7是本发明的荧光探针分子I