专利名称：筛查五彩苏类病毒属类病毒的芯片及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物信息学及生物检疫鉴定技术领域，尤其涉及筛查五彩苏类病毒属类病毒的芯片及其应用。
背景技术：
五彩苏类病毒属类病毒(Coleviroid)属于马铃薯纺锤形块茎类病毒科(Pospiviroidae),迄今为止发现并报道的五彩苏类病毒共有6种(Coleus bIumeiviroidl-6, CbVd-l CbVd-6)。五彩苏类病毒最先在巴西发现,后德国、加拿大、日本、印度、印度尼西亚和中国相继报道。五彩苏感染类病毒后会出现黄化或斑驳等症状，少数有矮化现象侵染。该属类病毒通过机械传播，也可以通过种子传播。随着国内外植物及其产品贸易 的增加，该属出现“新”类病毒的频率越来越高，这种“新”主要表现在属内可能的新种，如侯婉莹等2009年发现的两个锦紫苏类病毒新种(CbVd-5，CbVd-6);发现新的寄主及种内可能的变异；这3种情况都会导致该属内出现具有检疫风险性的新类病毒。对于这些潜在的新类病毒需要建立广谱性筛查技术，以便达到快速(一次反应可检测同一样品中该属的所有类病毒)、广谱(不会因为变异等出现漏检)的筛查。而现有的技术如生物学测定、正反向聚丙烯酰胺凝胶电泳及RT-PCR等通量低，一次只能检测样品中的一种类病毒；而且属于特异性检测，无法对变异大且变异位点多的类病毒进行检测。为了解决这些问题，国内外研究人员开展了广谱性高通量筛查技术的研究，结果表明从病原物较高的分类水平上进行筛查，可以有效提高新发病原微生物的筛查效果；同时该技术可以结合芯片的高通量特点，从而大大提高筛查的效率。如果采用这种筛查芯片技术在种子阶段进行类病毒检疫控制，利用得到健康植株再进行无性繁殖，就可为控制五彩苏类病毒的传播及生产无毒锦紫苏创造有利条件。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定五彩苏类病毒属类病毒的探针组。本发明提供的鉴定或辅助鉴定五彩苏类病毒属类病毒的探针组，由探针I-探针6共6条探针组成，所述探针I-探针6的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列1-6。上述探针中，所述五彩苏类病毒属类病毒为CbVd-1、CbVd-2、CbVd-3、CbVd_4、CbVd-5 或 CbVd-6。本发明的另一个目的是提供一种筛查五彩苏类病毒属类病毒的基因芯片。本发明提供的筛查五彩苏类病毒属类病毒的基因芯片，为将上述的探针固定在片基表面得到的基因芯片。在上述基因芯片中，所述片基为醛基化玻璃片基，在本发明的实施例中采用的是博奥生物有限公司晶芯 微阵列基片，产品目录号420022。在上述基因芯片中，所述五彩苏类病毒属类病毒为CbVd-1、CbVd-2、CbVd-3、CbVd-4、CbVd-5 或 CbVd-6。本发明的第三个目的是提供一种筛查五彩苏类病毒属类病毒的试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括上述的基因芯片。上述试剂盒还包括用于扩增所述五彩苏类病毒属类病毒的cDNA的引物对，所述引物对具体由序列表中序列7和序列表中序列8所示的DNA分子组成；所述五彩苏类病毒属类病毒为CbVd-1。 上述探针组、上述基因芯片或上述试剂盒在如下1)-4)中的应用，也是本发明保护的范围I)鉴定或辅助鉴定五彩苏类病毒属类病毒；2)制备鉴定或辅助鉴定五彩苏类病毒属类病毒产品；3)鉴定或辅助鉴定待测植物感染五彩苏类病毒属类病毒；4)制备鉴定或辅助鉴定待测植物感染五彩苏类病毒属类病毒产品。上述应用中，所述待测植物为锦紫苏；所述五彩苏类病毒属类病毒为CbVd-I。