6% (0.98g)， 熔点 163.5 ~165 cC。1H NMR(400MHz，CDCl3), S :7. 865 (s，2H)，4.614(s，4H)。MS, m/ Z= C10H6Br2N2(M+)的计算值（实测值）：311. 8898(311. 8898)。
[0043] (5)中间体7的合成
[0044] 2, 5-二溴甲基对苯二甲臆（314mg, 1.0 mmol)和亚磷酸三乙酯（500mg, 3. Ommol)加 热到165°C反应18h，减压除去过量的亚磷酸三乙酯，残余物用v(正己烷）：v(乙酸乙酯） =1:1重结晶，得白色晶体，产率65% (280mg)。
[0045] (6)中间体8的合成
[0046] 将N，N-二（2-氯乙基）苯甲醛（2) (1.25g，5. lmmol)置于25mL圆底单口烧瓶 中，再加入3mL THF和NaH(130mg，5. 4mmol)，抽真空充氩气保护，于冰水浴下边搅拌边滴 加1，4-二氰基-2,5-二（二乙基磷酰基甲基）苯（7)(1.078,2.5臟〇1)的1'册(91^)溶 液。滴加完后再于冰水浴下反应lh，撤去冰水浴于室温下反应12h。并于室温下继续 反应一夜。旋干，用CH 2Cl2 (4 X IOmL)洗提，CH2CV冼提液用H 20 (2 X IOmL)洗涤后加无 水Na2SO4干燥，过滤旋干并用硅胶柱层析[洗脱液：V (CH 2C12) : V (石油醚）=4:1]分 离，得黄色粉末，产率 65 % (0.995g)。= 1594 ~1348(C = C).HRMS(EI)m/z:610.1225(calcd for C32H30CI4N4AI(XWss)-1HMMR(DMS0-d6,400MHz) ppm: 8. 446 (s, 2H, Ph) , 7. 620 (d, 2H, J = 16. 4Hz, CH = CH), 7. 498 (d, 4H, J = 8. 4Hz, Ph), 7. 054 (d, 2H, J = 16. 4Hz, CH = CH), 6. 844 (d, 4H, J = 8. 8Hz, Ph), 3. 772 (t, 8H, J1 =J2= 4. 4Hz, NCH2), 3. 712 (t, 8H, J1= J2= 2Hz, CH2Cl). Elemental analysis: calculated for C32H30Cl4N4 (Mff 612. 42) C 62. 76, H 4. 94, Cl 23. 16, N 9.15 % ；Found C 62. 80, H, 4. 98, Cl 23. 13, N 9. 10% .
[0047] (6)探针I的合成
[0048] 在50mL圆底烧瓶中加入2, 5-二（4-[二（2-氯乙基）氨基]苯乙烯基）对苯 二甲腈（8)(612mg，lmmol)、疏基乙醇（195mg，2.5mmol)、无水碳酸钾（414mg，3mmol)和丙 酮（25mL)，氮气保护下搅拌回流反应24h (薄板跟踪）。反应完后，过滤脱除溶剂，残余物 用硅胶柱色谱[洗脱液：V(CH2Cl2) :V(aCet0ne) = 2:1]分离，所得粗品用甲醇重结晶，得 红棕色毛针状固体，产率 58 % (451mg)。11^(1^1)01^:3422(011),2922(01),2220((: E N) and 1631 ~1349(C = C).HRMS(EI)m/z:778.2715(calcd for (^^^0454:778.2715).? NMR(CHCl3-d, 400MHz) ppm: 8. 442 (s, 2H, Ph) , 7. 620 (d, 2H, J = 16. 0Hz, CH = CH), 7. 513(d, 4H, J = 8. 8Hz, Ph), 7. 055 (d, 2H, J = 16. 0Hz, CH = CH), 6. 789 (d, 4H, J =8. 4Hz, Ph) , 4. 918 (t, 8H, J = 4. 8Hz, 4 X OCH2) , 3. 633 (t, 8H, J1 = J 2 = 6. 0Hz, 4 X NCH2), 2. 791 (t, 8H, J1= 6. 8Hz, J2 = 7. 6Hz, 4 X SCH2), 2. 728 (t, 8H, J1= 6. 8Hz, J2 = 6.4Hz，4XSCH2)，2.564(s，4H，4X0H).13C NMR(CHCl3-d, 100MHz)ppm:147.68, 138.02, 134 .96, 129. 36, 128. 88, 123. 48, 117. 03, 116. 12, 113. 15, 111. 64, 61. 23, 50. 69, 34. 11, 28. 69. Elemental analysis:calculated for C40H50N4O4S4(Mff 779. 11)C 61. 66, H 6. 47, N 7.19,0 8. 21, S16. 46% ；Found C 61. 71, H 6. 54, N 7. 16, 0 8. 17, S 16. 42% .