本发明的第四个目的是提供一种筛查或辅助筛查待测植物感染五彩苏类病毒属类病毒的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤I)将待测植物的组织的cDNA进行标记，得到标记后产物；2)将步骤I)得到的标记后产物与上述的基因芯片进行杂交，得到杂交后芯片；3)将步骤2)得到的杂交后芯片扫描，若所述基因芯片上的至少一条所述探针的信号绝对值不小于600且信噪比不小于3. 0，则待测植物感染或候选感染五彩苏类病毒属类病毒。上述方法中，步骤I)中，所述标记为以所述cDNA为模板，以上述的试剂盒中的所述引物对进行PCR扩增，得到PCR产物，再将所述PCR产物进行Klenow酶标记，得到标记后产物；步骤2)中，所述杂交的温度为42°C，所述杂交的时间为12h ；在所述步骤2)后和步骤3)前还包括将所述杂交后芯片进行洗涤的步骤；所述至少一条所述探针为上述探针组中的任意一条；所述组织为叶片；所述待测植物为锦紫苏；所述五彩苏类病毒属类病毒为CbVd-I。本发明的实验证明，本发明提供的筛查五彩苏类病毒属类病毒芯片中的探针具有五彩苏类病毒属类病毒属水平上的高兼容性和属内的特异性，所需的样品量少，一般仅需
0.lg。另外数据的分析与计算机图像处理软件相结合，达到分析结果能够直观化、可视化。本发明采用生物信息学方法对五彩苏类病毒属类病毒的核苷酸序列进行分析，设计了该属的兼容性探针，标准类病毒样品验证结果证明探针效果良好。本发明的五彩苏类病毒属类病毒芯片可用于五彩苏类病毒属类病毒的检疫鉴定。
图I为五彩苏类病毒属类病毒筛查芯片探针点阵示意图(10X12)图2为应用五彩苏类病毒I样品验证属筛查芯片的特异性
图3为应用五彩苏类病毒I样品验证属筛查芯片的灵敏度结果图4为PCR灵敏度检测结果
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、筛查五彩苏类病毒属类病毒的芯片的制备I、属级高兼容性寡核苷酸探针的设计从美国国立生物技术信息中心(NCBI)及国际病毒学分类委员会(ICTV)数据库下载类病毒属全基因组及核酸序列；去除90%以上长度与其它序列有95%相似度的核酸序列； 以5个碱基作为间隔，连续提取所有40mer的核酸序列；以40% ( GC含量< 60%、单个碱基含量< 50%、连续重复碱基数目< 4，且无大于6个碱基的发卡结构为标准对提取的核酸序列进行筛选，并在NCBI数据库中进行同源性比较以保证所获得探针的特异性。根据上述原则设计了五彩苏类病毒属类病毒的6条探针，其核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1-6所示。可以人工合成上述6条探针。2、芯片的制备将上述I得到的6条探针分别用点样缓冲液(博奥生物有限公司晶芯《芯片点样液，产品目录号440010)溶解，浓度为50 PM，每条探针横向重复3点点在醛基化玻璃片基芯片(博奥生物有限公司晶芯 微阵列基片，产品目录号420022)上，每点约0.25nL，点直径约180 u m,点间距为300 u m,点样均匀度的标准方差为15%。将芯片点有探针的一面在65°C水浴锅上水合IOs,芯片距水面距离为3cm,在空气中室温自然干燥,在进行一次水合。将点有探针的一面向上，放在紫外交联仪中250mJ交联。将芯片放在42°C预热，0. 5% SDS清洗lOmin。将芯片转移到42°C预热蒸馏水中清洗2min。把芯片放在50mL锥形离心管中，2000rpm离心lmin，以去除芯片表面的液体，获得筛查五彩苏类病毒属类病毒的芯片。筛查五彩苏类病毒属类病毒的芯片如图I所示，图I中1-6为五彩苏类病毒属类病毒筛查芯片探针1-6 (对应序列1-6)，Hex为芯片固定阳性质控，PC为杂交阳性质控，NC为杂交阴性质控。实施例2、筛查五彩苏类病毒属类病毒的芯片的应用一、筛查芯片检测样品I、用于检测的样品总RNA提取I)取感染五彩苏类病毒I的锦紫苏组织(五彩苏类病毒I拉丁名Coleusblumeiviroidl (简称CbVd-I),记载在中国锦紫苏类病毒的检测及其分子生物学特征研究.2006，植物病理学报36 (3) :266-231.，公众可从中国检验检疫科学研究院获得；锦紫苏记载在北京、天津地区锦紫苏类病毒疫情调查与检测，苏前富宋法瑞王红清李世访，《植物保护》2006年第6期，公众可从中国检验检疫科学研究院获得)0. Ig样品，用液氮研磨成粉末状，移入灭菌的I. 5mL离心管中，然后加入ImL的Trizol试剂，剧烈震荡摇匀；2) 4°C, 12000rpm离心lOmin，将上清液转入一新的I. 5mL离心管中；3)加 0. 5mL 氯仿,剧烈振荡 15s,室温放置 15min ；4°C, 12000rpm 离心 15min ；
4)将上层水相转移到新的I. 5mL离心管中，加等体积异丙醇，颠倒混匀，室温保持15min ；5)4°C，12000rpm离心IOmin ;倒掉上清液，加入75%的冷乙醇洗涤沉淀，然后4°C，12000rpm离心5min,弃乙醇；7)沉淀室温下充分干燥后，溶于40 L双蒸水(DEPC处理)中，_20°C保存备用，得到 RNA。2、样品标记与杂交将上述得到的RNA反转录得到cDNA。PCR扩增，即在0. 2mL的反应管中加入cDNA产物2 u L、上游引物0. 5 y L (终浓度为 0. 5mmol/L)、下游引物 0. L (终浓度为 0. 5mmoL/L)、dNTP Mix (10mmol/L) 0. 5 u L,Taq 酶(5U/ ii L) 0. 5 ii L、PCR 缓冲液(10 X ) 2 y L 及 DEPC-H2O 14 u L，然后按照 PCR 反应程
序进行扩增。上下游引物由用于扩增五彩苏类病毒I的引物组成，上游引物5’-同 GGATCCAGCGCTGCAACGGAATCCA-3 (序列 7)；下游引物5’ -,回 GGATCCGCCAGGGAACCCAGGTAAG-3，(序列 8 );上述引物中方框内碱基为保护碱基，斜体碱基为酶切位点BamH I碱基，下划线碱基为五彩苏类病毒序列其PCR 反应程序为94 0C 5min ；94 V 30s, 55 V 30s, 72 V 30s, 35 个循环；72 °C 7min。Klenow酶标记体系为25 y L，即在0. 2mL的PCR反应管中加入PCR产物5 y L，9N随机引物(invitrogen，Cat. No. 48190-011)( 100 y mol/L)2 y L 及 H2O 12y L，95°C变性 3min,冰浴5min。然后向反应管中加入IOXKlenow酶缓冲液2.5 iiL，dNTP (2. 5mmol/L) 2u L,cy3-dCTP 0. 5 u L (Amersham, Cat. No. PA 53021 终浓度为 5nmol/L), klenow 酶(5U/ u L)I U L0 37°C反应I. 5h，70°C变性5min，冰浴5min，得到标记样品。杂交体系为16iiL，包括 2. 4iiL SSC (终浓度 3X )、0. 32 ii LSDS (终浓度 0. 2% )、4u L 甲酰胺(终浓度 25%)、I. 6 ii LDenhardt ’ s (Ameresco, Cat. No. E717，终浓度 5X )和标记样品7. 68 u L0 95°C变性3min，冰浴5min，瞬时离心。将杂交液加到芯片上，盖玻片盖好，42°C水浴杂交过夜(12h)，分别得到杂交后的芯片(五彩苏类病毒I)。3、洗漆、扫描清洗体系及程序如下
权利要求