[0049] 实施例2
[0050] 探针I对汞离子选择性：
[0051] 使用上述合成的化合物I评价对汞离子的选择性。将探针分子I (探针浓度为1 矣mol/L)分别加到不同金属离子（离子浓度为20mmol/L)的缓冲液中，未加金属离子的探 针分子溶液的单光子荧光强度与不同离子溶液的单光子荧光强度的差值对前者的比值即 为离子对探针分子荧光强度的百分淬灭率，作为判断探针分子对该离子的选择性。探针单、 双光子激发波长分别为467nm与810nm，发射波长为588nm，测试结果显示于图6中。从图 中可以看到，探针I对汞离子具有很高的选择性，汞离子的加入产生很大的荧光淬灭，另外 钠、钾、钙、镁、锰等金属离子对检测没有干扰。
[0052] 实施例3
[0053] 探针I对pH的不敏感性：
[0054] 使用上述合成的化合物I评价对pH的响应，将探针分子（探针浓度为I ~mol/L ) 分别加入离子离子浓度为:！与mol,/L 20mmol/L和0的水溶液中，调节pH 2. 0左右，测定荧 光强度后，加入碱液，缓慢增大PH，记录相应的荧光强度变化，以荧光强度变化对pH作图， 测试结果显示于图7中。从图中可以看出在pH 4. 5 -13的范围内，pH变化对荧光发射基 本没有影响。因此探针I可用于大PH范围内的细胞内汞离子的检测。
[0055] 实施例4
[0056] 细胞培养：
[0057] 成纤维细胞由DEME(Invitrogen)培养液培养，成像的前一天，细胞放于平底表面 皿中，成像时细胞放于含有5% 0)2和I 的探针I缓冲液于37°C、含5% CO2的细胞 培养箱中孵育〇. 5-1. 0小时，用中性缓冲溶液或培养液充分洗涤后（洗涤三遍以上），用双 光子荧光显微镜成像得到空白图像（图8a)。向上述含探针的细胞培养液中加入Hg(NO3)2 溶液（最终浓度为I :\:mo丨/L)在37°C、含5% CO2的细胞培养箱中孵化0?5小时，用培养 液冲洗三遍后，再进行双光子荧光显微成像得到细胞内汞离子的分布图像（图8b)。其中 图8a是在DC细胞培养基中加入〗:~mol/L的荧光探针分子I孵育1小时后（未加入汞离 子）；图8b是在DC细胞培养基中加入荧光探针分子I孵育0. 5小时后，继续加入1与mol/L Hg (NO3)2孵育0. 5小时。所用仪器是共聚焦双光子激光扫描显微镜，10倍目镜，型号：Zeiss 510LSM。
【主权项】
1. 一类细胞内汞离子检测与显像用二苯乙烯基双氰基苯双光子荧光探针，其特征在于 该双光子荧光探针具有下列结构通式I:2.按照权利要求1所述的细胞内汞离子检测与显像用二苯乙烯基双氰基苯双光子荧 光探针的用途，其特征在于将溶解于水中的这类探针加入到被测的含汞离子的细胞的培 养液中，使探针浓度在1~10m〇l/L，被测细胞与探针在10~40°C，和含1~10%C02的细 胞培养箱中孵育〇. 1-10. 〇小时，探针透过细胞膜，与细胞内汞离子络合发生荧光变化，用 不含探针和汞离子的水溶液或培养液充分洗涤后，细胞在双光子荧光显微镜下得到汞离 子分布的荧光图像，由此得到汞离子的存在、细胞内的区域分布和浓度信息。
【专利摘要】本发明涉及精细化工领域中一类细胞内汞离子检测与显像用二苯乙烯基双氰基苯双光子荧光探针，该探针通过2,5-二(4-[二(2-氯乙基)氨基]苯乙烯基)对苯二甲腈与巯基乙醇发生亲核取代反应而制备。810nm的激光激发可避免细胞的光致毒。在pH？4.5—13的范围内，探针对汞离子有很好的选择性，而钠、钾、钙、镁、锰等金属离子对检测没有干扰，可以检测微摩尔浓度的汞离子。探针分子络合汞离子后荧光强度下降，可以对汞离子含量进行双光子荧光检测。双光子荧光显微成像实验表明这类探针对成纤维细胞等细胞或组织渗透性好，本身对细胞没有毒副作用，特别适于细胞内汞离子浓度变化和汞离子分布的检测。
【IPC分类】C07C319/14, C07C323/25, G01N21/64, C09K11/06
【公开号】CN105085340
【申请号】CN201510547069
【发明人】黄池宝, 曾伯平, 刘其斌, 张道海
【申请人】遵义师范学院
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年8月31日