1.一种鉴定或辅助鉴定五彩苏类病毒属类病毒的探针组，由探针I-探针6共6条探针组成，所述探针I-探针6的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列1-6。
2.根据权利要求I所述的探针组，其特征在于所述五彩苏类病毒属类病毒为CbVd-I、CbVd-2、CbVd-3、CbVd-4、CbVd-5 或 CbVd-6。
3.—种筛查五彩苏类病毒属类病毒的基因芯片，为将权利要求I或2所述的探针组固定在片基表面得到的基因芯片。
4.根据权利要求3所述的基因芯片，其特征在于所述片基为醛基化玻璃片基；所述五彩苏类病毒属类病毒为 CbVd-1、CbVd-2、CbVd-3、CbVd-4、CbVd-5 或 CbVd-6。
5.一种筛查五彩苏类病毒属类病毒的试剂盒，包括权利要求3或4所述的基因芯片。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括用于扩增所述五彩苏类病毒属类病毒的cDNA的引物对，所述引物对具体由序列表中序列7和序列表中序列8所示的DNA分子组成； 所述五彩苏类病毒属类病毒为CbVd-I。
7.权利要求I或2所述探针组、权利要求3或4所述的基因芯片、权利要求5或6所述的试剂盒在如下I) -4)中的应用 1)鉴定或辅助鉴定五彩苏类病毒属类病毒； 2)制备鉴定或辅助鉴定五彩苏类病毒属类病毒产品； 3)鉴定或辅助鉴定待测植物感染五彩苏类病毒属类病毒； 4)制备鉴定或辅助鉴定待测植物感染五彩苏类病毒属类病毒产品。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述待测植物为锦紫苏；所述五彩苏类病毒属类病毒为CbVd-I。
9.一种筛查或辅助筛查待测植物感染五彩苏类病毒属类病毒的方法，包括如下步骤 1)将待测植物的组织的cDNA进行标记，得到标记后产物； 2)将步骤I)得到的标记后产物与权利要求3或4所述的基因芯片进行杂交，得到杂交后芯片； 3)将步骤2)得到的杂交后芯片扫描， 若所述基因芯片上的至少一条所述探针的信号绝对值不小于600且信噪比不小于3. 0，则待测植物感染或候选感染五彩苏类病毒属类病毒。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于 步骤I)中，所述标记为以所述cDNA为模板，以权利要求6所述的试剂盒中的所述引物对进行PCR扩增，得到PCR产物，再将所述PCR产物进行Klenow酶标记，得到标记后产物； 步骤2)中，所述杂交的温度为42°C，所述杂交的时间为12h ； 在所述步骤2)后和步骤3)前还包括将所述杂交后芯片进行洗涤的步骤； 所述至少一条所述探针为所述探针组中的任意一条； 所述组织为叶片；所述待测植物为锦紫苏； 所述五彩苏类病毒属类病毒为CbVd-I。
全文摘要
本发明公开了一种筛查五彩苏类病毒属类病毒的芯片及其应用。本发明提供了鉴定或辅助鉴定五彩苏类病毒属类病毒的探针，由6条探针组成，所述6条探针的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列1-6。还提供了筛查五彩苏类病毒属类病毒的基因芯片，为将上述的探针固定在片基表面得到的基因芯片。本发明的实验证明，本发明采用生物信息学方法对五彩苏类病毒属类病毒的核苷酸序列进行分析，设计了该组的兼容性探针，标准类病毒样品验证结果证明探针效果良好。本发明的筛查五彩苏类病毒属类病毒的芯片可用于五彩苏类病毒属类病毒的检疫鉴定。
文档编号C40B40/06GK102719563SQ20121019380
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月12日 优先权日2012年6月12日
发明者张永江, 朱水芳, 李世访, 李桂芬, 辛言言 申请人:中国检验检疫科学研究院